植物中病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫反应（PTI）检测方法

您好，我是来自博伊斯·汤普森植物研究所 Greg Martin 实验室的 Suma TI。今天我们将向您展示一种基于细胞死亡的检测方法，用于检测由 PAM 触发的免疫反应（PTI）。我们实验室使用该方法来研究某个基因是否参与了 PTI 过程。

那么，让我们开始吧。在开始实验前约七周，开始种植烟草（Nicotiana ANA），并在实验开始前四到五天进行准备。

PAMP触发的免疫反应或PTI检测。修剪植株，去除所有腋生分枝和花朵。在腋生分枝刚出现时尽快将其去除，以便更好地管理植株。

在准备好植物后，开始培养细菌。本实验采用非致病性细菌，在接种挑战菌株之前诱导植物免疫反应，需同时启动实验中使用的所有细菌的培养。同时，针对每种假单胞菌菌株，使用其冻存的甘油菌种进行复苏。

在含有适当抗生素的 KBM 平板中央涂布少量细菌，并在 30 摄氏度下培养约 18 至 24 小时。对于农杆菌，使用先前准备好的新鲜平板，接种 2 毫升 LB 液体培养基以启动液体培养。在 30 摄氏度下振荡培养过夜，次日继续培养。

向假单胞菌的平板中加入 150 至 200 微升液体 KBM。将细菌均匀涂布于整个平板表面，使用无菌涂布棒。

将培养皿重新放回培养箱中继续培养20至24小时。农杆菌。在含有20微摩尔乙酰丁香酮的约5至10毫升LB培养基中启动二级培养。

在30摄氏度下振荡培养过夜。在准备细菌的同时，于进行PTI实验前一天开始准备用于实验的植物。细菌制备完成后，将植物转移至温度为22至24摄氏度、相对湿度约为35%至40%、并保持恒定光照的环境中。

接下来，使用粗的黑色记号笔在叶片上标记圆形区域。选择充分展开的叶片，避免选择较老、质地坚韧或触摸较厚的叶片。不要标记叶片的下部区域。

圆圈的直径至少为1.5厘米，每片叶子上可标记2至4个圆圈。圆圈之间应保持适当间距，且最好不跨越大的叶脉。开始PTI检测前，先收获用于诱导PTI的细菌。

所使用的假单胞菌应已形成表明生长良好的细菌菌苔。用无菌长木棒从平板上刮下菌体，并重悬于约20至25毫升的10毫摩尔氯化镁溶液中，用于农杆菌离心。

培养以收集细胞，并重悬于约20至25毫升含10毫摩尔氯化镁和10毫摩尔MES（pH 5.6）的溶液中，重复离心，再次重悬于约20至25毫升氯化镁加MES溶液中。此时，诱导用假单胞菌和农杆菌已重新悬浮。

在600纳米波长下测定三种培养物的光密度。通过用氯化镁稀释假单胞菌，以及用MES缓冲液加氯化镁稀释根癌农杆菌，来调整OD值。最终所需的OD值见随附的书面实验方案。

总共25毫升的细菌培养物足以接种约40至50个位点。现在开始实验，使用1毫升无针头注射器将PTI诱导剂注入叶片上预先标记的圆圈区域。记录下植物被侵染的顺序以及诱导后开始侵染的具体时间。

在诱导接种后的数小时进行攻毒接种。收获攻毒接种所需用的细菌菌株，方法同此前所述诱导用假单胞菌菌株的收获方法。再次测定OD值，并根据随附的GR方案调整菌液浓度。

在诱导剂接种后七小时开始进行挑战接种。使用以下诱导剂与挑战剂的组合。选择第一次接种圈边缘上的一点作为第二次接种圈的中心。

按照诱导时的相同顺序对植株进行挑战性侵染。若叶片上有多个侵染位点，需确保各侵染区域不发生重叠。最后，将实验中使用的所有菌液进行系列稀释，并涂布于含有适当抗生素的KBM或LB平板上。

在激发接种后的两天，可以开始评估PTI反应。在诱导接种和挑战接种后的两天，观察因效应子触发的免疫（ETI）导致的细胞死亡现象，这些细胞死亡应出现在用PST DC3000进行挑战的区域。若在渗入重叠区域内部出现细胞死亡，则表明PTI被破坏，应记为阳性表型。在诱导接种和挑战接种后的四到五天，观察因病害导致的细胞死亡现象，这些细胞死亡应出现在用DC3000 hopQ1突变体或PS back高浓度再次挑战的区域。再次观察PTI被破坏的现象，该现象表现为在渗入重叠区域出现由病害引起的细胞死亡。持续观察植株，直至那些PTI功能未受损的植株开始在渗入重叠区域表现出细胞死亡。

在用PFDC组合接种两天后，FLS2基因沉默的植物PTI受损。在重叠区域观察到细胞死亡，表明PTI功能失常。未进行任何基因沉默的对照植物也用PFDC组合接种，并在检测后两天进行观察，结果显示由于正常PTI反应，由挑战引起的细胞死亡出现在重叠区域外部，而不在内部。

我们刚刚向您展示了如何在进行该实验流程时，开展基于细胞死亡的PTI（模式触发免疫）检测。需要注意的是，务必使植物保持在我们推荐的环境条件下。过高的湿度会对植物产生不利影响，并导致检测进程加快。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。