人类胚胎干细胞核型分析用染色体铺展制备

引言。大家好。我们来自巴西法哈联邦大学的生物计量科学研究所。在本视频中，我们将制备人类胚胎干细胞的染色体铺展样本，以检测可能存在的染色体异常改变。尽管研究表明人类胚胎干细胞通常具有稳定的二倍体核型，但多项研究报道指出，根据培养条件的不同，这些细胞容易获得染色体异常，例如整条或部分染色体的增加。

体外对HASS的遗传完整性进行表征，对于胚胎发育研究和药物测试至关重要。此外，对于未来的治疗方案而言，染色体改变是一个切实存在的问题，因其常与致癌作用相关。现在，让我们开始吧。

用ate处理细胞。在此操作中，我们使用该物质。将八至九代细胞在F12培养基中培养，培养基中添加20%无血清替代物以及80至9克/毫升成纤维细胞生长因子。首先从培养箱中取出培养瓶，在超净工作台内加入coit，使其终浓度为0.1微克/毫升。

向培养基中加入秋水仙胺可诱导细胞停滞于有丝分裂期、静止期和中期。当染色体充分凝集并能在显微镜下更清晰地观察时，务必采用无菌操作技术以避免污染。加入秋水仙胺后，需将培养瓶妥善放置，并将细胞重新放回培养箱中继续培养。

孵育结束后固定细胞，但此时细胞尚未准备好进行固定。无需在无菌条件下操作。首先吸除培养基，完成后加入胰蛋白酶。

将 DTA 以 0.05% 的比例加入培养瓶中。务必加入足量的胰蛋白酶，使其足以覆盖细胞的底部表面。盖紧培养瓶，轻轻摇动以均匀分布。

将胰蛋白酶处理的细胞在室温下孵育五分钟。在室温孵育五分钟后，细胞应不再贴附于培养瓶底部，此时需通过添加含血清的培养基或轻柔地向细胞中加入血清来终止胰蛋白酶的消化作用。小心打开培养瓶的瓶盖，加入含血清的培养基或血清，使液体沿培养瓶底部流下，覆盖细胞表面。

用移液器将细胞悬液上下吹打数次，以充分分散细胞。将细胞转移至15毫升锥形管中，但在转移前需确保细胞已充分解离，悬液中无可见的细胞团块。完成转移后，盖紧管盖并离心。

将悬液折叠静置五分钟。离心后在800 RPM条件下，管底应出现细胞团块。注意不要扰动细胞团块。

使用 P1000 移液器吸出上清液，直至剩余体积约为 200 微升。此体积适中，适合重悬。将沉淀用 Resus 重悬。

悬浮细胞。用手指轻轻弹击试管数次。通过检查溶液中是否仍有细胞团块存在，确保细胞已充分悬浮。

此时，溶液应呈浑浊状。接下来，需要将5毫升预热至37摄氏度的75毫摩尔浓度的氯化钾溶液缓慢加入试管底部，同时旋转试管。低渗溶液必须极其缓慢地加入。

加入前 3 毫升后，盖紧管盖。用低渗溶液通过轻轻水平旋转试管并缓慢转动的方式，匀浆细胞悬液。

以相同方式缓慢加入剩余的两毫升。低渗溶液的作用是增加细胞体积，使染色体得以解聚。因此，整个五毫升溶液加入后，将试管盖紧，并在37摄氏度水浴中孵育15分钟，此孵育过程对于获得良好的染色体铺展至关重要。

15分钟孵育期结束后，将试管从水浴中取出。此时，应在通风橱中操作，因为固定液产生的烟雾具有毒性。如果无法使用通风橱，务必在通风良好的区域进行操作。

取下管盖，加入三滴固定液。该固定液为甲醇与乙酸按3:1体积比配制而成，应在使用当天新鲜配制。盖紧管盖，轻轻将试管水平旋转，先顺时针方向缓慢转动，再逆时针方向缓慢转动。

将离心管在800 RPM条件下离心五分钟，离心过程中不得使用刹车。离心结束后，必须让离心机转子缓慢停止，以防止因细胞摩擦导致样品损失，这一点非常重要。离心后，该心上清液体积约为200 µL。

为使细胞充分悬浮，用手指轻轻弹击离心管数次。通过观察是否存在细胞团块，确认细胞是否已充分悬浮。加入前3毫升固定液后，在旋转离心管的同时，沿管壁缓慢加入剩余的固定液，总体积达3毫升。

将试管 T 盖紧，并通过轻轻水平转动试管并缓慢旋转，仔细地混匀细胞悬液。确保至少完成一次完整的旋转。为使混匀过程更充分，可适当增加旋转次数。

沿管壁加入2 mL固定液以收集细胞。将细胞悬液在4°C下过夜保存。固定后的细胞可在4°C的固定液中保存数月。

第二天洗涤细胞时，将细胞在800 rpm条件下离心5分钟，不刹车。弃去上清液，残留约200微升。通过用手指轻弹管壁数次重悬沉淀。

确保细胞已充分分散，悬液中无可见的细胞团块。沿管壁缓慢加入5 mL新鲜固定液。盖紧管盖，通过轻轻水平转动并缓慢旋转试管来混匀细胞悬液。

除了保护细胞外，固定液还能溶解脂质并变性蛋白质，从而使得染色体易于铺展。在800 RRP M条件下离心试管5分钟，不刹车。制备载玻片时，在离心步骤后需保留足够量的溶液以充分混匀细胞悬液。

液体的体积可能取决于细胞的数量。用手指轻轻弹动离心管数次。通过观察是否存在肉眼可见的细胞团块，确保细胞充分分散。

此时，应将目标物加入溶液中，用移液器沿该玻片表面平行移动，将 20 至 30 微升细胞悬液滴加到洁净干燥的载玻片上。随着固定液的蒸发，玻片表面立即变得粗糙。将玻片面朝上暴露于热水蒸气中 30 秒，以促使细胞膨胀。

分析这些光线。制备好这些载玻片后，使用相差显微镜并结合10倍和高倍物镜观察，以确定细胞密度是否适合进一步分析。此载玻片即为细胞密度过高的一个示例。

请注意，细胞核过于密集地靠近中期 spreads。如果某张载玻片上的细胞密度过高，则需通过加入更多固定液来稀释细胞悬液。此载玻片显示了理想的细胞密度。

请注意，中期分裂相应分散良好且相互分离。一旦获得细胞密度最佳的载玻片，便不能再进行染色和分析。应避免选择靠近细胞核的中期分裂相，因为染色体可能被遮蔽或无法观察到。

寻找呈圆形的中期细胞，但需确保没有染色体从中期板向外伸展。应选择圆形且分离良好的中期细胞。如后续幻灯片所示，应尽量避免将因染色体过度铺展而产生的假性染色体增加，或因染色体伸直而导致的假性染色体丢失，误判为真实的染色体异常。

我们希望本视频能对您后续的实验有所帮助。如果您有任何疑问，请随时与我们联系。祝您实验顺利，取得成功。