含量为病原体相关分子模式（PAMP）触发免疫功能的植物（公共交通交汇处）
2009年9月9日
一个细胞死亡为基础的公共交通交汇处的检测在烟草benthamiana植物描述。
大家好，我是来自 Voice Thompson 植物研究所 Greg Martin 实验室的 Suma TI。今天，我们将向您展示一种基于 PAM 触发免疫或 PTI 的基于细胞死亡的测定程序。我们在实验室中使用该程序来寻找基因在 PTI 中的参与。
那么让我们开始吧。通过种植 Nicotiana ANA 开始该程序，直到它们大约七周大。开始前 4 到 5 天。
PAM 触发免疫或 PTI 检测。修剪植物以去除所有腋生枝条和花朵。尝试在腋枝出现后立即去除它们，以使植物更易于管理。
准备好后，植物继续培养细菌。该程序使用非致病性细菌诱导植物免疫，然后第二次接种攻击细菌，启动测定中使用的所有细菌的生长。同时，对每个假单胞菌菌柄使用假单胞菌的冷冻甘油茎。
将少量细菌散布在含有适当抗生素的 A KBM 板的中心，并在 30 摄氏度下孵育板约 18 至 24 小时。对于农杆菌，使用预先准备好的新鲜板开始 2 毫升 lb 的液体培养。在 30 摄氏度下生长过夜，第二天摇晃。
将 150 至 200 微升液体 KBM 添加到假单胞菌的板中。将细菌散布在整个板中。使用无菌紧固器。
将板放回培养箱中再放置 20 到 24 小时。四种农杆菌。在含有 20 微摩尔丙酮的约 5 至 10 毫升 LB 中开始二次培养。
在 30 摄氏度下摇动培养培养物过夜。准备好细菌后，在进行 PTI 测定的前一天继续准备用于测定的植物。准备好细菌后，将植物移至 22 至 24 摄氏度的房间中，相对湿度约为 35% 至 40%，光线恒定。
接下来，用黑色粗记号笔在叶子上画圆圈。选择扩张良好的叶子，避免使用较老的叶子或摸起来坚硬或厚实的叶子。避免在叶子的下部做标记。
圆圈的直径至少为 1.5 厘米，每片叶子可以标记 2 到 4 个圆圈。圆圈应间隔良好，最好不要穿过大静脉。通过收集用于诱导 PTI 的细菌来开始 PTI 测定。
使用的假单胞菌物种应该已经形成细菌草坪，表明生长良好。用无菌长木棍刮掉，从盘子中收获它们，然后重悬于约 20 至 25 毫升的 10 毫摩尔中。用于农杆菌离心机的氯化镁溶液。
用于收集细胞和复苏的培养物悬浮在约 20 至 25 毫升的 10 毫摩尔氯化镁加 10 毫摩尔的氯化物中。MES pH 值为 5.6，重复离心，然后再次复苏 悬浮于约 20 至 25 毫升氯化镁加 MES 溶液中。现在诱导性假单胞菌和农杆菌细菌被重新悬浮。
在 600 纳米的波长下测量所有三种培养物的光密度。通过用氯化镁稀释假单胞菌和 MES 加氯化镁稀释农杆菌来调整 ODS。最终所需的 OD 值可在随附的书面协议中找到。
总体积为 25 毫升的细菌培养物足以接种约 40 至 50 个点。现在通过使用不带针头的 1 毫升注射器将 PTI 诱导剂渗透到叶子上预先标记的圆圈中来开始测定。写下植物被浸润的顺序以及诱导后开始浸润的确切时间。
诱导接种后数小时进行激发接种。收获激发接种所需的细菌菌株，如前所述，用于诱导性假单胞菌菌株。同样，测量 OD 并根据随附的 GR 方案调整培养物的浓度。
诱导剂浸润后 7 小时开始激发接种。使用以下诱导轮挑战者组合。选择第一个孕育圈外围的一点作为第二个孕育圈的中心。
按照与诱导相同的植物顺序进行激发试验浸润。如果一个叶子上有多个点，请确保渗透不重叠。最后，在含有适当抗生素的 KBM 或 LB 平板上对测定中使用的所有培养物进行平板连续稀释。
激发接种后 2 天，可以在诱导后 2 天开始评估 PTI 反应，激发接种在被 PST DC 3000 攻击的斑点中寻找由于效应子触发的免疫或 ETI 而导致的细胞死亡的出现浸润重叠区域内的细胞死亡表明 PTI 的崩溃，应在诱导和激发后 4 至 5 天评分为阳性表型接种寻找因疾病而出现的细胞死亡，这些斑点被 DC 3000 hop Q1 突变体或 PS 再次压回高位。寻找 PTI 的分解，这由浸润重叠区域疾病引起的细胞死亡指示。继续观察植物，直到那些未因 PTI 而受到损害的植物开始在重叠的浸润区域显示细胞死亡。
在 PFDC 组合接种后 2 天，因 FLS 2 沉默的植物因 PTI 而受到损害。在重叠区域看到细胞死亡，表明 PTI 对照植物的分解尚未因任何基因而沉默。还接种了 PFDC 组合，并在进行测定后两天进行了检查，由于正常的 PTI 反应，在重叠区域外部可见由于激发引起的细胞死亡，但在重叠区域内部看不到。
我们刚刚向您展示了如何在执行此程序时对 pant 触发的免疫或 PTI 进行基于细胞死亡的检测。重要的是要记住将植物保持在我们推荐的环境条件下。较高的湿度会对植物产生负面影响，并使检测进行得更快。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文描述了一种基于细胞死亡的分析方法，用于评估Nicotiana benthamiana植物中的PAM触发免疫（PTI）。该程序涉及植物和细菌的准备，然后进行一系列接种以评估PTI反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物免疫学
- 细胞死亡分析
- 病原体-植物相互作用
背景
- PAM触发免疫（PTI）是植物的一种关键防御机制。
- Nicotiana benthamiana常用于研究植物免疫。
- 了解PTI可以帮助开发抗病植物品种。
- 细胞死亡分析对于评估免疫反应至关重要。
研究目的
- 展示评估Nicotiana benthamiana中PTI的方法。
- 研究特定基因在PTI反应中的作用。
- 为植物免疫学研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 通过修剪和标记叶子来准备Nicotiana benthamiana植物。
- 培养非致病性细菌以诱导PTI。
- 将细菌培养物渗入预先标记的叶片区域。
- 评估挑战接种后的细胞死亡反应。
主要结果
- 通过细胞死亡分析观察到PTI的成功诱导。
- 重叠区域的细胞死亡表明PTI的破坏。
- 对照植物在重叠区域没有细胞死亡，表现出正常的PTI反应。
- 特定基因沉默的植物显示PTI反应受损。
结论
- 描述的分析方法有效地评估了Nicotiana benthamiana中的PTI。
- 了解PTI机制可以为植物育种策略提供信息。
- 这种方法可以适用于植物免疫学的各种研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables mechanistic de-risking of plant immune pathways by quantitatively linking PAMP recognition to downstream defense outputs. It supports target validation in agrochemical discovery by providing a reproducible readout for compounds that modulate PTI. The method enhances predictive confidence in early-stage screening for molecules that enhance or suppress plant immunity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the FLS2-flg22 signaling axis to validate pattern recognition receptors as therapeutic targets.
- Operational Value: Uses a cell death phenotype to functionally confirm PTI competence or breakdown in genetic or chemical perturbation models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved outputs (overlapping vs. non-overlapping cell death) to distinguish PTI efficacy from ETI or disease susceptibility.
- Operational Value: Standardized in Nicotiana benthamiana, a scalable transient expression system amenable to high-throughput agroinfiltration workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular initiation (PAMP-PRR binding) to organismal outcomes (cell death containment), enabling pathway continuity assessment.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between molecular biologists and plant pathologists via a shared phenotypic endpoint.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement (PAMP-PRR binding) to functional validation (immune output) and phenotypic screening (compound library screening for immunomodulators).
- Discovery Biology: Tests whether a gene, protein, or small molecule modulates the earliest detectable output of PRR signaling.
- Screening: Delivers a binary, imaging-compatible readout (cell death presence/absence in overlap zone) amenable to automated scoring.
- Analytics: Enables comparison of PTI strength across genotypes or treatments via spatial quantification of defense responses.
- Translational Research: Bridges lab-based immune assays to field-relevant outcomes by modeling how early signaling affects disease resistance.
- Enterprise Reuse: Establishes a plug-and-play platform for testing diverse PAMPs, effectors, or microbial strains in a common phenotypic format.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor activation to a defined immunological consequence.
- Operational Value: Requires only basic infiltration and microscopy equipment, enabling broad adoption across discovery and translational teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in agrochemical lead optimization by predicting field-relevant immune priming capacity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on mechanistic fidelity to native PTI.
Implementation Considerations
- Expertise in plant growth, bacterial culture, and leaf infiltration techniques.
- Access to controlled-environment growth chambers with precise humidity and lighting.
- Standardized bacterial strains and optical density adjustment protocols for reproducible PAMP delivery.
- Adaptation considerations for different plant species or PAMP-effectors beyond flg22-FLS2.
- Practical limitation: Assay sensitivity to environmental variables necessitates strict growth condition controls.
