通过补体耗竭去除特定细胞群体

补体耗竭是一种快速、高效且经济的免疫细胞群体纯化方法。补体耗竭始于将单克隆IgM或IgG抗体加入细胞群体中，这些抗体可特异性靶向某一类细胞。在此示例中，我们将靶向T细胞以实现其耗竭。

随后加入补体系统，启动蛋白水解级联反应，导致T细胞死亡。然后通过离心洗涤和过滤去除死细胞和碎片。这种补体耗竭方法通常可消除95%至100%的目标细胞群。

大家好，我是Bonnie Dittle。我是位于密尔沃基的威斯康星州血中心血液研究所的一名研究人员。今天我将向您展示补体耗竭技术，这是一种快速且经济的特异性细胞群体耗竭方法。

在我的实验室中，我们使用该技术高度富集免疫细胞群体，随后将其用于多种生物测定实验，包括细胞活化和蛋白质表达分析。现在我们开始吧。在开始实验之前，准备0.5或1毫升的兔补体分装样品，并将其保存在-20或-80摄氏度的冰箱中。

务必将补体滴定至1:10至1:20之间的最佳稀释度。我们常规使用的补体商品化来源为Pereze Biologicals。在此实验中，小鼠和兔单克隆抗体通常可有效激活补体，但并非所有抗体均适用。IgM类抗体通常在介导补体依赖性细胞裂解方面效率最高。

IgG 抗体的效率位居第二，通常被选用，因为大多数单克隆抗体均为 IgG。每种抗体均需进行滴定，以确定其在每毫升 10 的 7 次方个细胞的细胞密度下的最佳使用浓度，该浓度需通过实验确定。大多数抗体的使用浓度范围为 0.1 至 10 微克/毫升。在去除脾脏 T 细胞时，我们使用针对 TH1 的特异性单克隆抗体。

开始补体耗竭时，将细胞稀释于含有5%热灭活胎牛血清的细胞培养基中，使起始细胞浓度为每毫升2×10⁷个细胞。例如，5×10⁷个细胞应稀释在2.5毫升培养基中。此细胞体积为最终体积的一半，因此其细胞浓度为耗竭过程中所用浓度（即每毫升1×10⁷个细胞）的两倍。

此时，保存最多 1 × 10⁶ 个细胞，以便在实验结束时对耗竭情况进行定量分析。此外，将所需量的补体在室温下解冻。我们发现，当使用 Pereze Biologicals 兔补体处理 5 × 10⁷ 个细胞时，1:15 的稀释比例是合适的，1.5 毫升冻存的 Eloqua 即足够使用。

现在向细胞悬液中加入适量的抗体并混匀。为了灭菌补体，使用低蛋白结合的注射器滤头过滤器。用一到两毫升培养基填充注射器。

在向五乘以十的七次方个细胞中添加补体之前，我们需要340毫升补体以进行1:15稀释。然后将补体直接过滤到含有细胞和抗体的试管中。现在调整试管中的终体积，使细胞浓度为每毫升一乘以十的七次方个细胞。

接下来，将细胞置于37摄氏度的水浴中孵育1小时。每15分钟需轻轻倒置混匀细胞一次。孵育结束后，以不影响细胞活力的转速离心细胞。

然后回到生物安全柜中，弃去上清液。接着用10毫升培养基将细胞洗涤两次。注意观察细胞碎片如何聚集，并有部分黏附在聚苯乙烯管壁上。

最后一次洗涤后，通过70微米无菌尼龙细胞滤网过滤细胞。最后，通过比较耗竭流式前后目标细胞群的情况，检测细胞纯度。

流式细胞术和免疫组织化学是实验前确定细胞纯度的首选方法。当使用一种高效激活补体的单克隆抗体时，第一轮补体耗竭可将目标细胞耗竭超过95%。例如，通过流式细胞术检测小鼠腹腔细胞制备物中αβ T细胞所占比例，我们发现，在使用抗CD51抗体进行补体耗竭后，αβ T细胞的比例为32.2%，而CD51表达于所有T细胞，但不表达于其他白细胞。TCRβ细胞群被减少了95%，最终浓度降至1.56%。

我刚刚向您展示了一种利用抗原特异性抗体进行补体耗竭以快速高效去除特定细胞群体的方法。进行该操作时，请务必在正式实验前通过预实验检测每种抗体的有效性，并对补体进行滴定。就这些。

感谢观看，祝您的实验顺利。