Name: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 学习利用冷冻研磨、尿素溶解、HILIC分级和IMAC富集技术进行磷酸化肽段定量分析的方法。该流程结合质谱技术，为神经科学和蛋白质组学领域的细胞信号传导机制研究提供可靠手段。

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我们感谢 Rich Rogers 博士在质谱分析方面的技术支持和有益讨论，同时感谢 Rob Moritz 博士、Jeff Ranish 博士和 Hamid Mirzai 博士的有益讨论。
本工作由美国国立卫生研究院卓越中心资助。

细胞生长与培养基
<ol>
 <li>将单个 BY4742Δarg4Δlys1 菌落接种于 100 mL 富集培养基中，过夜培养至 OD600 达到 1.0，然后转接至两份各 1 升的最小酵母培养基（0.17% 不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮源基础培养基，0.5% 硫酸铵）中，该最小培养基需添加全部氨基酸，并补充 20 mg/L 的天然同位素标记或重同位素标记的精氨酸（13C6 15N4；Isotec）和赖氨酸（13C6 15N2；Isotec）。</li>
 <li>细胞继续培养 18 小时，至 OD600 达到 1.8。为确保标记同位素完全掺入，细胞必须经历至少 9 代的生长。将轻同位素标记的样品离心收集，用无菌水洗涤后，重新接种至含油酸的培养基（含天然同位素标记的精氨酸和赖氨酸，0.2% 油酸（Sigma Chemicals）和 0.5% Tween 40（Sigma Chemicals））中，并继续刺激培养 85 分钟。由此获得相对于精氨酸和赖氨酸为轻同位素标记的油酸刺激样品，以及重同位素标记的葡萄糖培养对照样品。</li>
</ol>
细胞裂解、肽段的分离与组分分级
<ol start="3">
 <li>称量离心管。通过离心收集样品，离心3分钟。弃去培养基并吸除多余液体。称量沉淀及离心管（通常产量在1-2克之间），然后在液氮中快速冷冻。向液氮中的冷冻沉淀中加入与沉淀重量相等体积的“研磨”缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS，Gibco），10%甘油，蛋白酶抑制剂（SigmaFAST蛋白酶抑制剂片剂，Sigma）和HALT磷酸酶抑制剂（Thermo Scientific））。</li>
 <li>将研磨容器在液氮中冷冻。等待液氮停止沸腾。将沉淀连同冷冻的钢珠一起转移至研磨容器中。</li>
 <li>以600 rpm进行研磨，每个循环1分20秒，并反转方向，持续3分钟。将研磨容器再次在液氮中冷冻。重复此过程共5次，总研磨时间为15分钟。</li>
 <li>将冷冻的研磨产物收集至50 ml Falcon管中，并置于干冰上。保存于-80 °C，直至使用。</li>
 <li>配制10 ml含8 M尿素、0.1 M碳酸氢铵、0.1 M Tris（pH 8.6）的溶液。向1体积的冷冻研磨产物中加入3体积的尿素缓冲液（例如，向含1 ml PBS缓冲液的1克沉淀中加入3 ml尿素缓冲液）。立即使用探头式超声仪对混合物进行超声处理（2–10秒脉冲）。保持探头靠近管底，以防止溶液起泡。研磨产物应迅速溶解。</li>
 <li>在4°C下离心5分钟，澄清裂解液。</li>
 <li>将上清液转移至新的离心管中。</li>
 <li>新鲜配制0.5 M Tris[2-羧乙基]膦（TCEP）溶液。按1:100比例加入样品中，使终浓度为5 mM。在37°C孵育1小时。</li>
 <li>还原半胱氨酸的烷基化。待样品冷却至室温。新鲜配制1 M碘乙酰胺溶液。避光操作（可用铝箔包裹离心管）。加入碘乙酰胺至终浓度20 mM。室温避光孵育1小时。</li>
 <li>用1 M储备液配制20 mM二硫苏糖醇（DTT）在室温下淬灭碘乙酰胺，孵育1小时。</li>
 <li>使用标准Bradford或BCA法测定蛋白浓度（本方法未详述）。取样用于后续SDS-PAGE分析。</li>
 <li>为验证重同位素的掺入情况，取100 μl经还原和烷基化处理的裂解液。用dH2O按1:4稀释，超声处理后按蛋白:胰蛋白酶50:1的比例加入胰蛋白酶。消化至少4小时，使用真空浓缩仪干燥样品，然后用C18 Ultramicrospin柱（The Nest Group）进行脱盐。
 <ol>
 <li>用100 μl乙腈水合柱子</li>
 <li>用200 μl 0.1%三氟乙酸（TFA）平衡柱子</li>
 <li>将干燥样品重悬于200 μl 0.1% TFA中，上样至柱子。以约200 × g或使液体流过柱子所需的最低转速离心</li>
 <li>用200 μl 0.1% TFA洗涤两次</li>
 <li>用50 μl 60%乙腈、0.1% TFA洗脱两次</li>
 <li>在真空浓缩仪中干燥样品</li>
 <li>将样品重悬于20 μl 0.1%甲酸中。取2 μl上样至质谱仪。通过m/z谱图中精氨酸和赖氨酸分别产生10和8道尔顿的位移，检测重同位素标记氨基酸的掺入情况。每种氨基酸的掺入率应在96–98%之间</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将同位素标记的重链和轻链样品按等量（以蛋白毫克数计）混合。</li>
 <li>用20%甲醇将样品按1:4稀释。</li>
 <li>按1:200比例加入胰蛋白酶。在37°C孵育过夜。</li>
 <li>通过SDS-PAGE检测消化是否完全。分别上样2 μl和4 μl消化前样品，以及8 μl和16 μl胰蛋白酶消化后样品。通过考马斯亮蓝染色观察消化是否完全。若未完全消化，可短暂超声处理样品后再次加入胰蛋白酶进行消化。</li>
 <li>在真空浓缩仪中将样品干燥。干燥后加入200 μl过滤的dH2O，涡旋振荡至沉淀完全溶解。再次在真空浓缩仪中干燥。用dH2O重悬，再次干燥。</li>
 <li>将沉淀重悬于0.1%三氟乙酸（TFA；Sigma）中。使用pH试纸检测pH值，应约为3。如需，可用10% TFA酸化。</li>
 <li>离心去除任何沉淀物。</li>
 <li>在Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18柱上对样品进行脱盐。切勿过载柱子。最大上样量为5 mg，但建议略少为宜。必要时可将样品分装至多个柱子。
 <ol>
 <li>用5 ml 100%乙腈水合柱子。以约200 × g或使液体流过柱子所需的最低转速离心</li>
 <li>用5 ml 0.1% TFA平衡柱子。上样，收集流出液并重复上样</li>
 <li>用5 ml 0.1% TFA洗涤。重复一次</li>
 <li>用2 ml 60%乙腈、0.1% TFA洗脱</li>
 <li>在真空浓缩仪中干燥样品</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 多肽分级分离与磷酸化多肽的纯化
<ol>
<li>使用HILIC色谱柱对肽段进行分级分离。我们采用TOSOH TSK-Gel Amide-80 4.6 mm × 25 cm分析柱并配备保护柱。此步骤需耐心操作，先以90% A溶剂冲洗色谱柱2小时，随后运行两次空白梯度，再上样。该规格色谱柱的最大载样量约为XX，我们通常每轮上样不超过5 mg。</li>
<li>溶剂A - 98%乙腈/0.1%三氟乙酸 
溶剂B - 2%乙腈/0.1%三氟乙酸 
上样条件：90% A保持20分钟，90% A至85% A梯度5分钟，85% A至60% A梯度40分钟，60% A至0% A梯度5分钟，0% A至90% A梯度5分钟。</li>
<li>流速为1 ml/min，从85% A到60% A的梯度阶段开始，每2分钟收集一次组分。</li>
<li>合并组分，将总组分数减少至10个。增加组分数通常可提高磷酸化蛋白质组的覆盖度。</li>
</ol>
磷酸化肽段的富集
<ol>
<li>使用 PHOS-Select 铁亲和凝胶富集磷酸化肽。我们将 IMAC 树脂分装保存，以避免反复冻融。配制 50 ml 含 250 mM 乙酸和 30% 乙腈的上样溶液，用 HCl 调节 pH 至 2.7。用 500 μl 上样溶液重悬样品沉淀。检测 pH，必要时用 HCl 或 NaOH 调整。</li>
<li>在合适的层析柱中预洗 200 μl IMAC 微珠。我们使用 Molbiotec 离心柱。 
向每份样品中加入 15 μl 50% 悬浮液（凝胶与上样溶液混合物），并在旋转仪上翻转孵育 30 分钟。保留流出液用于后续分析。</li>
<li>用上样溶液洗涤样品 3 次，再用 500 μl 过滤的 dH2O 洗涤 1 次。</li>
<li>用 400 μl 50 mM Na2HPO4 缓冲液（pH 8.4）洗脱肽段，洗脱时间为 2–3 分钟。将洗脱液转移至玻璃小瓶中。</li>
<li>加入 5 μl 100% 甲酸将溶液酸化至 pH 3，液氮速冻后在真空浓缩仪中干燥样品。</li>
<li>将磷酸化肽重悬于 200 μl 0.1% TFA 中，并按上述方法进行 C18 净化。将洗脱后的样品在真空浓缩仪中干燥。</li>
<li>将肽段重悬于 20 μl 0.1% 甲酸中。每次质谱分析使用 2 μl，或根据需要调整用量。</li>
</ol>
注意事项
在本实验方案的大部分步骤中，您将处于“盲操作”状态。可通过 Western 印迹法以及 Bradford 或 BCA 测定法监测细胞裂解效果，胰蛋白酶消化过程也可方便地进行评估。HILIC 色谱柱将产生类似于本文所示或文献中报道的色谱图 [1, 2]，具体结果取决于所使用的液相色谱仪器。样品通过质谱进行监测；在使用高成本、高质谱精度和高分辨率仪器进行分析之前，建议先在 LCQ 或 MALDI 等低成本设备上测试样品。最后，若需将含有酸的样品干燥，应使用玻璃器皿。

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

该方法可富集磷酸化肽段，进而进行定量分析。本实验方案中有多个参数可以调整，但最重要的是要保持样品的磷酸化修饰状态。细胞的定量前处理可通过多种方式实现，例如，如果无法在活体（in vivo）中标记细胞，可在提取后使用如ICAT[3]或ITRAC[4]等标签，对两个细胞培养物进行差异标记以实现定量分析。
在组分分离中，最常用的方法包括通过SDS-PAGE进行的凝胶分离[5, 6]、强阳离子交换色谱（SCX）[7]以及基于HILIC的色谱方法[1, 2]。我们选择了HILIC，因为它能在梯度洗脱结束时才洗脱肽段，而不会像SCX那样在梯度初期即被洗脱；但其他研究团队也已成功使用其他方法。
使用IMAC时，您可能需要增加或减少所用树脂的量、孵育时间或洗涤次数。此外，已有研究探讨了对我们在此处提供的上样溶液初始化学条件进行调整的方法[8]。结合使用这些方法，应可实现分离出磷酸化肽纯度在60%至95%之间的样品。一旦针对您的特定体系建立了方法，便可进一步优化以获得更高的磷酸化肽得率。
<p class="jo...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-精氨酸&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-赖氨酸&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; 磷酸盐缓冲液（PBS）7.4 (10X) 液体</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFAST蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Halt 磷酸酶抑制剂混合物</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Retsch PM100 球磨仪 </td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Retsch 125 ml 不锈钢研磨罐</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>超微量C18色谱柱</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>沃特斯</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>TSK-Gel Amide-80 4.6 mm × 25 cm 分析柱</td><td>东曹株式会社</td><td>13071</td><td>这是HILIC色谱柱。</td></tr><tr><td>保护柱 4.6 mm 内径 × 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>我们推荐使用该保护柱以延长您的HILIC柱寿命。</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; 铁亲和凝胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>这是IMAC树脂。分装并保存。</td></tr></tbody></table>

脂肪酸刺激下的定量磷酸化蛋白质组学 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

本方案描述了同位素标记的重链与轻链酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞的培养及其经油酸处理的刺激过程。细胞采用冷冻裂解法在球磨机中进行研磨，所得研磨产物通过尿素溶解使其进入溶液状态。该方法可在细胞代谢失活的状态下实现裂解，从而保留磷酸化修饰状态，并防止细胞裂解过程中磷蛋白组的重分布。随后对蛋白进行还原、烷基化处理，并经胰蛋白酶消化。样品在C18柱上脱盐后，利用亲水相互作用色谱法（HILIC）进行分级以降低样本复杂度。HILIC柱对亲水性分子具有优先保留作用，因此特别适用于磷酸化蛋白质组学研究。在色谱洗脱过程中，磷酸化肽段通常比非磷酸化肽段更晚洗脱。分级完成后，采用固定化金属离子亲和色谱法富集磷酸化肽段，该方法依赖于磷酸化肽段与金属离子之间的电荷相互作用实现选择性富集。本方案结束时，样品已准备好用于质谱的定量分析。

关键词：酿酒酵母，油酸，同位素标记，冷冻裂解，尿素溶解，还原，烷基化，胰蛋白酶消化，C18脱盐，亲水相互作用色谱，HILIC，固定化金属离子亲和色谱，磷酸化肽段富集，质谱分析

利用低温裂解、尿素溶解、HILIC分级和IMAC富集磷酸化肽段的定量磷酸化实验方案描述。

脂肪酸刺激下的定量磷酸化蛋白质组学 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本方案描述了同位素标记的重链与轻链酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞的培养与脂肪酸油酸刺激。细胞经研磨……

磷酸化是一种关键的细胞信号传导机制，调控从蛋白质定位到DNA转录等多种生物学过程。仅针对磷酸化位点进行质谱分析，是信号转导和蛋白质组学研究领域的一项激动人心的新进展。不同标记的细胞通过球磨机研磨裂解，随后进行还原、烷基化、混合和消化处理。消化后的肽段通过亲水相互作用色谱进行分级分离，并利用iMac富集技术从各组分中富集磷酸化肽段。通过质谱法（msm）鉴定磷酸化肽段富集后的组分。大家好，我是来自持久性生物学研究所E组的Ramsey Celine。今天我们将向您展示一种代谢标记磷酸化肽段的提取方法。我们在实验室中采用此方法对 fossa 蛋白质组进行定量研究。现在开始操作。该流程首先培养同位素轻标记和重标记的酵母细胞。首先，用单个酵母菌落接种100毫升丰富培养基。将该培养物在30°C下过夜培养至OD 600达到1.0。然后用此菌液接种两份各一升的最小培养基，培养基中需含有全部氨基酸，并添加20毫克/升的同位素标记前体。使用普通或同位素标记的重同位素精氨酸和赖氨酸分别培养一升培养物，培养18小时至OD 600达到1.8。细胞必须经历至少九代生长，以确保标记同位素完全掺入。当细胞已完全掺入标记同位素后，离心收集在含有普通同位素精氨酸和赖氨酸的培养基中培养的细胞。为了获得细胞沉淀，将沉淀用无菌水洗涤后重悬于含有同位素正常标记的精氨酸和赖氨酸的油酸培养基中，并刺激85分钟。由此获得同位素轻标记的油酸刺激样本。另一组在含有同位素重标记的精氨酸和赖氨酸培养基中培养的细胞不进行油酸刺激，作为同位素重标记的葡萄糖培养对照样本。为收集一升培养物，将培养液分装至四个250毫升离心管中。离心后，去除或保留各管中约100毫升培养基，重悬细胞，并转移至下一管中，最终将所有细胞收集至单个离心管内，在4,000 RPM条件下离心三分钟，形成一个较大的细胞沉淀。去除上清后，将离心管及其沉淀物的重量与空离心管进行比较。离心后，移除上清液并吸去管中多余的液体，称量沉淀物，典型产量为一至两克。接下来，用液氮速冻沉淀物，并向沉淀物中加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的研磨缓冲液。加入的研磨缓冲液体积应与沉淀物重量相当。将研磨容器置于液氮中冷冻。当液氮停止沸腾时。使用刮刀将沉淀物打碎，并转移至含有冷冻钢珠的研磨容器中。以600 RPM转速研磨沉淀物，进行一次22秒的研磨循环，并反转方向，持续三分钟。将研磨容器在液氮中重新冷冻。重复研磨四次，总共研磨15分钟。两个样品完成研磨后的研磨时间。将冷冻研磨后的样品收集至50毫升离心管中，并在液氮或干冰中保持冷冻状态。将研磨后的样品在 -80 摄氏度下保存，直至使用。肽段的分离与分级从其烷基化开始。第一步是将样品溶解于尿素溶液中。将三份体积的尿素缓冲液加入一份体积的冷冻研磨样品中，使各样品溶解。例如，向一克样品沉淀中加入三毫升RIA缓冲液，再加入一毫升PBS缓冲液。立即使用探头对混合物进行超声处理。采用尖端超声法，将探头保持在管底附近，以防止溶液起泡。研磨后应立即将样品加入溶液中。在4 °C条件下，以6,000 RPM离心5分钟，澄清裂解液。将上清液转移至新的离心管中。开始还原反应时，向每个样品中加入新配制的 0.5 摩尔三羟甲基氨基甲烷二羧基磷烷或 TCEP，按 1:100 的比例稀释。为达到 5 毫摩尔的最终 TCEP 浓度，将样品在 37 摄氏度孵育一小时。37 摄氏度孵育结束后，让样品冷却至室温。然后加入新配制的1 M碘乙酰胺，使其终浓度为20 mM，在室温下避光孵育1小时。孵育1小时后，用20 mM DTT淬灭碘乙酰胺反应，室温下静置1小时。经过还原和烷基化的裂解液现已准备好进行胰蛋白酶消化。此时，可取部分裂解液样品用于蛋白质定量、SDS-PAGE分析以验证细胞裂解效果，以及质谱分析以确认重同位素的掺入情况。开始胰蛋白酶消化前，需将同位素标记为重链和轻链的样品等量混合。用20%甲醇将样品稀释至四分之一，并加入胰蛋白酶至200倍稀释。将样品在37摄氏度下孵育过夜，次日进行后续操作。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色确认消化完全后，将样品在真空浓缩仪中干燥至干。加入200微升过滤的蒸馏水，涡旋振荡直至沉淀完全溶解。使用真空离心浓缩仪将样品干燥，再用蒸馏水重新悬浮。干燥后，再次将沉淀重悬于0.1%三氟乙酸（TFA）中，必要时使用pH试纸检测，确保pH值约为3。用10% TFA酸化，使任何沉淀物析出。现在将使用水合套装 VAC 500 毫克 C18 柱对消化后的样品进行脱盐。首先，用 5 毫升 100% 乙腈润洗柱子，在约 200 × g 的离心力下离心，或采用可使液体流经柱子的最低转速。接着，用 5 毫升 0.1% 三氟乙酸（TFA）平衡柱子，然后上样。注意不要使柱子过载，必要时可将样品分装至多个柱子中。将流出液收集到废液容器中，必要时再次上样，并用五毫升 0.1% TFA 洗涤。重复此洗涤步骤，然后用两毫升 60% 乙腈 0.1% TFA 洗脱，洗脱液必须通过离心收集。将样品在真空浓缩仪中干燥，然后用200微升溶剂B重新溶解干燥的样品。重新溶解的样品现可进行肽段分级。使用带有保护柱的TSK gel AMIDE 80分析柱对肽段进行分级。进行此步骤时请务必缓慢操作。以90%溶剂A的条件运行色谱柱两小时，然后在上样前运行两次空白梯度。对于这种规格的色谱柱，我们通常每针上样量不超过5毫克，无论是现代还是较早期的液相色谱系统。仪器可实现自动进样、组分收集、流速控制以及梯度混合。如上所述，在运行开始时设置以下条件：在20分钟内加载90%A，随后在5分钟内从90%A降至85%A，在40分钟内从85%A降至60%A，在5分钟内从60%A降至0%A，最后在5分钟内从0%A升至90%A。流速设定为1毫升每分钟，并以2分钟为间隔收集组分。从85%A到60%A梯度开始，合并组分以将组分数减少至10个；增加的组分可能会显著提高磷酸化蛋白质组的覆盖度。磷酸化肽段通过固定化金属亲和色谱进行富集。我们使用Phos-Select铁亲和凝胶作为IMAC树脂。首先，将沉淀物重悬于500 µL上样溶液中。接着，向每份组分中加入15 µL的50%悬液，并在颠倒旋转条件下孵育样品30分钟。保留流出液用于分析。用上样溶液洗涤样品三次，洗涤后用500微升过滤的蒸馏水洗涤一次，再用400微升50毫摩尔的磷酸钠缓冲液洗脱肽段2至3分钟。将洗脱的肽段转移至玻璃小瓶中。向肽段中加入5微升100%甲酸，酸化至pH 3，用200微升0.1%三氟乙酸重悬磷酸化肽段，并按照前述方法用C18柱再次脱盐，然后在真空浓缩仪中将所得样品完全干燥。最后，将磷酸化肽段重悬于20微升含0.1%甲酸的溶液中。样品现可进行质谱定量分析。此处展示了使用H-I-L-I-C色谱法分离全细胞肽段所得的色谱图谱。从该图谱可以看出，尽管磷酸化肽段在整个洗脱曲线中均有分布，但大部分磷酸化残基直到洗脱接近结束时才被洗脱下来。我们刚刚向您展示了如何研磨细胞、消化蛋白质、对肽段进行分级，并利用固定化金属离子亲和色谱富集磷酸化肽段。在进行该实验操作时，重要的是要注意保持磷酸化修饰的完整性，并检查各溶液的pH值。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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