Name: 初压雌核发育二倍体的斑马鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 了解利用静水压处理阻断第二极体排出的方法，制备仅含母源遗传物质的斑马鱼雌核发育二倍体胚胎。该技术可产生纯合子个体，适用于发育生物学与遗传学研究。

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在20世纪70年代和80年代，查琳·沃克（Charline Walker）在俄勒冈大学乔治·施特赖辛格（George Streisinger）实验室建立了斑马鱼的体外受精和雌核发育二倍体方法。此处描述的方法与查琳的实验方案完全相同，其完整内容可参见《斑马鱼手册》3。斑马鱼的体外受精和雌核发育二倍体方法由查琳·沃克（Charline Walker）于20世纪70年代和80年代在俄勒冈大学乔治·施特赖辛格（George Streisinger）实验室开发。此处描述的方法与查琳的原始方案完全相同，其完整内容可参见《斑马鱼手册》3。

早期压力概述
注意：本实验方案中使用的多种试剂（如三卡因、鱼水和亨氏平衡盐溶液）的配制方法可在线获取，详见《斑马鱼手册》第10章3（<a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a>）
<ol>
<li>使用经紫外线灭活的精子通过体外受精产生胚胎。</li>
<li>立即将受精卵转移至装满卵水的玻璃小瓶（带塑料密封盖）中，液面应与瓶口齐平。用一片薄的乳胶橡胶覆盖瓶口，再将已打孔的瓶盖压紧在乳胶膜上，密封小瓶。</li>
<li>将小瓶放入液压机中，在受精后1.4分钟时将压力升至8,000 p.s.i.（注意：许多液压机的刻度显示的是作用于直径2英寸活塞上的压力，读数需换算为p.s.i.）</li>
<li>从受精后6分钟开始，在1分钟内逐步释放压力。</li>
</ol>
详细的早期加压操作步骤
<ol>
 <li>实验前一天
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>在傍晚时分，将用于挤精的雄鱼和雌鱼分开。由于雄鱼不提供遗传物质，因此可使用任何成年雄鱼。雌鱼腹部应显得饱满肥大，雄鱼则应呈现黄色且行动敏捷。</li>
 <li>将雌鱼和雄鱼分别在暂养缸中过夜，以便次日早晨方便取用。</li>
 </ol></li>
 <li>实验当天早晨
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>配制Hanks溶液；加入碳酸氢钠。</li>
 <li>准备实验所需物品并带至养鱼设施：冰桶、Hanks溶液、Tricaine、计时器、收集精子用的离心管。</li>
 <li>用鱼用养殖水稀释Tricaine。</li>
 </ol></li>
 <li>收集精子
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>在冰上准备一个装有Hanks溶液的透明小瓶。每条待挤精的雄鱼约需准备50 μl。</li>
 <li>每次将3至4条雄鱼浸入Tricaine中进行麻醉。可用塑料勺将其从麻醉液中捞出。</li>
 <li>用养殖水冲洗，并在纸巾上轻轻吸至“微湿但不滴水”状态（非常重要：水分会激活精子）。</li>
 <li>将鱼置于泡沫固定架中，在体视显微镜低倍镜下（使用落射照明）操作。用镊子分开骨盆鳍，并将微毛细管置于泄殖腔开口处。</li>
 <li>用光滑的（Millipore）镊子轻轻但有力地沿鱼体两侧摩擦挤压。</li>
 <li>当乳白色精液从生殖孔排出时，用微毛细管通过轻柔的负压将其吸入收集。</li>
 <li>将多条雄鱼的精子汇集于冰冻的Hanks盐溶液中。5–10条雄鱼的精子足以使数百枚卵子受精。在低温Hanks溶液中，精子可在数小时甚至数天内保持高效的受精能力。通过肉眼观察精子浓度，收集至形成浑浊悬液即可。</li>
 </ol></li>
 <li>紫外线灭活精子
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>在玻璃培养皿底部铺满冰块。</li>
 <li>将表面皿置于培养皿内的冰上。</li>
 <li>使用巴斯德移液管，将试管中的精子转移至表面皿上。确保尽可能多地将精子吸入移液管，避免吸入气泡。同时，在将精子从移液管排出至表面皿时，切勿产生气泡。将精子以薄而均匀的一层铺开于表面皿上。丢弃此移液管。</li>
 <li>将培养皿放入紫外线交联仪中。</li>
 <li>开启交联仪照射2分钟。</li>
 <li>使用一支洁净的移液管，将表面皿上的精子吸出，转移至标记为“UV Sperm”的离心管中，并立即置于冰上。</li>
 </ol></li>
 <li>卵子收集与体外受精
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>每次将3至4条雌鱼浸入Tricaine中进行麻醉。</li>
 <li>用养殖水冲洗，并在纸巾上轻轻吸至&quot;微湿但不滴水&quot;状态。过多水分会导致卵子膨胀，从而阻碍受精。</li>
 <li>将雌鱼置于35 mm塑料培养皿中，用微湿（非湿润）的手指轻轻但有力地按压其腹部。若雌鱼已准备产卵，卵子将很容易排出。</li>
 <li>用刮铲收集卵子，并将雌鱼放回水中。优质卵子呈淡黄色半透明状，而滞留在雌鱼体内过久的卵子则呈白色且水样（见下文）。为确保获得优质卵子，应在养鱼设施开灯后的前2小时内完成收集。收集后应覆盖卵子以防止干燥。</li>
 <li>向卵子中加入30–50 μl紫外线处理后的精子悬液，用移液枪头轻轻搅匀。</li>
 <li>立即加入约1 ml养殖水并启动计时器。此时开始发育的卵将形成单倍体胚胎。</li>
 </ol></li>
 <li>早期加压处理。注意：步骤a至g必须在受精后90秒内完成！
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>在加水激活卵子的瞬间启动计时器。</li>
 <li>等待片刻，补充更多水，轻轻旋转培养皿使卵子聚集于中央。</li>
 <li>使用切口并抛光过的巴斯德移液管，将已受精的卵子转移至加压管中。</li>
 <li>如有需要，向管中补充更多卵子养殖水，直至接近溢出，在管口形成一层水珠。</li>
 <li>在水珠上覆盖橡胶塞，再将塑料盖拧紧固定。</li>
 <li>将加压管倒置放入压力缸中，并补充卵子养殖水以填满压力缸。将缸盖牢固旋紧。</li>
 <li>将压力缸放入压力机中，确保柱塞处于上方位置，施加8,000 lbs/sq. in.的压力。</li>
 <li>保持压力缸在压力机中，直至受精后6分钟（即实际加压时间为4.5分钟）。</li>
 <li>在受精后6分钟，将压力缸从压力机中取出，并取出加压管。小心擦干管壁，防止胚胎降温。</li>
 <li>重置压力缸，并重新注入卵子养殖水。</li>
 <li>根据需要，向下一组加压管中部分注入卵子养殖水以作准备。</li>
 <li>对所有批次的卵子重复上述操作。</li>
 </ol></li>
</ol>
注意：该圆筒一次最多可容纳 3 支小瓶，因此可考虑将卵子的受精时间推迟几分钟，观察其他已置于三卡因中的雌鱼是否产卵。这样可在同一时间处理更多批次，提高效率。此外，一旦开始使用挤压器，切勿再将更多鱼类放入三卡因中，直至处理完成。鱼类在麻醉剂中停留过久可能导致死亡。其次，若在使用挤压器期间对鱼类进行挤压并获得卵子，这些卵子可能因等待时间过长而变得过于干燥，从而失去活力。

<ol><li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).</li>
<li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half-tetrad+analysis+in+zebrafish%3A+mapping+the+ros+mutation+and+the+centromere+of+linkage+group+I%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I.</a> Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).</li>
<li>Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pressure+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Early pressure screens.</a> Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).</li>
<li>Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-linkage+analysis+and+consolidation+of+the+zebrafish+genetic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map.</a> Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).</li>
<li>Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutants+with+disrupted+early+T-cell+and+thymus+development+identified+in+early+pressure+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen.</a> Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).</li>
</ol>

必须确保通过该方法产生的胚胎确实是真正的雌核发育二倍体。作为对照，应保留一部分未经紫外线灭活的精子，用于产生一窝正常的二倍体卵；同时保留一窝经紫外线灭活精子受精但未进行挤压处理（EP）的卵，以获得单倍体胚胎。受精后1天，单倍体胚胎表现为体轴较短，脑部和体节形态不规则。单倍体胚胎在2至3天后无法继续存活。挤压处理后的二倍体胚胎应与正常二倍体相似，尽管可能会出现一些形态异常的“EP畸形体”。经挤压处理的二倍体胚胎窝中应有大部分（70–90%）具有存活能力。若在挤压处理的二倍体窝中出现单倍体胚胎，提示挤压处理过程可能失败（例如压力装置未能维持压力）；若在单倍体对照窝中出现二倍体胚胎，则提示精子灭活不完全（例如交联仪操作失败）。
EP 二倍体已被用于确定基因与着丝粒之间的距离1，以定位正向遗传筛选中鉴定出的突变基因4,6。对 EP 二倍体胚胎进行正向筛选是鉴定参与早期及后期发育过程基因的有效方法，目前仍在广泛应用5,7。

<table><tbody><tr><td>三卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>表面皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>法国压菌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加压缸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 海水盐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td>剪去细端，火焰抛光</td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量毛细管</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过早期加压法制作雌核发育二倍体斑马鱼

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

二倍体真核生物中的杂合性常常使遗传学研究变得繁琐。能够直接从杂合雌性个体产生可存活的纯合二倍体后代的方法，使得在加速的正向遗传筛选中可直接对F1代诱变雌性个体进行有害突变的筛选。Streisinger 等人1,2描述了通过使用紫外线失活的精子激活斑马鱼卵，并利用物理处理（热或压力）抑制第二次减数分裂或第一次合子细胞分裂，从而制备雌核发育（纯合）二倍体斑马鱼的方法。其中，“早期压力”（EP）法可阻断受精后不久发生的减数分裂II。EP法能够产生较高比例的可存活胚胎，这些胚胎可发育为具有生育能力的雄性或雌性成鱼。该方法所获得的胚胎在所有基因位点上均为纯合，除非在减数分裂I期间因重组而与着丝粒分离的位点。在EP窝中，纯合突变的检出率在着丝粒附近位点约为50%，而在端粒附近位点则低于1%。本方法原文引自《斑马鱼手册》。3.

本方法通过使用经紫外线灭活的精子进行受精后立即阻断第二次减数分裂，从而产生雌核发育的二倍体斑马鱼胚胎（即胚胎的全部遗传物质仅来自母本）。由于第一次减数分裂过程中发生了重组，EP胚胎并非完全纯合，但在所有未因重组而与着丝粒分离的位点上均为纯合状态。

二倍体真核生物中的杂合性常常使遗传学研究变得繁琐。一些方法能够直接从……产生可存活的纯合二倍体后代。

大家好，我是来自俄勒冈大学神经科学研究所查尔斯·基梅尔（Charles Kimmel）实验室的查伦·沃克（Charlene Walker）。我是格雷戈里·沃尔什（Gregory Walsh），我在弗雷德·哈钦森癌症研究中心基础科学部塞西莉亚·莫恩斯（Cecilia Moens）实验室工作。今天我们将向您展示一种通过早期加压法制备纯合二倍体斑马鱼的实验步骤。该方法利用静水压力使经紫外线照射的精子受精的卵细胞中的微管解聚。在适当的时间点进行操作，即可成功实现。这可以阻止第二极体的排出，从而产生一个双倍体胚胎，其同源染色体为第一次减数分裂的两个产物。该技术于20世纪70年代初期由我在俄勒冈大学乔治·赖辛格实验室工作时建立。在我们的实验室中，我们将在两代四次遗传筛选中使用此方法。可直接筛选F1诱变鱼的配子，以获得导致纯合雌核发育、遗传二倍体后代出现发育表型的隐性突变。由于斑马鱼具有较高的遗传干扰性，我们还利用该方法将突变定位到染色体上，并估算这些突变与着丝粒之间的距离。现在我们开始实验：在实验前一天的傍晚，准备精子采集工作，将用于挤卵的雄鱼和雌鱼分开饲养；由于雄鱼不会提供任何遗传物质，因此可使用较年长的雄鱼。雌性个体腹部应显得较大且饱满，而雄性个体则应呈现黄色且体态敏捷。将雄性和雌性分别置于不同的暂养缸中过夜，以便第二天早晨能够方便地取用。实验当天早晨，配制Hank's溶液并加入碳酸氢钠。用冰桶带到鱼类养殖设施。将汉克氏溶液加入三卡，并准备计时器和收集精子的试管。最后，进入鱼类设施后，用鱼用水稀释三卡。这将在下一步中用于麻醉鱼类。开始收集精子时，准备一个装有冰上预冷的汉克氏溶液的透明小瓶。每只雄鱼约需50微升的冷汉克氏溶液，一次可麻醉一至两条雄鱼。通过浸入和操作，可用塑料勺将它们从麻醉液中取出。用鱼水冲洗雄鱼，并用纸巾轻轻吸干表面水分。此步骤极为关键，因为水分会激活精子。待其干燥后，在体视显微镜下以低倍率和落射照明将鱼固定于泡沫支架中。用镊子分开腹鳍，并将微细毛细管置于泄殖腔开口处，开始收集精子。当乳白色精子从生殖孔排出时，用平滑的磨口镊轻轻但有力地挤压鱼体两侧，同时通过轻微负压将精子吸入微细毛细管中，并将来自多尾雄鱼的精子收集于冰上。冷的汉克斯平衡盐溶液。5到10只雄性的精子足以使20到30只雌性的卵子受精。精子保存在冷的汉克斯溶液中，可在数小时内持续高效地使卵子受精。收集足够的精子，制成浑浊的悬液用于紫外线灭活。首先，在玻璃培养皿底部铺满冰，然后将表面皿放在培养皿内的冰上。接下来，使用移液器将精子从试管转移至表面皿上。确保尽可能多地吸取精子，同时避免吸入空气气泡。关键是要避免产生气泡，将精子以均匀的薄层排出在表面皿上，然后丢弃移液器。精子转移后，将培养皿放入紫外交联仪中。打开交联仪并设置能量，使其输出 900 JUULs。交联完成后，使用洁净的移液器将精子从表面皿中移除，转移至标记为 UV sperm 的微量离心管中，并置于冰上。开始收集卵子时，需每次对两条雌鱼进行麻醉。在三卡溶液中，切勿将鱼放置过久，因为长时间麻醉可能导致鱼类死亡。接着，用鱼用水冲洗鱼体，并用纸巾轻轻吸干至微干状态。这一点至关重要，因为多余的水分会使卵子膨胀，从而阻止受精。将雌性置于一个35毫米的塑料培养皿中，操作时手指需保持湿润但不潮湿。轻轻但有力地按压腹部。如果她准备产卵，卵会很容易地产出，用刮铲收集卵后将雌鱼放回水中。优质的卵呈淡黄色、半透明状，而滞留在雌鱼体内过久的卵则呈白色且水样。为确保获得优质卵，在鱼房灯光开启后的前两小时内收集卵，并用覆盖物遮住卵以防止干燥。收集卵子后，向卵子中加入 30 至 50 微升的紫外处理精子悬浮液，并用移液器吸头轻轻搅拌。立即加入约 1 毫升鱼水并启动计时器。此时让卵子继续发育将得到单倍体胚胎。受精后必须在90秒内完成以下步骤。在加水激活卵子的同时启动计时器。减数分裂第一次分裂中期的精确时间取决于温度。施加和解除压力的时间是针对28.5摄氏度进行优化的。启动计时器后，等待片刻，然后加入更多水，并轻轻晃动培养皿使卵子移至中央。使用截断并抛光的巴斯德吸管，如有需要，将受精卵转移至加压小瓶中，向小瓶中加入更多卵水，直至几乎溢出，在小瓶的环状部位留有一圈水珠。接着，将橡胶塞盖在水珠形成的液环上，并将塑料盖固定在橡胶塞上方。将小瓶倒置放入压力缸中，并加入更多的卵水。重新注满压力缸时，需将缸盖牢固地盖在缸体上。关闭后，将压力缸放入压力机中，确保柱塞朝上，并施加8,000磅每平方英寸的压力。将圆筒留在压机中，直至激活后六分钟，总共施加压力4.5分钟。激活后六分钟，从压机中取出圆筒。从圆筒中取出小瓶，并小心擦干，以防止胚胎冷却。重置移液管并用卵水重新填充。根据需要，将下一个样品瓶部分填充卵水以作准备。对所有批次的卵重复上述步骤。圆柱形容器一次最多可容纳两个小瓶，因此您可以将卵子的受精时间推迟一到两分钟，以观察三卡瓶中其他雌鱼是否也会产卵。这样做可以一次性处理更多批次，从而提高效率。此外，若在使用挤压装置时对鱼类进行挤压，卵子可能会过于干燥，导致在受精24小时后无法正常发育；此时，单倍体斑马鱼胚胎将表现出短而粗壮的体形、短尾以及脑部结构不清晰的特征。然而，它们都将具有相同的身体结构，如体节、脊索、眼睛和耳朵。作为二倍体、单倍体以及二倍体，所有这些胚胎在受精后约24小时均表现出不受限制的屈曲运动。受精后，EP二倍体同胞具有较长的尾部、形态清晰的大脑结构，存活率应约为60%至70%。这些样本与未经处理的已部署对照组非常相似。通常一批单倍体胚胎会包含外观良好的胚胎、死亡的胚胎以及介于两者之间的各种状态。外观良好的胚胎与缺陷胚胎的比例反映了雌性基因组中所携带的有害基因情况。尽管存在上述背景，突变体仍然相对容易鉴定，因为会出现多个个体（最多可达50%）表现出相同的特征性表型。重要的是要确保通过本方法产生的胚胎确实是真正的双单倍体（tic OIDs），作为对照，可将部分未经紫外线灭活的精子保留下来用于产生一窝正常发育的二倍体胚胎，同时将另一部分卵子用紫外线处理的精子受精但不进行电脉冲（EP）处理，以获得一窝单倍体胚胎作为对照；单倍体胚胎在两到三天后便无法存活。经过EP处理后正常发育的胚胎应表现为正常的二倍体形态。尽管可能会出现一些不正常的EP嵌合体，但EP二倍体的孵化率通常应保持在70%至90%左右。若在EP处理的孵化组中出现单倍体，表明EP过程存在失败，例如压力装置未能维持足够压力。而在单倍体孵化组中出现二倍体，则提示精子失活不完全，例如交联剂处理失败。我们刚刚向您展示了使用斑马鱼进行体外受精以及通过抑制第二次极体分裂来获得雌核发育二倍体斑马鱼胚胎的简便方法。在进行该操作时，必须注意早期加压的时间非常精确，并且在整个处理过程中，压力机需始终保持8,000磅每平方英寸的压力。请务必对您的压力机进行校准。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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