Name: 为核型分析人类胚胎干细胞的染色体蔓延制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学习制备人类胚胎干细胞染色体涂片的方法，用于核型分析监测遗传稳定性。该技术可检测培养过程中的染色体异常，确保细胞遗传完整性，为胚胎发育研究和药物测试提供可靠支持。

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仪器
<ul>
 <li>组织培养孵育箱，37°C，5% CO2</li>
 <li>离心机</li>
 <li>移液器套装（1000 μL，100 μL）</li>
 <li>37°C 水浴锅</li>
 <li>90°C 水浴锅，用于提供热水蒸汽</li>
 <li>相差显微镜</li>
</ul>
第一步
用秋水仙胺处理细胞
在此实验中，我们使用了培养在经丝裂霉素C（Sigma）灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（mEF）上的H9人胚胎干细胞系，并在添加了20%敲除血清替代物（KSR，Gibco）和8 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF-2，R&amp;D）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中维持培养。
为了获得大量的中期分裂相，建议使用有丝分裂指数较高的培养物，其中含有大量正在分裂的细胞。
<ol>
<li>从培养箱中取出培养瓶，在超净工作台中加入秋水仙胺，使其终浓度为0,1μg/mL。</li>
<li>将培养瓶放回培养箱，孵育3小时，使抑制剂诱导细胞发生中期有丝分裂阻滞，此时染色体高度凝集，可在显微镜下清晰观察。</li>
</ol>
固定细胞
<ol start="3">
<li>吸出培养基，加入足量的0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液以覆盖细胞表面。室温孵育5分钟，然后通过添加含血清的培养基或直接向细胞中加入血清来终止酶反应。
 注意：必须确保获得单细胞悬液，以得到良好的中期分裂相。</li>
<li>将细胞转移至15 mL离心管中，在122 g 条件下离心5分钟。</li>
<li>弃去上清液，保留约200 mL，通过轻敲管底轻轻重悬沉淀，如视频所示。确保细胞充分分散，溶液中无可见的细胞团块。</li>
<li>接下来需沿管壁缓慢加入5 mL预热至37°C的低渗溶液（75 mM KCl）。首先加入3 mL，将离心管轻轻倾斜或倒置至水平位置以混匀细胞与低渗溶液，然后加入剩余的2 mL，并在37°C下继续孵育15分钟。
 注意：此时低渗溶液会导致细胞体积增大，有助于染色体解聚。孵育时间对获得良好的染色体铺展至关重要。若时间过长，细胞膜可能过早破裂，导致染色体丢失；若时间过短，则因细胞膜未充分破裂而难以获得染色体铺展。</li>
<li>加入3滴固定液（甲醇/冰醋酸 3:1），轻轻倒置离心管使固定液与细胞混匀，然后以122 g 离心5分钟，离心过程中不得使用刹车。
 注意：固定液应现配现用。
 注意：离心时必须不使用刹车，以避免细胞损伤，防止样本损失。</li>
<li>弃去上清液，保留约200 mL，通过轻敲管底轻轻重悬沉淀。
 注意：再次确认细胞充分分散，溶液中无可见的细胞团块。</li>
<li>沿管壁缓慢加入前3 mL固定液，同时旋转离心管。将离心管倒置至水平位置以混匀细胞，然后继续沿管壁加入另外2 mL固定液，使细胞充分沉淀。4°C过夜保存。
 注意：固定后的细胞可在4°C的固定液中保存数月。固定液不仅保护细胞处于肿胀状态，还可去除脂质并使蛋白质变性。这些变化使细胞膜变得脆弱，从而有利于染色体的铺展。</li>
</ol>
清洁载玻片
在开始制备染色体铺片之前，请确保载玻片已彻底清洁，否则可能导致部分细胞核以及中期相丢失。如果计划进行任何杂交技术操作，此步骤尤为重要9。
<ol>
 <li>将载玻片放入盛有6M HCl的烧杯中，在室温下处理至少3小时。</li>
 <li>处理结束后，用流动的自来水冲洗载玻片10分钟。</li>
 <li>用蒸馏水漂洗载玻片，并在室温下自然晾干。</li>
 <li>此时载玻片可保存在96%乙醇中，在使用前立即用无绒布擦干。</li>
</ol>
注意：对于 原位 杂交方法中，载玻片在96%乙醇中存放不得超过2天
第二步
洗涤细胞
<ol start="10">
<li>次日，以 122 g 离心细胞 5 分钟，离心过程中不刹车。</li>
<li>弃去上清液，保留约 200 ml。轻轻弹击管壁重悬细胞沉淀，然后一边缓慢旋转离心管，一边沿管壁缓慢加入 5 ml 新鲜配制的固定液（甲醇/冰乙酸 3:1）。重复此洗涤步骤 2 次，共洗涤 3 次。 
注意：固定液应现配现用。</li>
</ol>
准备载玻片
<ol start="12">
<li>在最后一次离心步骤中，保留足够量的溶液以重悬细胞沉淀，从而获得适中的细胞密度用于制片（见图1）。</li>
<li>将20–30 μL细胞悬液加至洁净干燥的载玻片上，移液时使枪头非常接近并平行于玻片表面。随着固定液的挥发，玻片表面会变得粗糙。</li>
<li>立即将在空气中正面向上的玻片置于热水蒸气（90°C）中30秒，使细胞膨胀破裂。
 注意：此时固定液中的甲醇挥发，导致乙酸浓度升高，结合水分共同促进染色体铺展。</li>
<li>使用相差显微镜观察，以确认细胞浓度和分布是否良好（见图1）。</li>
<li>此时载玻片已准备好，可用于细胞遗传学方法检测染色体组型，如G显带（吉姆萨染色）、FISH、SKY或CGH。</li>
</ol>
重要提示
如何选择合适的中期细胞进行分析
选择圆形且孤立的中期分裂相（图2D），可避免将假性非整倍体误判为因两个或多个染色体分散重叠而导致的染色体增多，或因染色体丢失而导致的染色体减少。因此，应避免选择靠近细胞核的中期分裂相，因为部分染色体可能被细胞核遮挡（图2A和2B）。此外，应寻找呈圆形的中期分裂相，并确保没有任何染色体与中期分裂相分离（图2C）。
饲养细胞与hESC核型
对于G显带和SKY分析，hESC培养中的饲养细胞不会干扰分析结果，因为饲养细胞处于非分裂状态（经丝裂霉素C或照射灭活），不会进入中期分裂相群体。然而，在对间期细胞核进行FISH技术分析时，建议在胰酶消化前先手动收集克隆，以将hESC群体与饲养细胞分离。
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="显微镜图像比较细胞培养；图A显示分散的细胞，图B突出显示克隆集落。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 图 1： 如何判断载玻片上合适的细胞密度。10倍物镜下的相差显微镜图像。（A）细胞密度过高。箭头指向与细胞核距离过近的中期分裂相。（B）细胞密度适中的载玻片。圆圈标示出与细胞核或其他中期分裂相分离的独立中期分裂相。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="中期染色体的荧光显微镜观察，DNA染色方法，遗传学研究分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2：如何选择合适的中期相进行分析。染色体经DAPI染色后，使用荧光显微镜在100倍物镜下获取图像。（A）（B）应避免靠近细胞核的中期相（箭头所示）；（C）以及非圆形且染色体分散的中期相（圆圈所示）；（D）圆形的中期相是适合用于分析的良好中期相。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">点击此处</a>查看图2的放大版本。

<ol><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li>
<li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li>
<li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li>
<li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li>
<li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li>
<li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li>
<li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li>
<li>Robin-Wesselschmidt, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobin-Wesselschmidt%2C+JL+%22Human+Stem+Cell+Manual%22">Human Stem Cell Manual</a>. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).</li>
<li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRooney%2C+DE+%22Human+Cytogenetics%22">Human Cytogenetics</a>. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeslop-Harrison%2C+P+%22Practical+in+situ+hybridization%22">Practical in situ hybridization</a>. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

染色体铺片的制备是通过常规技术（如G显带）以及更复杂的技术（如FISH、SKY和CGH）对胚胎干细胞遗传状态进行成功分析的关键步骤。
通过调整秋水仙胺孵育时间（取决于细胞周期长度），该操作可用于多种细胞类型。对于胚胎干细胞集落，我们孵育3小时，而对于类胚体（EB），孵育时间可长达6小时。
在处理细胞聚集体（如类胚体）时，需要充分解离以获得单细胞悬液。在此情况下，经过胰蛋白酶消化和机械解离后，可使用40μm尼龙细胞滤网（BD Biosciences），然后继续后续操作步骤（从“操作步骤”部分的第4步开始）。
在本实验方案中需注意，应将细胞悬液“紧贴”载玻片滴加，以避免染色体过度铺展，从而减少人为假象的产生。
我们认为，该实验方案不仅可被从事胚胎干细胞研究的实验室常规应用，也可为其他致力于研究各类干细胞中染色体不稳定性问题的研究人员提供一种有用且简便的工具。

<table><tbody><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>秋水仙胺 Karyo MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Isofar</td><td>721</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Isofar</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Isofar</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>104.931.000</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Bioslide</td><td>7105-1</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

人类胚胎干细胞核型分析用染色体铺展制备

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

尽管人类胚胎干细胞（hESC）已被证明具有稳定的二倍体核型 1许多研究报道，根据培养条件的不同，细胞容易获得染色体异常，例如整条或部分染色体的增加。事实上，在长期培养过程中，当使用酶法或化学解离方法时，可观察到核型改变。 2,3,4，而通过手工解剖法对克隆进行传代可维持稳定的核型 5此外，环境的改变（例如去除饲养层细胞）似乎也会损害人类胚胎干细胞的遗传完整性 3,6. 一旦染色体改变可能影响细胞生理学，对人胚胎干细胞遗传完整性的表征就显得尤为重要 在 体外 考虑到人胚胎干细胞（hESC）是胚胎发生研究和药物测试中的重要工具，这一点至关重要。此外，对于未来的治疗应用而言，染色体改变是一个实际问题，因其常与致癌作用相关。
本文展示了一种简单且实用的方法，用于制备高质量的染色体铺展样本，以便后续通过G显带、FISH、SKY或CGH技术对染色体组进行分析7,8。我们建议每传代5次定期检查一次染色体状态，以监测易位和非整倍性等异常的出现情况。
Priscila Britto 和 Rafaela Sartore 对本论文的贡献相同。

核型分析是一种简单且实用的技术，广泛用于检测遗传变异。本文介绍了一种逐步操作的实验方案，用于制备人胚胎干细胞的染色体铺展样本，以监测在培养条件下维持的人胚胎干细胞的染色体状态。

尽管人类胚胎干细胞（hESC）已被证明具有稳定的二倍体核型1，但许多研究报道，其核型稳定性取决于培养条件……

引言。大家好。我们来自巴西法哈联邦大学的生物计量科学研究所。在本视频中，我们将制备人类胚胎干细胞的染色体铺展样本，以检测可能存在的染色体异常改变。尽管研究表明人类胚胎干细胞通常具有稳定的二倍体核型，但多项研究报道指出，根据培养条件的不同，这些细胞容易获得染色体异常，例如整条或部分染色体的增加。体外对HASS的遗传完整性进行表征，对于胚胎发育研究和药物测试至关重要。此外，对于未来的治疗方案而言，染色体改变是一个切实存在的问题，因其常与致癌作用相关。现在，让我们开始吧。用ate处理细胞。在此操作中，我们使用该物质。将八至九代细胞在F12培养基中培养，培养基中添加20%无血清替代物以及80至9克/毫升成纤维细胞生长因子。首先从培养箱中取出培养瓶，在超净工作台内加入coit，使其终浓度为0.1微克/毫升。向培养基中加入秋水仙胺可诱导细胞停滞于有丝分裂期、静止期和中期。当染色体充分凝集并能在显微镜下更清晰地观察时，务必采用无菌操作技术以避免污染。加入秋水仙胺后，需将培养瓶妥善放置，并将细胞重新放回培养箱中继续培养。孵育结束后固定细胞，但此时细胞尚未准备好进行固定。无需在无菌条件下操作。首先吸除培养基，完成后加入胰蛋白酶。将 DTA 以 0.05% 的比例加入培养瓶中。务必加入足量的胰蛋白酶，使其足以覆盖细胞的底部表面。盖紧培养瓶，轻轻摇动以均匀分布。将胰蛋白酶处理的细胞在室温下孵育五分钟。在室温孵育五分钟后，细胞应不再贴附于培养瓶底部，此时需通过添加含血清的培养基或轻柔地向细胞中加入血清来终止胰蛋白酶的消化作用。小心打开培养瓶的瓶盖，加入含血清的培养基或血清，使液体沿培养瓶底部流下，覆盖细胞表面。用移液器将细胞悬液上下吹打数次，以充分分散细胞。将细胞转移至15毫升锥形管中，但在转移前需确保细胞已充分解离，悬液中无可见的细胞团块。完成转移后，盖紧管盖并离心。将悬液折叠静置五分钟。离心后在800 RPM条件下，管底应出现细胞团块。注意不要扰动细胞团块。使用 P1000 移液器吸出上清液，直至剩余体积约为 200 微升。此体积适中，适合重悬。将沉淀用 Resus 重悬。悬浮细胞。用手指轻轻弹击试管数次。通过检查溶液中是否仍有细胞团块存在，确保细胞已充分悬浮。此时，溶液应呈浑浊状。接下来，需要将5毫升预热至37摄氏度的75毫摩尔浓度的氯化钾溶液缓慢加入试管底部，同时旋转试管。低渗溶液必须极其缓慢地加入。加入前 3 毫升后，盖紧管盖。用低渗溶液通过轻轻水平旋转试管并缓慢转动的方式，匀浆细胞悬液。以相同方式缓慢加入剩余的两毫升。低渗溶液的作用是增加细胞体积，使染色体得以解聚。因此，整个五毫升溶液加入后，将试管盖紧，并在37摄氏度水浴中孵育15分钟，此孵育过程对于获得良好的染色体铺展至关重要。15分钟孵育期结束后，将试管从水浴中取出。此时，应在通风橱中操作，因为固定液产生的烟雾具有毒性。如果无法使用通风橱，务必在通风良好的区域进行操作。取下管盖，加入三滴固定液。该固定液为甲醇与乙酸按3:1体积比配制而成，应在使用当天新鲜配制。盖紧管盖，轻轻将试管水平旋转，先顺时针方向缓慢转动，再逆时针方向缓慢转动。将离心管在800 RPM条件下离心五分钟，离心过程中不得使用刹车。离心结束后，必须让离心机转子缓慢停止，以防止因细胞摩擦导致样品损失，这一点非常重要。离心后，该心上清液体积约为200 µL。为使细胞充分悬浮，用手指轻轻弹击离心管数次。通过观察是否存在细胞团块，确认细胞是否已充分悬浮。加入前3毫升固定液后，在旋转离心管的同时，沿管壁缓慢加入剩余的固定液，总体积达3毫升。将试管 T 盖紧，并通过轻轻水平转动试管并缓慢旋转，仔细地混匀细胞悬液。确保至少完成一次完整的旋转。为使混匀过程更充分，可适当增加旋转次数。沿管壁加入2 mL固定液以收集细胞。将细胞悬液在4°C下过夜保存。固定后的细胞可在4°C的固定液中保存数月。第二天洗涤细胞时，将细胞在800 rpm条件下离心5分钟，不刹车。弃去上清液，残留约200微升。通过用手指轻弹管壁数次重悬沉淀。确保细胞已充分分散，悬液中无可见的细胞团块。沿管壁缓慢加入5 mL新鲜固定液。盖紧管盖，通过轻轻水平转动并缓慢旋转试管来混匀细胞悬液。除了保护细胞外，固定液还能溶解脂质并变性蛋白质，从而使得染色体易于铺展。在800 RRP M条件下离心试管5分钟，不刹车。制备载玻片时，在离心步骤后需保留足够量的溶液以充分混匀细胞悬液。液体的体积可能取决于细胞的数量。用手指轻轻弹动离心管数次。通过观察是否存在肉眼可见的细胞团块，确保细胞充分分散。此时，应将目标物加入溶液中，用移液器沿该玻片表面平行移动，将 20 至 30 微升细胞悬液滴加到洁净干燥的载玻片上。随着固定液的蒸发，玻片表面立即变得粗糙。将玻片面朝上暴露于热水蒸气中 30 秒，以促使细胞膨胀。分析这些光线。制备好这些载玻片后，使用相差显微镜并结合10倍和高倍物镜观察，以确定细胞密度是否适合进一步分析。此载玻片即为细胞密度过高的一个示例。请注意，细胞核过于密集地靠近中期 spreads。如果某张载玻片上的细胞密度过高，则需通过加入更多固定液来稀释细胞悬液。此载玻片显示了理想的细胞密度。请注意，中期分裂相应分散良好且相互分离。一旦获得细胞密度最佳的载玻片，便不能再进行染色和分析。应避免选择靠近细胞核的中期分裂相，因为染色体可能被遮蔽或无法观察到。寻找呈圆形的中期细胞，但需确保没有染色体从中期板向外伸展。应选择圆形且分离良好的中期细胞。如后续幻灯片所示，应尽量避免将因染色体过度铺展而产生的假性染色体增加，或因染色体伸直而导致的假性染色体丢失，误判为真实的染色体异常。我们希望本视频能对您后续的实验有所帮助。如果您有任何疑问，请随时与我们联系。祝您实验顺利，取得成功。

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尽管增殖性多倍体细胞对于分析多倍体细胞的染色体不稳定性是必需的，但从非转化的人类细胞中构建此类细胞并不容易。本报告描述了从正常人成纤维细胞中建立无二倍体细胞群的增殖性四倍体细胞的相对简便的方法。...

从非转化人成纤维细胞建立增殖性四倍体细胞

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已知哺乳动物的卵子发生过程容易出错，尤其是由于染色体错误分离所致。本文描述了小鼠减数分裂前期、中期I和中期II阶段卵母细胞的染色质铺展制备方法。这些基础技术可用于研究哺乳动物卵子发生过程中染色质结合蛋白及染色体形态的变化。...

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