慢病毒生产

该程序首先用慢病毒、质粒和病毒包装载体横切 2 9 3 个 T 细胞，至少孵育 48 小时后收获病毒上清液。snat 过滤，超速离心后用超速离心机浓缩。用 PBS 重悬病毒沉淀以获得病毒滴度，首先在完全培养基中稀释浓缩病毒，然后进行连续稀释以用慢病毒感染细胞。

大家好，我是来自加州大学旧金山分校糖尿病中心Michael McManus实验室的Shein Wong。我是迈克尔·麦克马纳斯。今天，我们将向您展示生产慢病毒的程序。

我们在实验室中使用该程序来制造用于 RNA 干扰的慢病毒。那么让我们开始吧。要开始此方案，请准备用于转染 2 9 3 T 细胞的 DNA。

首先，通过将 30 μL Fuji six 与 600 μL 无血清培养基混合，在 1.5 mL 试管中稀释 FU 基因 six 转染试剂。小心不要让 Fuji 碰到试管的侧面，因为您将试管送入培养基中，在室温下孵育 5 分钟。接下来，在管盖中，将 4 μg 慢病毒质粒与 1.33 μg 混合。

每三代病毒包装载体。慢病毒质粒含有 DNA。病毒将插入每个感染细胞的基因组中，而包装载体包含使扁豆病毒关闭盖子并通过倒置试管几次进行混合所需的所有其他蛋白质的基因。

在室温下孵育 DNA 和转染试剂 15 至 20 分钟。现在是时候用您制备的 DNA 转染 2 9 3 个细胞了，使用您提前 24 小时铺板并且在组织培养通风橱中达到 50% 至 70% 共流利度的细胞，将所有准备好的 DNA 移液到 2 9 3 板上，通过来回倾斜板轻轻混合， 将细胞放回培养箱中，让病毒生产继续 48 至 96 小时，然后再收获。在孵育过程中，2 9 3 细胞产生慢病毒，其基因组包含目标 DNA 的 RNA 拷贝。

现在是收集病毒的时候了。将细胞从培养箱中取出。在组织培养罩中准备好一个 0.4 或 5 微米的注射器过滤器、一个一次性 10 毫升注射器和一个 UltraClear Beckman 离心管。

使用一次性注射器去除上清液，上清液现在含有病毒。将 0.45 微米针式过滤器连接到尖端，并将病毒过滤到 UltraClear Beckman 离心管中。过滤器只允许病毒通过，不允许细胞通过，然后丢弃，孵育所有产生病毒的细胞。

将培养板、注射器和过滤器在 10% 漂白剂中浸泡 45 分钟。现在您已经收集并过滤了病毒，是时候先通过超速离心来浓缩病毒了。使用无血清 DMEM 将所有含病毒的试管平衡在 0.2 克以内。

接下来，将平衡离心管装入 SW 41 TI 或 SW 28 转子吊篮中。密封转子桶并将其挂在转子上。然后将转子放入超速离心机中。

在 SW 41 TI 转头中以 25， 000 RPM 或 SW 24， 000 转头的速度在 4 摄氏度下旋转病毒约 28 分钟。离心后，返回组织培养罩，倒置试管，将 SNAT 倒入含有 10% 漂白剂的容器中。使用 Kim 湿巾吸收沉淀周围的多余液体，并将试管倒置在方便的架子上不超过 5 分钟，直到您准备好重悬沉淀。

要重悬病毒沉淀，请使用过滤嘴向试管中加入 100 μL 无菌预过滤 PBS。然后上下移液约 20 次。将病毒在 4 度下放置过夜以完成重悬。

您可以将病毒制剂在 4 度下储存约一周，在零下 80 度下储存长达一年。请记住在丢弃前用 10% 漂白剂处理所有空管。如果您打算使用病毒制剂超过一周，它将保存在冰箱中。

制作 5 至 20 微升的最小等分试样以备将来实验使用，制作一份 3 至 5 微升的等分试样用于滴定冷冻，并将等分试样储存在大约零下 80 微升。下一步是确定病毒滴度。如果您在慢病毒质粒中加入了荧光报告基因，则感染的细胞将发出荧光，您可以使用流式细胞术确定病毒滴度。

首先，将 3 微升浓缩病毒稀释到 1.5 毫升完全培养基中，分 1 至 6 孔。在 96 孔板的单排中。以 100 μL 完全浓度对所有六个孔进行以下连续稀释，DM.To 第一个孔加入 100 μL 不含病毒的培养基。

这是您的未染色对照。对于第二个，将 100 微升稀释的病毒添加到第三个中。从第二个孔到第四个孔中加入 100 微升混合物。

从第三口井到第五口井加入 100 微升。从第四个井和第六个井中加入 100 微升。从第五个开始加入 100 微升。

最后，从第六个孔中取出 100 微升，丢弃并漂白，用 DMEM 使所有孔中的总体积达到 200 微升。每次稀释后，病毒浓度降低一半。请注意，这些只是建议的稀释度，应该适用于对大多数浓缩病毒进行滴度测定。

如果您的病毒滴度低或未浓缩，您可能需要调整稀释度。用 10% 漂白剂处理任何未使用的稀释病毒 45 分钟，然后丢弃到生物危害废物容器中。向六个孔中的每个孔中加入约 15， 000 个健康、活跃分裂的 2 9 3 个 T 细胞。

您可以使用单个 96 孔板对 16 次病毒制备进行滴定度测定，将孔加满至 200 μL，将细胞放回培养箱中，并让感染继续进行至少 48 小时。孵育后，使用流式细胞仪分析细胞荧光。您可以使用每孔荧光细胞的百分比来确定每毫升添加的病毒的滴度或感染性病毒颗粒的数量。

在解释流量时，使用以下公式计算每毫升的感染单位数。细胞仪结果。请注意，只有当感染细胞的每个细胞接受的病毒整合不超过一个时，才能实现准确的滴度计算。

为了确保这种情况，请使用感染率低于 15% 的细胞进行计算。感染率较高的细胞可能每个细胞都接受了多个病毒整合。第 2 步中建议的稀释度应在此感染范围内产生多个样本。

理想情况下，使用多个样品生成滴定图，从中可以计算最终滴定度。根据拟合线性线计算的公式可用于计算病毒滴度，但如有必要，您可以使用单个样品计算滴度。对于未浓缩的病毒，预计滴度为每毫升 10 倍至第 7 个转导单位，对于浓缩病毒，滴度为每毫升 10 至第八个转导单位的 1 乘以。

我们刚刚向您展示了在执行此程序时如何产生慢病毒。遵守所有生物安全法规并妥善处理废物非常重要。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。