Name: 补消耗的特定细胞群的枯竭 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学习补体消耗技术用于高效纯化T细胞等免疫细胞群体。该方法利用单克隆抗体与补体系统实现95%以上靶细胞清除，为免疫学及细胞生物学研究提供快速经济的细胞分离方案。

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感谢 Sreemanti Basu 提供图1的数据。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI069358 和 BloodCenter 研究基金会支持。

A. 兔补体
<ol>
<li>兔补体储备液应在室温下解冻，然后分装为 0.5 和/或 1 ml 体积，于 -20 至 -80 °C 冻存以长期保存。</li>
<li>每批补体均应进行滴定，以确定最佳工作浓度。通常，1:10 至 1:20 的稀释比例为最佳。</li>
<li>兔补体在出售前并非始终经过预灭菌处理，因此应根据细胞的最终用途，在分装冻存时或添加至细胞前对补体进行过滤除菌。</li>
</ol>
B. 抗体选择
<ol>
<li>并非所有抗体都能有效激活补体，因此必须首先检测抗体的活性。</li>
<li>小鼠和大鼠的单克隆抗体均能有效激活补体。</li>
<li>IgM类抗体通常在补体介导的细胞裂解中效率最高，其次是IgG类抗体。不同物种中，适合激活补体的IgG亚型有所不同。</li>
<li>每种抗体都应在细胞密度为107 个细胞/毫升的条件下进行滴定，以确定最佳使用浓度。</li>
</ol>
C. 基本实验方案
<ol>
<li>将起始细胞浓度调整为5 x 107 个细胞/ml，使用含热灭活FCS的培养基。细胞终体积为起始体积的两倍。注意保留部分细胞，以便后续定量检测耗竭效果。</li>
<li>将每种抗体以预先确定的适当浓度或稀释比例加入细胞悬液中。通过轻柔颠倒充分混匀细胞。</li>
<li>计算所需补体的用量。在室温下解冻补体储备液。若补体未灭菌，需使用低蛋白吸附的一次性注射器滤器进行过滤灭菌。在加入补体前，先向注射器中加入数毫升培养基，然后直接过滤至含有细胞和抗体的离心管中。</li>
<li>调整离心管中的终体积，使细胞浓度达到1 x 107 个细胞/ml。</li>
<li>于37 °C孵育1小时，每隔15分钟轻轻混匀一次。</li>
<li>离心收集细胞，弃去上清液。</li>
<li>用培养基洗涤两次。细胞碎片会黏附在聚苯乙烯管壁上。可通过细胞筛网过滤或密度梯度离心法去除死细胞和碎片。</li>
<li>通过比较耗竭前后目标细胞群的比例来评估细胞纯度。流式细胞术和免疫组织化学是测定细胞纯度的两种有效方法。</li>
</ol>
代表性结果
当使用一种高效激活补体的单克隆抗体时，经过一轮处理后细胞耗竭率可超过95%。图1展示了这一结果：实验起始时小鼠脾细胞中αβ T细胞占32.2%，该比例通过流式细胞术检测TCRβ的表达（eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥）确定。我们使用针对Thy1的单克隆抗体耗竭T细胞，Thy1是一种由所有T细胞表达但其他白细胞不表达的蛋白。所用抗体为Y-19，一种大鼠IgG2c2。按照所述操作步骤处理后，TCRβ阳性细胞比例降至1.56%，耗竭率超过95%。
<img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="T细胞受体β表达在细胞去除前后的流式细胞术图谱，显示细胞数量变化。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 通过补体激活去除脾脏Thy1+ T细胞。 通过脾脏匀浆及红细胞裂解获得全部小鼠脾细胞。将预定浓度的抗Thy1抗体和幼兔补体加入脾细胞单细胞悬液中，使最终细胞浓度为1 × 107 个细胞/mL。37 °C孵育1小时后，细胞洗涤两次，并通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。通过流式细胞术比较去除前（左图）和去除后（右图）TCRβ+细胞的百分比，以评估去除效率。横线表示阳性染色，横线上方数字为阳性细胞百分比。

<ol><li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li>
</ol>

细胞群体的纯化是研究其功能时常见的实验步骤。本文介绍一种利用抗原特异性抗体和补体介导裂解技术快速高效去除特定细胞群体的方法。只要存在能够激活补体的、针对谱系特异性标志物的抗体，即可实现对该细胞群体的耗竭。本文以特异性识别Thy1的单克隆抗体为例，展示T细胞的耗竭过程；Thy1是一种几乎在所有T细胞群体中均表达的蛋白质。我们成功去除了超过95%的αβ T细胞，残余脾细胞的比例从68%提高至98%。该方法所达到的细胞纯度与其他纯化策略（包括流式细胞分选和磁珠分离）相当。补体介导的耗竭技术操作快速，一旦获得起始细胞群体，可在1.5小时内完成。该方法的另一优势在于，任何实验室均可开展，因其无需昂贵的仪器和试剂，仅需水浴锅和离心机等基本设备。兔源补体可从多家供应商以合理价格购得（见试剂表），许多单克隆抗体也可从ATCC购买并本地扩增，以控制成本。相比之下，流式细胞分选需要配备细胞分选功能的流式细胞仪，设备价格高达六位数，且需使用价格昂贵的荧光标记单克隆抗体。磁珠分离法成本适中，但仍需购买磁力架和磁珠，而这些耗材可能价格不菲；此外，某些磁珠分离方案还需额外购买层析柱。
补体介导的细胞耗竭应用中的主要障碍在于缺乏具有所需抗原特异性的补体激活型单克隆抗体。尽管人、小鼠和大鼠的抗体均具有结合补体的能力，但不同同种型之间的效率存在差异。虽然这三种物种的IgM在激活补体方面均非常高效，但IgG同种型的效果则各不相同。因此，每种单克隆抗体都必须首先通过预实验评估其补体激活效率。对于效率不够高的抗体，可进行两轮补体耗竭处理，而不会影响残留细胞群体的活力。为了节约成本，应通过滴定确定抗体的最佳有效浓度。此外，所用抗体无需纯化；杂交瘤上清液和腹水液同样有效，这对难以纯化的IgM抗体而言尤为便利。与抗体类似，补体也必须在预实验中进行滴定：补体浓度过高会导致非靶细胞群体活力下降。同样重要的是，孵育时间不得超过60分钟。
在我们的实验方案中，我们将抗体与补体共同孵育。然而，也可以先将细胞与抗体在 15–30 分钟内标记，随后在加入补体前进行洗涤。采用此策略时，务必在冰上进行抗体孵育，以防止细胞表面抗原的丢失，因为某些蛋白质会发生聚集（patching）和成帽（capping）或受体内化现象。尽管补体清除法效率很高，但与其他方法相比，其主要缺点是无法用于阳性筛选，因此难以获得特定的细胞亚群。例如，从滤泡性 B 细胞中纯化边缘区 B 细胞就较为困难，而这一分离最好通过流式细胞分选（FACS）实现。在此情况下，可利用补体激活来清除 T 细胞，从而减少需要分选的细胞数量。该策略可缩短分选时间，节省成本，并减轻对细胞的损伤。
由于特定细胞群体的纯化是常见的实验需求，已开发出多种策略。补体耗竭策略的主要优点在于成本低廉、技术操作简便且节省时间。

<table><tbody><tr><td>3-4 周龄幼兔补体</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31061-3</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Various</td><td>various</td><td>也可使用设定为 37 &amp;#x00B0;C 的培养箱。</td></tr></tbody></table>

通过补体耗竭去除特定细胞群体

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

免疫细胞群体的纯化通常是研究其独特功能所必需的。特别是实时荧光定量 PCR 和微阵列分析等分子生物学方法，要求分离出高纯度的细胞群体。常用的纯化策略包括荧光激活细胞分选（FACS）、磁珠分离法和补体介导的细胞清除法。在这三种策略中，补体介导的细胞清除法具有快速、成本低、对细胞温和以及细胞得率高的优势。补体系统由大量血浆蛋白组成，当被激活时，会启动一系列蛋白水解级联反应，最终形成膜攻击复合物，该复合物可在细胞表面形成孔道，导致细胞死亡。1经典的补体激活途径由IgM和IgG抗体启动，最初被描述为一种杀灭细菌的机制。随着单克隆抗体（mAb）的产生，补体级联反应可用于以抗原特异性方式裂解任何细胞群体。通过向起始细胞群体中加入能够固定补体的抗原特异性抗体和兔补体，即可实现补体级联介导的细胞耗竭。细胞在37°C下孵育一小时，随后通过两轮洗涤去除裂解的细胞。具有高效补体固定能力的单克隆抗体通常可耗竭95–100%的目标细胞群体。根据目标细胞群体的纯化策略，补体耗竭可用于细胞纯化，或用于富集细胞群体，以便后续采用其他方法进一步纯化。

为了有效研究免疫细胞群体的功能，通常需要对其进行纯化。补体耗竭法是一种快速且经济的技术，可用于分离高纯度的免疫细胞群体。

分离纯化免疫细胞群体通常是研究其独特功能所必需的步骤。特别是诸如……等分子学方法

补体耗竭是一种快速、高效且经济的免疫细胞群体纯化方法。补体耗竭始于将单克隆IgM或IgG抗体加入细胞群体中，这些抗体可特异性靶向某一类细胞。在此示例中，我们将靶向T细胞以实现其耗竭。随后加入补体系统，启动蛋白水解级联反应，导致T细胞死亡。然后通过离心洗涤和过滤去除死细胞和碎片。这种补体耗竭方法通常可消除95%至100%的目标细胞群。大家好，我是Bonnie Dittle。我是位于密尔沃基的威斯康星州血中心血液研究所的一名研究人员。今天我将向您展示补体耗竭技术，这是一种快速且经济的特异性细胞群体耗竭方法。在我的实验室中，我们使用该技术高度富集免疫细胞群体，随后将其用于多种生物测定实验，包括细胞活化和蛋白质表达分析。现在我们开始吧。在开始实验之前，准备0.5或1毫升的兔补体分装样品，并将其保存在-20或-80摄氏度的冰箱中。务必将补体滴定至1:10至1:20之间的最佳稀释度。我们常规使用的补体商品化来源为Pereze Biologicals。在此实验中，小鼠和兔单克隆抗体通常可有效激活补体，但并非所有抗体均适用。IgM类抗体通常在介导补体依赖性细胞裂解方面效率最高。IgG 抗体的效率位居第二，通常被选用，因为大多数单克隆抗体均为 IgG。每种抗体均需进行滴定，以确定其在每毫升 10 的 7 次方个细胞的细胞密度下的最佳使用浓度，该浓度需通过实验确定。大多数抗体的使用浓度范围为 0.1 至 10 微克/毫升。在去除脾脏 T 细胞时，我们使用针对 TH1 的特异性单克隆抗体。开始补体耗竭时，将细胞稀释于含有5%热灭活胎牛血清的细胞培养基中，使起始细胞浓度为每毫升2×10⁷个细胞。例如，5×10⁷个细胞应稀释在2.5毫升培养基中。此细胞体积为最终体积的一半，因此其细胞浓度为耗竭过程中所用浓度（即每毫升1×10⁷个细胞）的两倍。此时，保存最多 1 × 10⁶ 个细胞，以便在实验结束时对耗竭情况进行定量分析。此外，将所需量的补体在室温下解冻。我们发现，当使用 Pereze Biologicals 兔补体处理 5 × 10⁷ 个细胞时，1:15 的稀释比例是合适的，1.5 毫升冻存的 Eloqua 即足够使用。现在向细胞悬液中加入适量的抗体并混匀。为了灭菌补体，使用低蛋白结合的注射器滤头过滤器。用一到两毫升培养基填充注射器。在向五乘以十的七次方个细胞中添加补体之前，我们需要340毫升补体以进行1:15稀释。然后将补体直接过滤到含有细胞和抗体的试管中。现在调整试管中的终体积，使细胞浓度为每毫升一乘以十的七次方个细胞。接下来，将细胞置于37摄氏度的水浴中孵育1小时。每15分钟需轻轻倒置混匀细胞一次。孵育结束后，以不影响细胞活力的转速离心细胞。然后回到生物安全柜中，弃去上清液。接着用10毫升培养基将细胞洗涤两次。注意观察细胞碎片如何聚集，并有部分黏附在聚苯乙烯管壁上。最后一次洗涤后，通过70微米无菌尼龙细胞滤网过滤细胞。最后，通过比较耗竭流式前后目标细胞群的情况，检测细胞纯度。流式细胞术和免疫组织化学是实验前确定细胞纯度的首选方法。当使用一种高效激活补体的单克隆抗体时，第一轮补体耗竭可将目标细胞耗竭超过95%。例如，通过流式细胞术检测小鼠腹腔细胞制备物中αβ T细胞所占比例，我们发现，在使用抗CD51抗体进行补体耗竭后，αβ T细胞的比例为32.2%，而CD51表达于所有T细胞，但不表达于其他白细胞。TCRβ细胞群被减少了95%，最终浓度降至1.56%。我刚刚向您展示了一种利用抗原特异性抗体进行补体耗竭以快速高效去除特定细胞群体的方法。进行该操作时，请务必在正式实验前通过预实验检测每种抗体的有效性，并对补体进行滴定。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

补消耗的特定细胞群的枯竭

巨噬细胞在多种组织的稳态和病理过程中发挥核心作用。本文介绍的方法包括在体内耗竭巨噬细胞、从小鼠骨髓穿刺物中诱导极化巨噬细胞，以及将巨噬细胞过继转移至小鼠体内。这些技术有助于明确极化巨噬细胞在健康与疾病中的作用。...

小鼠巨噬细胞的耗竭与重建

本文介绍了两种用于检测抗红细胞抗体诱导补体活化的检测方法。与现有检测方法相比，其主要优势在于具有定量性且结果易于解读。...

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在体内生长阶段，人源肿瘤异种移植模型具有血管化特征，并被来源于小鼠的细胞浸润。in vivo...

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从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

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本方案详细描述了从白细胞滤器中获取CD34+造血祖细胞及其后续操作的全部步骤 体外...

去白细胞滤器来源的CD34+细胞作为研究巨核细胞分化与血小板形成的细胞来源

本文介绍了一种制备双乳液滴的方法，该液滴包封单个T细胞和一个癌细胞靶标，用于在单细胞水平上研究细胞杀伤作用。该方法能够在大量T细胞中同时定量检测细胞毒性分子和靶细胞的凋亡情况。...

基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

本文报道了一种利用人CD59/中介溶血素细胞清除工具选择性清除肾巨噬细胞以研究其再生的实验方案。该方法也可用于研究肾脏、肝脏和脂肪组织中其他细胞群体的功能与再生。...

利用人CD59/中介溶血素细胞清除工具快速耗竭肾巨噬细胞

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