使用蛋白酶荧光检测试剂盒测定蛋白酶活性

本方案首先在微量离心管中加入孵育缓冲液、FXI 酪蛋白溶液以及含有目标蛋白酶的样品，轻轻混匀后于 37 °C 避光孵育 60 分钟。孵育结束后，为终止蛋白水解反应，加入三氯乙酸（TCA）溶液，轻轻混匀，再次于 37 °C 避光孵育 30 分钟。此步骤将导致未反应的底物发生沉淀。

将样品以10,000 ×g离心10分钟，弃去上清液，上清液中含有酸可溶性的FXI标记片段。将上清液转移至酶标板或多孔板中，用检测缓冲液稀释后，在荧光计上读取样品。

大家好，我是Carrie Cup Vineyard，我在密苏里州圣路易斯市的Sigma Aldridge DeKalb工厂担任科学家。今天我将向大家演示一种荧光法测定蛋白酶活性的实验步骤。我们在质量控制实验室中使用该方法来检测低水平的蛋白酶活性。

下面我们开始。本实验所需的孵育缓冲液、检测缓冲液以及0.6 N的三氯乙酸（TCA）溶液均已配制为即用型溶液。将荧光素标记的Cain溶液分装为小份，于-20 °C保存，并注意避光，可使用棕色瓶或将透明管用铝箔包裹。

引用分装的Fite Cain底物可最大限度减少反复冻融循环的需要，反复冻融循环或剧烈震荡或混匀Fite Cain可能导致Fite与Cain分离，从而导致背景升高。若需校准荧光计或确定Fite信号的线性范围，请制备Fite对照溶液。通过在测定缓冲液中重新溶解至适当浓度，新鲜配制该溶液。

准备就绪后，需将溶液避光保存。最后，通过向一管冻干胰蛋白酶中加入 100 微升 1 毫摩尔盐酸来配制胰蛋白酶对照，轻轻混匀以确保胰蛋白酶完全溶解。在酸性条件下保存胰蛋白酶可提高其稳定性。

请注意，胰蛋白酶对照溶液对温度敏感，在低浓度下不稳定。接下来，开始准备所有检测样品，包括测试样品、对照品和空白样品，并在整个检测过程中保持样品避光。

在微量离心管中加入20 µL孵育缓冲液、20 µL FITC-白蛋白底物和10 µL待测样品。可使用透明微量离心管，但样品必须避光孵育。另请注意，蛋白酶活性较高的待测样品需要进行稀释。

胰蛋白酶对照样品用作阳性对照，以确认检测方法运行正常，用于确定检测限或绘制通用标准曲线。制备胰蛋白酶对照时，将一份酸化胰蛋白酶与九份孵育缓冲液（或用于测试样品的缓冲液）混合，并充分混匀。胰蛋白酶的最终工作浓度为 20 微克/毫升。若使用其他特异性蛋白酶，请使用该特异性蛋白酶及适当的缓冲液配制对照溶液。

继续制备对照样品：在微量离心管中加入20 µL孵育缓冲液、20 µL弗氏凯因底物（fz cain substrate）和10 µL胰蛋白酶对照品。建议每次检测至少运行一个含有5 ng胰蛋白酶的对照样品，或使用系列稀释法。最后一个样品为空白对照，其制备方法为：在微量离心管中加入20 µL孵育缓冲液、20 µL弗氏凯因底物（Fitz Caine substrate）和10 µL超纯水。

准备好三种类型的样品后，轻轻混匀各管，并在37摄氏度避光条件下孵育60分钟。注意不要剧烈混匀，以免产生过度湍流，导致荧光背景过高并降低检测的灵敏度。可将孵育时间延长至24小时以提高灵敏度，但不建议更长时间孵育，因为FXI酪蛋白可能开始降解。

再次强调，当孵育完成后，由于会产生较高的荧光背景，需使用适当的防护设备，向每根微量离心管中加入 150 µL 的三氯乙酸（TCA）溶液。加入 TCA 溶液孵育后，应观察到管内出现白色浑浊，此为沉淀的、未消化且不溶性的肌球蛋白混合物，需轻柔混匀，并在 37 °C 黑暗条件下孵育 30 分钟。TCA 溶液孵育结束后，在室温下以 10,000 ×g 离心 10 分钟。

上清液中含有酸可溶性的荧光标记钙蛋白片段，用于荧光检测。用移液器从离心管上层小心吸取，避免吸入沉淀物中的颗粒，否则会在后续荧光检测中导致假阳性结果，从而测量蛋白酶活性。使用荧光计时，将10 µL的TCA上清液与1 mL测定缓冲液在离心管中混合，并轻轻混匀。此外，通过将10 µL的FE加入1 mL测定缓冲液中，稀释FE标准品用于分析。FE对照和胰蛋白酶标准品提供的荧光水平是样品不应超过的阈值。TCA上清液与测定缓冲液的混合溶液可在2至8°C避光保存，最长可保存24小时后再进行荧光测定。

若使用比色皿进行测量，需将一毫升溶液转移至合适的比色皿中；若需检测大量样品，可使用96孔板及荧光酶标仪获取荧光光度数据。在本实验中，异硫氰酸荧光素作为仪器校准可能性的对照。下图显示的是按照所述步骤操作后FS e信号的代表性线性范围。

使用该试剂盒，第一步孵育时间为30分钟，可得到典型的胰蛋白酶和对照样品标准曲线，浓度范围为1.5纳克至25纳克。荧光检测在多孔板中进行。该检测方法的检测下限是指能够产生显著高于空白样品荧光读数的蛋白酶含量。

今天，我们向您展示了如何使用 Sigma Aldridge 蛋白酶检测试剂盒在生物样品中检测荧光法定量的蛋白酶活性。尽管该试剂盒已针对您的使用进行了优化，但需要记住的是，针对您所研究的特定蛋白酶，可能需要进行一些微小的调整。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。