在 Drosophila 中观察跳动的心脏

本文将介绍两种用于观察果蝇跳动心脏并进行成虫心脏解剖的可视化技术。首先，沿所示切线一次性切除头部和胸部。接着，去除生殖器，并用镊子打开腹部体腔，移除肠道，若为雌性果蝇，还需移除卵巢。

小心吸除腹部第三和第四节段的脂肪体，以暴露成体心脏，便于固定幼虫心脏。将单个幼虫置于缓冲液中，首先在幼虫头部区域周围使用组织丙烯酸胶进行固定。轻轻拉伸幼虫，并在尾部末端以及幼虫体壁两侧继续施加更多胶水。

大家好，我是GI Fler。大家好，我是Karen er。我们两人都是巴纳姆医学研究所发育与衰老项目组的成员。

今天，我们将向您展示我们开发的用于观察幼虫和成年果蝇心脏跳动的实验方法。我们利用这两种制备方式来观察、检测和量化果蝇（Drosophila）的心跳参数。在开始之前，我们首先配制人工血淋巴溶液。

该溶液含有蔗糖组分，即helo，需在使用前从冷藏的储备液中取出并加入人工血淋巴液中。为防止细菌污染，将人工血淋巴液恢复至室温，并通过通气至少15分钟进行氧合。接下来，使用标准的拉管仪制备数根细毛细管，用于后续果蝇脂肪体的移除。

所有准备工作完成后，必须对成年果蝇进行麻醉。可使用果蝇麻醉剂短暂暴露 2 到 5 分钟来实现，但注意不要让果蝇在麻醉剂中停留超过 5 分钟。短期低温处理也可用于麻醉果蝇，但不建议使用二氧化碳，因为它对心率具有更持久的影响。

接下来，将麻醉后的果蝇背面向下放置于涂有一层薄薄凡士林的培养皿中。果蝇翅膀和身体的疏水性表皮应可逆地黏附在凡士林上，但如有需要，果蝇仍可重新调整位置。使用弧形弹簧剪进行初步切割。

通过将剪刀刀片置于果蝇的足部下方，并朝向颈部附近的背侧表面倾斜，进行操作。一次剪切即可去除头部腹神经索和足部。随后，使用弹簧剪将制备好的样品浸入充氧的人工血淋巴溶液中。

用单次切割移除由第七和第八腹节组成的腹部后端。这一步骤可暴露腹部两侧边缘，以便进行侧向切割，同时切断后肠与腹部体壁之间的连接。将剪刀刀片插入腹部末端的小开口中，沿体壁横向剪开。

这可以松开腹侧角质层的一条边缘。用镊子夹住该瓣膜，沿腹部另一侧边缘进行类似的切割。现在即可移除松脱的腹侧腹部角质层瓣膜。

通常可使用钟表镊轻轻牵拉，将肠道及其他腹部器官作为整体取出。移除内脏后，可暴露出仍在跳动的心管，心管通过微小的动脉肌与背侧角质层相连，并被脂肪体包围。牵出的毛细血管插入塑料管中，该塑料管为1/16英寸管径，连接至真空源。

吸力与吸头直径成正比，因此一旦安装后，不应使用吸头直径大于40微米的移液器。该吸液系统用于吸除心脏管周围多余的脂肪组织，也可用于去除在角质层周围积聚的气泡及任何碎屑。

必须格外小心，避免触碰心脏本身；由于心脏后部非常脆弱，应完全避开该区域。成年黑腹果蝇的心管现已暴露，必要时应可见搏动。可通过轻轻提起位于石蜡油中的体壁，并小心地将其重新压平，来调整体壁及附着心脏的位置。

避免与心脏组织发生任何接触。此时，应将浸泡标本的溶液更换为新鲜的人工血淋巴液。在进行任何操作之前，应让标本在充氧条件下平衡 20 至 30 分钟。

如果制备物需要维持超过60分钟，应使用新鲜的人工血淋巴重新灌注。该制备物现已可用于光学记录，也可用于电生理记录或组织学操作。观察幼虫体内跳动的心脏需要采用不同的技术。

首先，在实验前一天准备盖玻片。用牙签将约 50 至 70 微升 Sard 溶液转移至 22 × 22 毫米的盖玻片上。在 65 °C 下使 Sylguard 固化过夜。

接下来，配制 Brody 和 Bates 缓冲液，配制完成后可分装保存于 -20 摄氏度，使用时取出融化。最后，准备用于涂抹组织胶所需的工具。首先，拉制数根细毛细管。

接下来，将一个1.5毫升的移液器吸头与一段直径约为1/32英寸的小段塑料管连接。将塑料管的一端插入移液器吸头较小的一端，另一端连接毛细管的宽口端。组装完成后，通过将毛细管插入一滴组织胶中，并利用塑料吸头轻轻抽吸，使组织胶进入毛细管内。

使用胶水时，应另备一根玻璃毛细管，用于清除胶水毛细管尖端多余的胶水。胶水在接触缓冲盐溶液之前保持液态，一旦接触缓冲盐溶液，几秒钟内便会硬化。然而，胶水通常保持可塑状态的时间足够长，可以在其仍附着于胶水毛细管尖端时将其移除，或在将其施加到样本过程中进行调整。

现在开始固定幼虫，将组织丙烯酸胶滴在硅胶护罩的每个角落附近。在盖玻片上向胶滴中加入50微升B和B缓冲液，缓冲液会立即硬化，用B和B填充胶点之间的空间。胶水将使缓冲液保留在载玻片上。

取三只游走期三龄幼虫，置于冰上浸湿的滤纸片上两分钟，以减缓其活动。随后，将幼虫转移至缓冲液中，并使其背面向上定位。

这是幼虫没有相同环带的一侧。在头部区域与窗台挡板之间迅速涂抹一些胶水。胶水会很快固化，从而防止幼虫头部移动。

使用镊子小心地夹住动物的后部刚毛，并轻轻将其拉伸。通过在幼虫后半部分的两侧涂抹胶水，将幼虫固定在此位置。为减少体壁肌肉引起的表皮进一步移动，可在动物体侧追加更多胶水。

幼虫现已固定在此位置。可将盖玻片放入盛有人工血淋巴或PBS的小型培养皿中，此时即可记录心跳，且不受体壁运动的干扰。半完整成年黑腹果蝇心脏在解剖后若维持在新鲜的含氧人工血淋巴中，可持续有节律地搏动数小时。

此处展示了一个代表性示例以及补充视频一中的三星级幼虫心脏，如图所示，羽化后一至三周的年轻果蝇通常表现出规律的心跳，频率介于每秒一至三赫兹之间。一般而言，超过三周龄的果蝇心跳节律性较差。尽管如此，这些心脏仍能在含氧的人工血淋巴中持续自发搏动数小时。由于解剖操作导致损伤的成年果蝇心脏，通常会出现局部极度收缩的区域，这些区域无法正常舒张，且常常不受控制。在三周龄以下的果蝇中，极少观察到心跳频率低于每秒一赫兹的情况。

因此，此类制备样品被视为受损而予以弃用。我们刚刚演示了如何制备用于光学成像的水平化成年果蝇心脏。请记住，在制作半完整制备样品时，切勿触碰心脏本身。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。