通过早期加压法制作雌核发育二倍体斑马鱼

大家好，我是来自俄勒冈大学神经科学研究所查尔斯·基梅尔（Charles Kimmel）实验室的查伦·沃克（Charlene Walker）。我是格雷戈里·沃尔什（Gregory Walsh），我在弗雷德·哈钦森癌症研究中心基础科学部塞西莉亚·莫恩斯（Cecilia Moens）实验室工作。

今天我们将向您展示一种通过早期加压法制备纯合二倍体斑马鱼的实验步骤。该方法利用静水压力使经紫外线照射的精子受精的卵细胞中的微管解聚。在适当的时间点进行操作，即可成功实现。

这可以阻止第二极体的排出，从而产生一个双倍体胚胎，其同源染色体为第一次减数分裂的两个产物。该技术于20世纪70年代初期由我在俄勒冈大学乔治·赖辛格实验室工作时建立。在我们的实验室中，我们将在两代四次遗传筛选中使用此方法。

可直接筛选F1诱变鱼的配子，以获得导致纯合雌核发育、遗传二倍体后代出现发育表型的隐性突变。由于斑马鱼具有较高的遗传干扰性，我们还利用该方法将突变定位到染色体上，并估算这些突变与着丝粒之间的距离。现在我们开始实验：在实验前一天的傍晚，准备精子采集工作，将用于挤卵的雄鱼和雌鱼分开饲养；由于雄鱼不会提供任何遗传物质，因此可使用较年长的雄鱼。

雌性个体腹部应显得较大且饱满，而雄性个体则应呈现黄色且体态敏捷。将雄性和雌性分别置于不同的暂养缸中过夜，以便第二天早晨能够方便地取用。实验当天早晨，配制Hank's溶液并加入碳酸氢钠。

用冰桶带到鱼类养殖设施。将汉克氏溶液加入三卡，并准备计时器和收集精子的试管。最后，进入鱼类设施后，用鱼用水稀释三卡。

这将在下一步中用于麻醉鱼类。开始收集精子时，准备一个装有冰上预冷的汉克氏溶液的透明小瓶。每只雄鱼约需50微升的冷汉克氏溶液，一次可麻醉一至两条雄鱼。

通过浸入和操作，可用塑料勺将它们从麻醉液中取出。用鱼水冲洗雄鱼，并用纸巾轻轻吸干表面水分。此步骤极为关键，因为水分会激活精子。

待其干燥后，在体视显微镜下以低倍率和落射照明将鱼固定于泡沫支架中。用镊子分开腹鳍，并将微细毛细管置于泄殖腔开口处，开始收集精子。当乳白色精子从生殖孔排出时，用平滑的磨口镊轻轻但有力地挤压鱼体两侧，同时通过轻微负压将精子吸入微细毛细管中，并将来自多尾雄鱼的精子收集于冰上。

冷的汉克斯平衡盐溶液。5到10只雄性的精子足以使20到30只雌性的卵子受精。精子保存在冷的汉克斯溶液中，可在数小时内持续高效地使卵子受精。

收集足够的精子，制成浑浊的悬液用于紫外线灭活。首先，在玻璃培养皿底部铺满冰，然后将表面皿放在培养皿内的冰上。

接下来，使用移液器将精子从试管转移至表面皿上。确保尽可能多地吸取精子，同时避免吸入空气气泡。关键是要避免产生气泡，将精子以均匀的薄层排出在表面皿上，然后丢弃移液器。

精子转移后，将培养皿放入紫外交联仪中。打开交联仪并设置能量，使其输出 900 JUULs。交联完成后，使用洁净的移液器将精子从表面皿中移除，转移至标记为 UV sperm 的微量离心管中，并置于冰上。

开始收集卵子时，需每次对两条雌鱼进行麻醉。在三卡溶液中，切勿将鱼放置过久，因为长时间麻醉可能导致鱼类死亡。接着，用鱼用水冲洗鱼体，并用纸巾轻轻吸干至微干状态。

这一点至关重要，因为多余的水分会使卵子膨胀，从而阻止受精。将雌性置于一个35毫米的塑料培养皿中，操作时手指需保持湿润但不潮湿。轻轻但有力地按压腹部。

如果她准备产卵，卵会很容易地产出，用刮铲收集卵后将雌鱼放回水中。优质的卵呈淡黄色、半透明状，而滞留在雌鱼体内过久的卵则呈白色且水样。为确保获得优质卵，在鱼房灯光开启后的前两小时内收集卵，并用覆盖物遮住卵以防止干燥。

收集卵子后，向卵子中加入 30 至 50 微升的紫外处理精子悬浮液，并用移液器吸头轻轻搅拌。立即加入约 1 毫升鱼水并启动计时器。此时让卵子继续发育将得到单倍体胚胎。

受精后必须在90秒内完成以下步骤。在加水激活卵子的同时启动计时器。

减数分裂第一次分裂中期的精确时间取决于温度。施加和解除压力的时间是针对28.5摄氏度进行优化的。启动计时器后，等待片刻，然后加入更多水，并轻轻晃动培养皿使卵子移至中央。

使用截断并抛光的巴斯德吸管，如有需要，将受精卵转移至加压小瓶中，向小瓶中加入更多卵水，直至几乎溢出，在小瓶的环状部位留有一圈水珠。接着，将橡胶塞盖在水珠形成的液环上，并将塑料盖固定在橡胶塞上方。

将小瓶倒置放入压力缸中，并加入更多的卵水。重新注满压力缸时，需将缸盖牢固地盖在缸体上。关闭后，将压力缸放入压力机中，确保柱塞朝上，并施加8,000磅每平方英寸的压力。

将圆筒留在压机中，直至激活后六分钟，总共施加压力4.5分钟。激活后六分钟，从压机中取出圆筒。从圆筒中取出小瓶，并小心擦干，以防止胚胎冷却。

重置移液管并用卵水重新填充。根据需要，将下一个样品瓶部分填充卵水以作准备。对所有批次的卵重复上述步骤。

圆柱形容器一次最多可容纳两个小瓶，因此您可以将卵子的受精时间推迟一到两分钟，以观察三卡瓶中其他雌鱼是否也会产卵。这样做可以一次性处理更多批次，从而提高效率。此外，若在使用挤压装置时对鱼类进行挤压，卵子可能会过于干燥，导致在受精24小时后无法正常发育；此时，单倍体斑马鱼胚胎将表现出短而粗壮的体形、短尾以及脑部结构不清晰的特征。

然而，它们都将具有相同的身体结构，如体节、脊索、眼睛和耳朵。作为二倍体、单倍体以及二倍体，所有这些胚胎在受精后约24小时均表现出不受限制的屈曲运动。受精后，EP二倍体同胞具有较长的尾部、形态清晰的大脑结构，存活率应约为60%至70%。

这些样本与未经处理的已部署对照组非常相似。通常一批单倍体胚胎会包含外观良好的胚胎、死亡的胚胎以及介于两者之间的各种状态。外观良好的胚胎与缺陷胚胎的比例反映了雌性基因组中所携带的有害基因情况。

尽管存在上述背景，突变体仍然相对容易鉴定，因为会出现多个个体（最多可达50%）表现出相同的特征性表型。重要的是要确保通过本方法产生的胚胎确实是真正的双单倍体（tic OIDs），作为对照，可将部分未经紫外线灭活的精子保留下来用于产生一窝正常发育的二倍体胚胎，同时将另一部分卵子用紫外线处理的精子受精但不进行电脉冲（EP）处理，以获得一窝单倍体胚胎作为对照；单倍体胚胎在两到三天后便无法存活。经过EP处理后正常发育的胚胎应表现为正常的二倍体形态。

尽管可能会出现一些不正常的EP嵌合体，但EP二倍体的孵化率通常应保持在70%至90%左右。若在EP处理的孵化组中出现单倍体，表明EP过程存在失败，例如压力装置未能维持足够压力。而在单倍体孵化组中出现二倍体，则提示精子失活不完全，例如交联剂处理失败。

我们刚刚向您展示了使用斑马鱼进行体外受精以及通过抑制第二次极体分裂来获得雌核发育二倍体斑马鱼胚胎的简便方法。在进行该操作时，必须注意早期加压的时间非常精确，并且在整个处理过程中，压力机需始终保持8,000磅每平方英寸的压力。请务必对您的压力机进行校准。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。