为核型分析人类胚胎干细胞的染色体蔓延制备
September 4th, 2009
核型分析是一种简单而有用的技术，广泛用于检测遗传变异。在这里，我们描述了一个一步一步监测文化在保持这些细胞的染色体状态的人类胚胎干细胞的染色体蔓延的准备协议。
我们来自巴西法哈联邦大学生物特征科学研究所。在本视频中，我们将准备人类胚胎干细胞的染色体扩散，以检测可能的奇迹染色体改变。尽管人类胚胎干细胞已被证明具有稳定的部署核型，但男性研究报告说，根据 keter 条件，它们变得容易获得染色体异常，例如添加整个或部分染色体。
考虑到 HASS 的体外遗传完整性表征是必不可少的两个胚胎发生研究和药物测试，这一点至关重要。此外，对于未来的治疗方案，染色体变化是一个真正的问题，因为它通常与致癌作用有关。那么让我们开始吧。
用 ate 处理细胞 在这个过程中，我们使用它。第 8 至 9 种在 F 12 中线固化，补充有 20% 的无计数血清替代物和每毫升 80 至 9 克成纤维细胞生长因子。首先从培养箱中取出培养瓶，在层流罩下，加入最终浓度为 0.1 μg/mL。
将 Coit 添加到中位会诱导 mitoka、rest 和 metaphase。当染色体浓缩良好并且更容易在显微镜下观察时，请务必使用无菌技术以避免污染。添加后，coit 保留培养瓶并将细胞放回培养箱中。
在孵育期后固定细胞，此时细胞尚未准备好固定。没有必要在无菌条件下工作。首先吸出中位数，完成后，添加 tryin。
DTA 为培养瓶的 0.05%。确保添加足够的 tryin 足以覆盖细胞的底面。盖上烧瓶并轻轻火箭均匀分布。
胰蛋白酶允许细胞在 Rome 温度下孵育 5 分钟。在 Rome 温度下孵育 5 分钟后，细胞不应再附着在培养瓶的底部，您需要通过添加含有 cutter median 的血清或轻轻向细胞中加入血清来灭活胰蛋白酶。小心地取下培养瓶的盖子，加入 Cutter median 或血清，让液体沿着培养瓶的底部覆盖在细胞上。
上下移液细胞悬液数次以完全解离细胞。将细胞转移到 15 毫升锥形管中，但在此之前，请确保细胞已充分解离，并且悬浮液不包含任何可见的细胞团块。完成转移盖后，管子和离心管。
将悬架折叠五分钟。离心后 800 RPM 时，试管底部应有一个细胞调色板。小心不要打扰单元格调色板。
使用 P 1000 吸出浆液，直到只剩下大约 200 微升。这是 Resus 的体积中位数。暂停上颚到 Resus。
暂停味觉。用手指轻轻轻弹管子数次。通过检查溶液中是否没有细胞团块，确保细胞已充分悬浮。
此时，解决方案应该是 tur。接下来，您需要加入 5 毫升 75 毫摩尔氯化钾溶液，预热至 37 摄氏度。当您旋转试管时，应通过下面的试管非常缓慢地加入低渗溶液。
添加前 3 毫升后。小心地拧紧管子。用低渗溶液匀浆 轻轻水平转动试管并缓慢布线。
它以与以前相同的方式缓慢添加剩余的两毫升。低渗溶液的建议是增加细胞体积以使染色体解开缠结。因此，当加入整个 5 毫升时，这个孵育期对于获得良好的染色体扩散至关重要，盖上试管并将细胞在法定 7 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟。
15 分钟的孵育期完成后，从水浴中取出试管。此时，您可能会在固定液产生的烟雾是有毒的烟雾山上工作。如果您无法使用通风橱，请务必在通风良好的区域工作。
取下试管盖，加入三滴固定液。这是甲醇和乙酸的三比一 R，应在使用当天制备。盖紧管子，轻轻地水平转动管子，同时慢慢旋转管子，先顺时针旋转，然后逆时针旋转。
将试管以 800 RPM 的速度离心 5 分钟，不要破裂。离心后，允许旋转循环缓慢停止，以防止细胞磨损导致材料损失，这一点非常重要。这种有氧运动大约有 200 个。
为了悬浮上颚，用手指轻轻轻弹管子几次。通过检查是否没有剩余的细胞团块，确保细胞已充分悬浮。溶液 在 3 毫升的固定液缓慢地靠近管壁，同时旋转管子后，加入前 3 毫升。
盖紧管 T 并通过轻轻水平转动管子并缓慢旋转来小心地匀浆细胞悬液。确保至少旋转一整圈。为了最大限度地利用此混合过程，请添加更多。
在浴缸壁旁加入 2 毫升固定液，以将细胞向下吸收。将细胞悬液在 4 摄氏度下储存过夜。这种固定细胞可以在 4 摄氏度的固定液中储存数月。
第二天，以800 RP 离心洗涤细胞 5 分钟，不间断。丢弃至饱和状态，以约 200 微升的浓度生活。举。用手指轻弹试管数次，悬浮沉淀。
确保细胞已很好地关联，并且悬浮液不包含任何可见的细胞团块。在管壁旁缓慢加入 5 毫升新鲜固定液。盖上管子，在缓慢旋转管的同时轻轻水平转动管子并使细胞均质化。
除了保护其中的细胞外，还会说明固定液，去除脂质，然后去除 aist 蛋白，从而使染色体容易扩散。离心食品，将试管以 800 RRP M 的速度放置 5 分钟，不得中断。制备载玻片 在离心步骤中，留下足够量的溶液以使细胞上颚匀浆。
此液体量可能取决于细胞的数量。用手指轻轻轻弹管子几次。通过检查是否没有可视的细胞聚集，确保细胞关联良好。
此时，应将溶液靶向添加，将 20 至 30 μL 细胞悬液移动到干净、干燥的载玻片上，方法是将移液管平行于该轻质表面。随着固定液蒸发，光的表面立即变得颗粒状。将此灯面朝上暴露在这种热水蒸汽中 30 秒，以使细胞爆炸。
分析这些灯光。准备这些载玻片后，使用 10 和 furry 物镜在相差显微镜下进行分析，以查看细胞密度是否适合进一步分析。这张幻灯片是一个过于集中的例子。
请注意，细胞核太接近中期扩散。如果您的载玻片中的细胞密度太高，则通过添加更多固定液来悬浮 lut 细胞。本幻灯片显示了所需的单元密度。
请注意，中期扩散物分散良好，分离。一旦获得具有最佳细胞密度的玻片，就无法对其进行染色和分析。避免选择靠近细胞核的中期，因为染色体可能会隐藏或挡住视线。
寻找圆形的中期，但要确保没有染色体直接从中期 YO 两个选择圆形且分离良好的中期。如下面的幻灯片所示，您尽量避免将错误的 IES 报告为另外两个传播产生的染色体增益。将它们混合在一起，或者由直染色体产生的染色体丢失。
我们希望该视频对您进一步的实验有所帮助。如果您有任何疑问，请随时与我们联系。所以享受自己，祝你好运。
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概述
本文介绍了一种用于准备人类胚胎干细胞染色体涂片以监测染色体状态的协议。染色体核型分析对于检测细胞培养过程中可能出现的遗传改变至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 细胞生物学
- 干细胞研究
背景
- 人类胚胎干细胞在某些培养条件下可能表现出染色体异常。
- 维护遗传完整性对于胚胎发生研究和药物测试至关重要。
- 染色体变化与潜在的致癌性相关。
- 这些细胞的表征对于未来的治疗应用至关重要。
研究目的
- 提供人类胚胎干细胞染色体核型分析的详细协议。
- 监测培养细胞中的染色体稳定性。
- 强调干细胞研究中遗传完整性的重要性。
使用的方法
- 从人类胚胎干细胞中准备染色体涂片。
- 通过染色体核型分析监测染色体状态。
- 评估培养细胞中的遗传改变。
- 分析潜在的染色体异常。
主要结果
- 展示了染色体核型分析协议的有效性。
- 识别了培养的人类胚胎干细胞中的染色体改变。
- 洞察了在不同条件下核型的稳定性。
- 对干细胞在治疗背景中的使用有启示作用。
结论
- 染色体核型分析是监测干细胞遗传完整性的有价值工具。
- 了解染色体稳定性对于安全的治疗应用至关重要。
- 需要进一步研究探讨染色体异常的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monitoring chromosomal stability in human embryonic stem cells is critical for ensuring reliable preclinical models and reducing mechanistic ambiguity in drug testing. Karyotyping provides predictive confidence by detecting genetic alterations that could compromise cellular physiology or indicate carcinogenic risk. Routine assessment supports risk-adjusted decision-making in stem cell-based therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic integrity to validate therapeutic hypotheses in pluripotent models.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying karyotypic alterations linked to culture-induced instability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-quality chromosome spreads for G-banding, FISH, SKY, or CGH analysis to enable reliable genetic screening.
- Operational Value: Standardizes preparation through defined hypotonic treatment and fixation steps to ensure reproducibility across passages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by monitoring chromosomal status every 5 passages to detect translocations and aneuploidies.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by preserving genetic stability.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a quality control checkpoint for hESC lines prior to downstream applications in disease modeling or compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming karyotypic stability before initiating mechanistic or phenotypic studies.
- Screening: Enables assay readiness by providing genetically validated cell populations for consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative cytogenetic outputs via karyotyping to compare culture conditions and passage effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring genetic integrity is maintained across expansion and differentiation stages.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable genetic QC platform applicable across multiple hESC lines and research projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, sterile technique, and cytogenetic preparation.
- Needs access to centrifuge, water bath, hypotonic solution (KCl), fixative (methanol:acetic acid), and phase contrast microscope.
- Demands standardization of timing, reagent volumes, and fixation protocols across users and labs.
- Must account for variability in cell density and clumping that affects spread quality.
- Limited by dependence on optimal metaphase capture and slide preparation for accurate analysis.
