Name: 一个 FluoroBlok肿瘤侵袭实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学习使用FluoroBlok肿瘤侵袭实验检测癌细胞侵袭能力的方法。本视频演示了HT 1080和NIH 3T3细胞系在Matrigel基质中的侵袭行为，通过荧光定量分析评估细胞迁移特性，为癌症转移研究提供可靠的体外实验数据。

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使用BD钙黄绿素AM荧光染料进行标记后检测与测量
细胞在侵袭穿过BD Matrigel基质并透过BD FluoroBlok膜后进行标记，以进行定量分析。因此，仅可获得细胞侵袭的终点测量结果。
<ol>
<li>将细胞培养至约 80% 汇合度。</li>
<li>准备并重水化小室系统。<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>将包装从 -20°C 取出，置于室温平衡。</li>
<li>打开铝箔包装，在小室孔内加入 500 μL 预热（37°C）的培养基。于 37°C、5% CO2 条件下孵育 2 小时以完成重水化。 注意：作为细胞迁移对照使用的未包被 BD Falcon FluoroBlok 24 孔小室系统无需进行重水化。</li>
<li>重水化完成后，小心移除小室孔中的培养基，避免扰动膜上 BD Matrigel 基质层。系统现已可使用。</li>
</ol></li>
<li>用胰蛋白酶消化单层细胞，将细胞重悬于无血清 DMEM 中，制备成浓度为 5 × 104 个细胞/mL 的细胞悬液。 注意：若使用其他类型的细胞，需确定最佳接种密度。为确定特定细胞类型在多孔生长表面的最佳接种密度，应采用一系列覆盖非多孔表面（如培养瓶、培养皿和培养板）常用接种密度范围的接种密度（细胞数/cm2）。例如，若当前接种密度为 2.5 × 105 个细胞/cm2，则可在 5 × 104 至 5 × 105 个细胞/cm2 范围内设置不同细胞浓度进行测试，以确定最佳初始接种密度。</li>
<li>向顶端室加入 500 μL 细胞悬液（含 2.5 × 104 个细胞）。</li>
<li>通过取样孔向每个基底室加入 750 μL 趋化因子（含 5% FBS 的 DMEM）。</li>
<li>将 BD BioCoat 肿瘤侵袭系统和未包被的 BD Falcon FluoroBlok 24 孔小室板置于 37°C、5% CO2 环境中孵育 20–22 小时。</li>
<li>孵育结束后，小心移除顶端室中的培养基。可通过轻弹将内容物甩入废液容器中实现。操作时切勿触碰小室系统的底面。</li>
<li>将小室系统转移至另一块 24 孔板中，每孔加入 500 μL 含 4 μg/mL Calcein AM 的 HBSS 溶液。于 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。读取荧光前无需移除下室中的 Calcein AM 溶液，因其为非荧光性活体染料，可被胞质酯酶转化为绿色荧光的钙黄绿素。</li>
<li>使用底部读板型荧光酶标仪在激发/发射波长 494/517 nm（Ex/Em）条件下检测侵袭细胞的荧光强度。增益设置需通过实验确定，但可先以中间值作为起始点。过高的增益可能导致高荧光样品使检测器饱和，从而无法获得有意义的结果。不建议使用自动增益功能（即使仪器支持）。可使用倒置荧光显微镜验证实验结果；首次进行该检测时尤其推荐此步骤。 注意：必须使用正确的板图读取小室系统，至关重要。有关加载板图的信息，请参阅 www.bdbiosciences.com 上的 BD 技术公告 No. 436，或联系 BD 技术支持（labware@bd.com）。正确的板方向为：A1 孔位于左上角，BD Falcon 标志朝向右侧，当将板插入读板仪时标志应朝右。</li>
</ol>
数据降维
数据表示如下列方程所示： <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="细胞侵袭计算；使用相对荧光单位（RFU）值进行迁移、趋化分析的%侵袭计算方程。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 "> 在计算细胞侵袭百分比之前，可先减去背景值 RFU = 相对荧光单位。

<ol><li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol%2C+a+novel+triterpene%2C+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-%CE%9AB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li>
<li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-%CE%BAB+Activation+by+Inhibiting+I%CE%BAB%CE%B1+Kinase+Activation%2C+Thereby+Suppressing+NF-%CE%BAB-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression%2C+Up-regulating+Apoptosis%2C+and+Inhibiting+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li>
<li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+cysteini+residues+in+I%CE%BAB%CE%B1+kinase+and+NF-%CE%BAB+%28p65%29+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li>
<li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+Akt+Inhibitor%2C+Suppresses+I%CE%9AB%CE%B1+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-%CE%BAB-Regulated+Gene+Expression%2C+Potentiation+of+Apoptosis%2C+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li>
<li>Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).</li>
<li>An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).</li>
<li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mole.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li>
<li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).</li>
<li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).</li>
</ol>

作者为 BD Biosciences 的员工，该公司生产本文所用的试剂和工具。

<table><tbody><tr><td>BD BioCoat 肿瘤侵袭系统</td><td>BD Biosciences</td><td>354165 或 354166</td><td></td></tr><tr><td>HT-1080 和 NIH/3T3 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基（DMEM；无血清）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（不含钙和镁，DPBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon FluoroBlok 24 孔多孔插件系统（用于细胞迁移对照）</td><td>BD Biosciences</td><td>351157 或 351158</td><td></td></tr><tr><td>含 5% 胎牛血清的 DMEM 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Calcein AM 荧光染料</td><td>BD Biosciences</td><td>354216 或 354217</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液（HBSS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 24 孔板（用于细胞侵袭后标记）</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>具备底部读数功能的荧光酶标仪</td><td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一个 体外 fluoroblok 肿瘤侵袭实验

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

转移性细胞的特征在于其能够侵袭基底膜并迁移到身体的其他部位。细胞必须同时具备分泌降解基底膜的蛋白酶以及迁移的能力，才能具有侵袭性。BD BioCoat 肿瘤侵袭系统为细胞提供了可评估其侵袭特性的实验条件in vitro1,2. 它由一个BD Falcon FluoroBlok 24孔插入式培养板组成，其聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的孔径为8.0微米，并均匀包被了BD Matrigel基质。这一层均匀的BD Matrigel基质充当重建的基底膜in vitro 在为研究细胞侵袭提供适当蛋白质结构的同时，真正阻隔非侵袭性细胞。涂层过程会封闭膜上的孔隙，阻止非侵袭性细胞穿过膜。相比之下，侵袭性细胞能够脱离并穿过涂层膜。可通过细胞侵袭前或侵袭后使用荧光染料（如DiIC）标记来定量检测细胞侵袭能力。12(3) 或钙黄绿素 AM，并测量侵袭细胞的荧光。由于 BD FluoroBlok 膜在 490–700 nm 波长范围内对光的阻断效率超过&gt;99%，因此未发生侵袭的荧光标记细胞不会被底部读取式荧光酶标仪检测到。然而，已侵袭至膜下表面的细胞不再受到屏蔽，可被相应的酶标仪检测到。本视频展示了一种终点细胞侵袭实验，使用钙黄绿素 AM 检测已侵袭的细胞。

本视频演示了如何利用基于荧光的方法，通过细胞培养小室测量细胞侵袭能力。

一个 体外 FluoroBlok 肿瘤侵袭实验

转移细胞的显著特征是其能够侵袭基底膜并迁移到身体其他部位。细胞必须具备……

细胞侵袭是癌症进展和血管生成的重要步骤。体外侵袭实验通常用于评估细胞降解重建基底膜（如BD基质、凝胶基质）并通过细胞培养小室进行迁移的能力。肿瘤侵袭实验始于将细胞加入预先包被了基质胶（matri gel）的Fluor阻断小室中。在基底室中加入重建的基底膜趋化剂，然后将系统进行孵育。经过一夜孵育后，侵袭性细胞能够降解 Matrigel 屏障，并穿过荧光保护膜（一种可防止荧光物质暴露于环境光的特殊膜）。弃去顶端室内的内容物，将多孔插件转移至另一块含有荧光物质的培养板中。孵育后，活细胞被染色，可通过肉眼和酶标仪进行检测。大家好，我是来自 BD Biosciences Discovery LabWare 的 Jeff Partridge。今天我们将向您展示一种用于检测肿瘤侵袭能力的铺板式侵袭实验方法。我们使用此方法研究肿瘤细胞穿过基底膜向趋化因子侵袭的过程。现在开始操作。将用于肿瘤侵袭实验的细胞培养至约80%汇合度。在本实验中，我们将使用 HT 10 80 和 N NIH 3T3 细胞系。HT 10 80 细胞已被证实能够在该系统中迁移并侵袭 matrigel 屏障，因此可作为该检测的良好阳性对照。NIH 3T3 细胞不具备侵袭性，但具有迁移能力，因此可作为该实验步骤的良好阴性对照。首先，通过将 BD BioCoat 肿瘤侵袭系统包装从 -20 摄氏度的储存环境中取出，并使其升至室温，以实现系统的再水化。由于该实验需要无菌操作技术，应将插入物在组织培养罩内静置至室温。待包装达到室温后，打开包装，使基底膜进行再水化，以便目标细胞能够穿过该膜。向插入式培养板孔内加入500微升预热的培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时以使培养板充分水化。未包被的BD Falcon Flora Block 24孔插入式培养板无需水化，因其将用作细胞迁移对照，用于在侵袭实验前准备细胞。用胰蛋白酶消化细胞单层，将细胞重悬于无血清DMEM培养基中，细胞密度为每毫升5×10⁴个细胞。如果使用不同类型的细胞，必须通过实验确定最佳接种密度。包被板水化后，小心地从插入式孔中移除培养基，注意不要破坏膜上的MA凝胶层。此时系统已准备好使用。切勿让基底膜基质（MA）凝胶层干燥。为开始细胞侵袭实验，在基质胶包被和未包被的两种条件下，分别向肿瘤侵袭系统的顶端室中加入500微升每种细胞悬液。接着，通过样品加样孔向包被和未包被板的基底室中各加入750微升趋化吸引剂。在填充基底室时，务必避免引入任何气泡。作为迁移对照，将每种细胞悬液以及趋化因子加入未包被的 BD Falcon Flora Block 24 Multi WA 插入式培养板中。于次日在 37 摄氏度、5% 二氧化碳气氛条件下，将肿瘤侵袭系统和未包被的 Falcon Flora Block 24 Multi WA 插入式培养板共同孵育 20 至 22 小时。孵育完成后，细胞即可用荧光染料钙黄绿素 AM 进行标记。通过轻弹将顶室中的培养基移入废液容器中。随后立即将插入式系统转移至另一块 24 孔板中，每孔加入 500 µL 含 4 µg/mL 的溶液。在Hank's平衡盐溶液中加入钙。对迁移对照组重复上述步骤。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一小时。请勿触碰插入系统的底面。在与钙黄绿素共同孵育一小时后，可测量侵袭细胞的荧光强度。至关重要的是，插入系统必须根据正确的板图进行读取。正确的板子朝向是将A1孔置于左上角，BD Falcon标志朝右，将板子插入读板仪时，使用底部荧光读板仪在494和517纳米波长下读取荧光值。应使用倒置荧光显微镜验证结果，以确保读板仪数据与视觉观察结果一致。这些数据来自包被板和未包被对照板的典型读板结果，实验为HT 10 80和NIH 3T3两种细胞系的细胞侵袭实验。无细胞孔的数据代表背景值，可在计算细胞侵袭百分比之前减去。使用以下公式计算侵袭百分比：侵袭百分比等于穿过基质胶包被膜朝向趋化因子的细胞的平均相对荧光单位（rfu）。该值除以细胞穿过未包被的 VD flua 小室膜向趋化因子迁移的平均相对荧光单位（RFU）。然后将此值乘以 100。该图显示了 HT 1080 细胞与 NIH 3T3 细胞间细胞侵袭率的比较，如图所示，HT 1080 细胞具有侵袭性，而 NIH 3T3 细胞则无侵袭性。在倒置荧光显微镜下观察细胞时，结果与酶标仪测得的结果一致。侵袭性较强的 HT 1080 细胞能够穿过 matrigel 并迁移通过未包被的膜；相比之下，非侵袭性的 NIH 3T3 细胞无法穿过 matrigel，但可迁移通过未包被的膜。我们刚刚向您展示了如何进行花状块肿瘤侵袭实验。在进行此操作时，重要的是保持培养板水平，并尽量减少气泡的形成，因为这些因素可能会影响您的实验结果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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