Name: 含量为病原体相关分子模式（PAMP）触发免疫功能的植物（公共交通交汇处） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 了解基于细胞死亡的PAMP触发免疫检测方法，用于评估本氏烟草中的PTI反应。该方法通过细菌接种和细胞死亡观察，帮助研究人员研究植物免疫基因功能并开发抗病品种。

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感谢康奈尔大学植物病理学与植物-微生物生物学系的 Hye-Sook Oh、Joanne Morello 和 Alan Collmer 提供的宝贵讨论。感谢 Jesse Munkvold 对本文的评论。本研究由美国国家科学基金会植物基因组计划资助，资助编号 DBI-0605059（GBM）。

第一部分：植物生长与养护
用于检测的Nicotiana benthamiana植株应约为7周大。在检测前至少4-5天应对植株进行修剪，去除所有腋生分枝和花朵。在腋生分枝刚长出时即予以去除，有助于更好地管理植株。
第2部分：细菌培养
第1天：
<ol>
<li>启动实验所用所有菌株的平板或培养物，需同时进行。对于包含2种诱导菌和3种挑战菌的Pseudomonas spp.，从冻存的甘油菌种中挑取少量细菌，在含有适当抗生素的KBM平板上划线（见表2），并将少量菌液涂布于平板中央。将平板在30°C下培养约18–24小时。对于Agrobacterium，从新鲜平板上接种2 ml LB液体培养基，于30°C、250 r.p.m.条件下过夜培养。</li>
</ol>
第2天：
<ol start="2">
<li>对于假单胞菌（Pseudomonas），加入150–200 μl液体KBM至细菌中，使用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布于整个平板表面。将平板放回培养箱中，继续培养20–24小时。次日平板上应形成均匀的细菌菌苔，表明菌体生长良好。对于农杆菌（Agrobacterium），在约5–10 ml LB培养基中加入20 μM乙酰丁香酮，启动二次培养，并在250 r.p.m.、30°C条件下过夜培养约20小时。</li>
</ol>
第3部分：为检测准备植物
第2天：
<ol>
<li>实验前一天，应将植物转移至温度为 22-24°C、相对湿度约 35-40%、持续光照的房间。</li>
<li>使用粗头黑色记号笔在直径至少为 1.5 cm 的叶片上标记圆形区域，每片叶可标记 2 至 4 个圆。圆圈之间应保持适当间距，最好不跨越大的叶脉。选择充分展开的叶片，避免选择较老、质地坚韧或较厚的叶片，并避免在叶片的下部区域标记圆圈。</li>
</ol>
实验前一天标记圆圈并非本方案的必要步骤。然而，若需要检测大量植株，则提前标记可节省时间，并有助于更精确地控制PTI诱导与挑战接种之间的时间间隔。
第4部分：PTI的诱导
第3天：
<ol>
<li>用10 mM MgCl2从培养板中收集P. fluorescens和P. putida的细胞。对于Agrobacterium，离心培养物以收集细胞，并重悬于10 mM MgCl2 + 10 mM MES（pH 5.6）中。重复一次离心，并将细胞重悬于MgCl2–MES溶液中。在600 nM处测定细胞的光密度（O.D.），并根据表2所述调整O.D.至最终所需值。Pseudomonas最终应重悬于10 mM MgCl2中，而Agrobacterium应重悬于MgCl2–MES溶液中。25 ml的总体积足以接种约40–50个位点。</li>
<li>使用1 ml无针头注射器将PTI诱导剂注入叶片上预先标记的圆圈内。记录植物接种的顺序以及接种开始的确切时间。</li>
</ol>
第5部分：攻毒接种
<ol>
<li>按照第4.1节和表2所述方法，准备丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（P. syringae pv. tomato DC3000）、P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1突变株以及丁香假单胞菌烟草致病变种（P.s. pv. tabaci）用于后续接种挑战。</li>
<li>在诱导剂浸润处理7小时后，按照与诱导处理相同的植株顺序进行接种挑战。通常可将第一次接种区域边缘处的一个点作为第二次接种区域的中心。若叶片上存在多个接种位点，需确保各次浸润区域互不重叠。</li>
<li>将实验中使用的所有菌液进行系列稀释，并涂布于含有适当抗生素的KBM或LB平板上，以确定确切的菌落形成单位（C.F.U.）数量。</li>
</ol>
第6部分：PTI分解的评分
第5天：
<ol>
<li>观察接种P.s.t. DC3000的区域是否出现由ETI引起的细胞死亡。若在重叠渗透区域内部出现细胞死亡，表明PTI被破坏，应记为阳性表型。</li>
</ol>
第7天：
<ol start="2">
<li>观察接种了P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 或 P.s. pv. tabaci 的位点是否出现因病害导致的细胞死亡。阳性表型的评分方法同6.1部分所述。</li>
</ol>
当对照植株（不应被PTI削弱的植株）在渗透重叠区域开始出现细胞死亡时，应停止进一步的观察。
第7部分：代表性结果
图1显示了以荧光假单胞菌（P. fluorescens）作为诱导剂、丁香假单胞菌番茄致病变种（P.s.t. DC3000）作为挑战病原时的实验结果。
<img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="植物害虫检测、昆虫在叶片上的移动、对比示意图、红圈区域带红色箭头。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 图 1. P. fluorescens 被注射到 N. benthamiana 叶片（黑圈）以诱导 PTI，7 小时后，该区域接种 P.s.t DC3000（白圈）。FLS2 基因沉默的植株在 P. fluorescens 注射区域表现出 PTI 的失效（A），表现为细胞死亡；而未进行基因沉默的对照植株由于 PTI 的诱导，在重叠区域无细胞死亡（B）。红色箭头指示重叠注射区域中细胞死亡的有无。照片拍摄于注射后 2 天。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">点击此处</a>查看图 1 的放大版本。
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>PTI诱导剂</td>
<td>引发细胞死亡的挑战</td>
<td>细胞死亡性质</td>
<td>代码</td>
</tr>
<tr>
<td>Pseudomonas fluorescens 55</td>
<td>Pseudomonas syringae pv tomato (P.s.t.) DC30006</td>
<td>ETI</td>
<td>Pf/DC</td>
</tr>
<tr>
<td>P. putida KT2440</td>
<td>P.s.t. DC3000</td>
<td>ETI</td>
<td>Pp/DC</td>
</tr>
<tr>
<td>P. fluorescens 55</td>
<td>P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-16</td>
<td>病害</td>
<td>Pf/Q1-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Agrobacterium tumefaciens GV2260</td>
<td>P. syringae pv. tabaci 11528R</td>
<td>病害</td>
<td>Agro/Ptab</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表1： 在PTI细胞死亡检测中用于诱导PTI和激发细胞死亡的微生物组合。
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>细菌菌株</td>
<td>筛选培养基</td>
<td>实验中使用的终末光密度（O.D.）</td>
<td>对应的菌落形成单位/毫升（C.F.U./ml）</td>
</tr>
<tr>
<td>P. fluorescens 55</td>
<td>KBM 氨苄青霉素 (100 ug/ml)</td>
<td>0.5</td>
<td>1 x 109</td>
</tr>
<tr>
<td>P. putida KT2440</td>
<td>KBM 氨苄青霉素 (100 ug/ml)</td>
<td>0.5</td>
<td>1 x 108</td>
</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens GV2260</td>
<td>LB 利福平 (100 ug/ml)</td>
<td>0.5</td>
<td>5 x 108</td>
</tr>
<tr>
<td>P.s.t. DC3000</td>
<td>KBM 利福平 (100 ug/ml)</td>
<td>0.02</td>
<td>2 x 107</td>
</tr>
<tr>
<td>P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1</td>
<td>KBM 利福平 (100 ug/ml)</td>
<td>0.1 的 100 倍稀释</td>
<td>1 x 106</td>
</tr>
<tr>
<td>P. syringae pv. tabaci 11528R</td>
<td>KBM 利福平 (100 ug/ml)</td>
<td>0.1 的 100 倍稀释</td>
<td>1 x 106</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表2：检测中使用的培养条件和接种量。不同品牌的分光光度计测得的光密度（O.D.）及相应的菌落形成单位（C.F.U.）水平可能存在差异。

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

基于细胞死亡的检测方法可用于确定某个基因在PTI中的作用。例如，可以利用该检测方法测试目的基因的功能缺失突变体。在表1给出的诱导剂与挑战接种的4种组合中，可能只有一种组合能在特定植物背景下产生表型。我们观察到，FLS2基因沉默的植物在诱导剂与挑战接种的Pf/DC和Pf/Q1-1组合中表现出PTI的崩溃（表1）。
实验的环境条件应尽可能接近第3.1部分中所述的条件。低湿度会导致细胞死亡进程过快，从而使实验难以评分。如果本方案中描述的条件在您的实验室中不适用，可尝试调整诱导剂或挑战接种的浓度。另一个可调整的参数是诱导与挑战之间的时间间隔，但我们发现较短的时间间隔会导致对照植物的实验过快失效。
建议在实验中至少测试4-5株植物，并且阳性表型应在至少3-4次独立实验中重复出现。

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>费舍尔科技公司</td><td>BP300-100</td><td>配制成1M储备液，调节pH值并过滤除菌。室温保存。</td></tr><tr><td>生命科学紫外/可见分光光度计</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

植物中病原体相关分子模式（pamp）触发的免疫反应（pti）检测方法

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

为了感知环境中潜在的病原体，植物利用其质膜上存在的模式识别受体（PRR）。PRR可识别被称为病原体相关分子模式（PAMP）的保守微生物特征，这种识别会引发PAMP触发的免疫反应（PTI），从而有效阻止非病原体对植物组织的定植1,2。在PTI中研究最为深入的是FLS2依赖性通路3。FLS2可识别细菌鞭毛蛋白组分flg22这一PAMP。
成功的病原体具有毒力因子或效应子，能够抑制PTI，从而使病原体引发疾病1。相应地，一些植物具有抗性基因，可识别效应子或其活性，从而触发效应子诱导的免疫反应（ETI）2。
我们描述了一种基于细胞死亡的PTI检测方法，该方法经Oh和Collmer4的方案修改而来。该检测在N. benthamiana中进行了标准化，后者正 increasingly 被用作研究植物-病原体互作的模式系统5。通过将一种非致病性细菌菌株渗入叶片以诱导PTI。七小时后，再将一种能够致病或激活ETI的细菌菌株渗入与初始渗入区域重叠的区域。首次渗入所诱导的PTI能够延缓或阻止由第二次挑战性渗入引发的细胞死亡。相反地，若在重叠接种区域出现细胞死亡，则表明PTI已被破坏。
已标准化四种不同的PTI诱导剂与挑战性接种组合（表1）。该检测在未沉默的N. benthamiana植株上进行，作为对照；同时也在FLS2基因沉默的植株上进行，后者预计其启动PTI的能力受损。

本文描述了一种基于细胞死亡的PTI检测方法，用于Nicotiana benthamiana植物。

植物中病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫反应（PTI）检测方法

为了感知环境中潜在的病原体，植物利用其质膜上存在的模式识别受体（PRRs）。PRRs可识别……

您好，我是来自博伊斯·汤普森植物研究所 Greg Martin 实验室的 Suma TI。今天我们将向您展示一种基于细胞死亡的检测方法，用于检测由 PAM 触发的免疫反应（PTI）。我们实验室使用该方法来研究某个基因是否参与了 PTI 过程。那么，让我们开始吧。在开始实验前约七周，开始种植烟草（Nicotiana ANA），并在实验开始前四到五天进行准备。PAMP触发的免疫反应或PTI检测。修剪植株，去除所有腋生分枝和花朵。在腋生分枝刚出现时尽快将其去除，以便更好地管理植株。在准备好植物后，开始培养细菌。本实验采用非致病性细菌，在接种挑战菌株之前诱导植物免疫反应，需同时启动实验中使用的所有细菌的培养。同时，针对每种假单胞菌菌株，使用其冻存的甘油菌种进行复苏。在含有适当抗生素的 KBM 平板中央涂布少量细菌，并在 30 摄氏度下培养约 18 至 24 小时。对于农杆菌，使用先前准备好的新鲜平板，接种 2 毫升 LB 液体培养基以启动液体培养。在 30 摄氏度下振荡培养过夜，次日继续培养。向假单胞菌的平板中加入 150 至 200 微升液体 KBM。将细菌均匀涂布于整个平板表面，使用无菌涂布棒。将培养皿重新放回培养箱中继续培养20至24小时。农杆菌。在含有20微摩尔乙酰丁香酮的约5至10毫升LB培养基中启动二级培养。在30摄氏度下振荡培养过夜。在准备细菌的同时，于进行PTI实验前一天开始准备用于实验的植物。细菌制备完成后，将植物转移至温度为22至24摄氏度、相对湿度约为35%至40%、并保持恒定光照的环境中。接下来，使用粗的黑色记号笔在叶片上标记圆形区域。选择充分展开的叶片，避免选择较老、质地坚韧或触摸较厚的叶片。不要标记叶片的下部区域。圆圈的直径至少为1.5厘米，每片叶子上可标记2至4个圆圈。圆圈之间应保持适当间距，且最好不跨越大的叶脉。开始PTI检测前，先收获用于诱导PTI的细菌。所使用的假单胞菌应已形成表明生长良好的细菌菌苔。用无菌长木棒从平板上刮下菌体，并重悬于约20至25毫升的10毫摩尔氯化镁溶液中，用于农杆菌离心。培养以收集细胞，并重悬于约20至25毫升含10毫摩尔氯化镁和10毫摩尔MES（pH 5.6）的溶液中，重复离心，再次重悬于约20至25毫升氯化镁加MES溶液中。此时，诱导用假单胞菌和农杆菌已重新悬浮。在600纳米波长下测定三种培养物的光密度。通过用氯化镁稀释假单胞菌，以及用MES缓冲液加氯化镁稀释根癌农杆菌，来调整OD值。最终所需的OD值见随附的书面实验方案。总共25毫升的细菌培养物足以接种约40至50个位点。现在开始实验，使用1毫升无针头注射器将PTI诱导剂注入叶片上预先标记的圆圈区域。记录下植物被侵染的顺序以及诱导后开始侵染的具体时间。在诱导接种后的数小时进行攻毒接种。收获攻毒接种所需用的细菌菌株，方法同此前所述诱导用假单胞菌菌株的收获方法。再次测定OD值，并根据随附的GR方案调整菌液浓度。在诱导剂接种后七小时开始进行挑战接种。使用以下诱导剂与挑战剂的组合。选择第一次接种圈边缘上的一点作为第二次接种圈的中心。按照诱导时的相同顺序对植株进行挑战性侵染。若叶片上有多个侵染位点，需确保各侵染区域不发生重叠。最后，将实验中使用的所有菌液进行系列稀释，并涂布于含有适当抗生素的KBM或LB平板上。在激发接种后的两天，可以开始评估PTI反应。在诱导接种和挑战接种后的两天，观察因效应子触发的免疫（ETI）导致的细胞死亡现象，这些细胞死亡应出现在用PST DC3000进行挑战的区域。若在渗入重叠区域内部出现细胞死亡，则表明PTI被破坏，应记为阳性表型。在诱导接种和挑战接种后的四到五天，观察因病害导致的细胞死亡现象，这些细胞死亡应出现在用DC3000 hopQ1突变体或PS back高浓度再次挑战的区域。再次观察PTI被破坏的现象，该现象表现为在渗入重叠区域出现由病害引起的细胞死亡。持续观察植株，直至那些PTI功能未受损的植株开始在渗入重叠区域表现出细胞死亡。在用PFDC组合接种两天后，FLS2基因沉默的植物PTI受损。在重叠区域观察到细胞死亡，表明PTI功能失常。未进行任何基因沉默的对照植物也用PFDC组合接种，并在检测后两天进行观察，结果显示由于正常PTI反应，由挑战引起的细胞死亡出现在重叠区域外部，而不在内部。我们刚刚向您展示了如何在进行该实验流程时，开展基于细胞死亡的PTI（模式触发免疫）检测。需要注意的是，务必使植物保持在我们推荐的环境条件下。过高的湿度会对植物产生不利影响，并导致检测进程加快。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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