Name: 使用哺乳动物骨骼肌的DNA转染在体内电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: 学习使用电穿孔技术将质粒DNA转染至活体小鼠足部肌肉的方法，通过荧光显微镜观察蛋白表达。该技术为基因治疗和肌肉生物学研究提供了可靠的实验方案。

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我们感谢加州大学洛杉矶分校神经生物学系的 T. Otis 博士与我们共享双光子激光扫描显微镜（TPLSM）设备，感谢德国亚琛工业大学生理学研究所的 C. Fahlke 博士慷慨赠送 pEYFP-ClC1 质粒，以及感谢 R. Serrano 先生提供的技术支持。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）资助项目 AR047664 和 AR54816 的资助。

实验步骤 体内 FDB和IO肌肉的电穿孔
<ol>
<li>开始之前 体内 电穿孔实验方案中，哺乳动物表达质粒必须扩增，使其浓度达到每微升TE缓冲液含2-5 μg质粒。 注意：我们常规使用商业扩增试剂盒，并遵循制造商提供的操作步骤。携带CMV启动子的商业表达质粒在骨骼肌体内转染中效果良好。 </li>
<li>吸取所需体积（10–20 μl）的质粒溶液，分装至两个0.5 ml离心管中（每管用于小鼠的一只足）。</li>
<li>在无菌Tyrode液中配制含有2 mg/ml透明质酸酶的溶液。</li>
<li>使用麻醉箱，通过经批准的气体麻醉机以4%异氟烷（O2为载体）对小鼠进行深度麻醉。将动物置于加热垫（37 °C）上，并通过啮齿类动物面罩维持麻醉状态。通过脚趾夹捏反射监测麻醉深度。</li>
<li>在解剖显微镜下观察，使用一支1英寸长、33号规格的无菌针头，将10 μL透明质酸酶溶液注入小鼠一只脚的足垫皮下。从靠近足跟处刺入皮肤，将针头沿皮下向前推进至脚趾基部约1/4英寸处。</li>
<li>如有需要，可对另一只脚重复该操作。</li>
<li>断开麻醉装置，将小鼠放入笼中，使其完全从麻醉状态恢复。</li>
<li>一小时后，再次麻醉动物并将其置于加热垫上。参照透明质酸酶溶液的操作步骤，注射总共20–50 μg质粒DNA（根据质粒构建体的大小而定），每足总注射体积应小于20 μL。 注意：当15-20 μ必要时，建议使用组织胶封闭皮肤穿刺点.</li>
<li>断开麻醉装置，将小鼠放入笼中。让其从麻醉中完全恢复，并等待10-15分钟。</li>
<li>第三次麻醉动物，并将其置于加热垫上。</li>
<li>选择动物的一只足。在足跟处皮下插入一根镀金针灸针，另一根针插入足趾基部皮下。两根电极相互平行，并垂直于足部的长轴方向。</li>
<li>使用微型夹连接器将针头（电极）连接到电刺激器上。通过施加20次脉冲进行电穿孔，每次持续20毫秒，频率为1赫兹。根据电极间距，通过示波器监测调整脉冲电压幅度，以产生约100伏/厘米的电场。 注意：如果麻醉程度充分，则不应观察到对刺激的任何收缩反应。 </li>
<li>如有需要，可在动物的对侧足部重复上述操作步骤。</li>
<li>将动物放回笼中，在其完全从麻醉中恢复后继续进行观察。注意：如果操作过程正常，动物应在30分钟内恢复完全活动能力，之后即可送回动物房。足垫注射透明质酸酶和DNA对动物未见明显不良影响。 
麻醉恢复后，小鼠可在笼内正常行走。作为额外预防措施，可在动物饮水中添加卡洛芬（Carprofen）作为镇痛剂，浓度为0.0027 mg/ml，持续2天。</li>
<li>蛋白表达可在转染后2至8天进行检测。然而，许多蛋白的持续表达已可观察到持续数月之久。</li>
</ol>
注：所有动物实验程序均已通过加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（UCLA Chancellor's Animal Research Committee）批准，符合《动物福利法》和《公共卫生服务关于实验动物人道使用政策》的要求。
代表性结果：
正确实施 体内 上述电穿孔操作应能有效实现质粒在FDB和IO肌肉中的转染。然而，转基因蛋白变体的表达效率将取决于质粒本身、蛋白的大小与复杂性、蛋白的功能特性，以及其他诸多不可控因素。如图1所示，FDB肌肉在存在商用质粒的情况下进行电穿孔pmR-mCherry编码 mCherry 蛋白，根据大多数肌纤维呈现红色荧光这一事实可知，我们的转染方案成功转染了大部分肌纤维。但这并不排除个别纤维中蛋白表达水平存在差异，或少数纤维完全未被转染的可能性3。需要注意的是，大量表达荧光蛋白（如 mCherry，EGFP、ECFP 和 EYFP 不会影响肌纤维的兴奋性及兴奋-收缩耦合特性。事实上，其特性与假转染肌肉中的表现无异（结果未显示）。
用于验证荧光标记蛋白在骨骼肌纤维中局部表达的实用方法。
细胞内定位 从头合成 表达的转基因蛋白通常通过双光子激光扫描显微镜（TPLSM）同时获取相应标签的荧光图像以及细胞结构的明确标记物图像来进行常规评估。后者最常见的标记物包括：a) 由肌节A带（位于M线中心）肌球蛋白各向异性产生的二次谐波生成（SHG）图像9,10；以及 b) 使用膜不通透性电位敏感染料di-8-ANEPPS对肌纤维表面膜及横管（T管）系统膜进行标记后获得的di-8-ANEPPS荧光图像11。在用di-8-ANEPPS染色的肌纤维荧光图像中，T管表现为大致垂直于肌纤维长轴的狭窄荧光带。这些荧光带之间的间距不均：它们之间跨越M线的距离较长，而跨越Z线的距离较短。11.
骨骼肌纤维中α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP的表达与定位。
图2展示了结构肌蛋白α-肌动蛋白结合蛋白（α-actinin）的一种带标签变体表达示例。该蛋白是Z线的主要组成成分之一，因此常被用作标记该结构的指标12。我们将质粒转染至FDB肌和IO肌中 pEGFPN1-α-肌动蛋白交联蛋白1 编码人（非肌）α-肌动蛋白素（α-actinin），其C末端标记有EGFP。转染后第六天，通过EGFP荧光分布评估发现，α-肌动蛋白素主要表达于沿肌纤维轴向等距分布的狭窄条带中。每个肌节可见一条带（图2A） &amp; 2D）。通过比较EGFP荧光分布与SHG（图2B）及di-8-ANEPPS（图2E）图像，可证明这些条带与Z线的共定位。如叠加图像所示（图2C），α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP条带与SHG条带交替排列，表明其位于两个连续M线之间的中点，与Z线的位置一致。在转染并用di-8-ANEPPS染色的肌纤维中，α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP条带位于每对T小管的中央（图2F），而T小管已知分布在Z线两侧（即间距较短），因此表明转基因表达的α-肌动蛋白结合蛋白定位于Z线。
表达N端带有EGFP标签的DHPRα1s
通过TPLSM图像（例如图3A）验证了pEGFPC1.1-DHPR α1s 对肌肉的转染效率，结果显示大多数肌纤维表达了EGFP-DHPRα1s（一种跨膜蛋白）。转染肌纤维最显著的特征是EGFP荧光呈现双带状模式（图3A和3B），这与该蛋白靶向定位至横小管（T-tubules）的预期一致。从图3还可观察到，尽管不同肌纤维的荧光强度各异，但单根肌纤维的带状荧光模式沿其长度方向保持均一。在更高放大倍数下（图3B），可清晰看到各荧光带之间的间距不均，这与使用di-8-ANEPPS染色的肌纤维中观察到的模式相似（例如图2E）。叠加图像（图3B和3E）表明，SHG信号带位于EGFP-DHPRα1s荧光带之间较大的间隔区域，进一步证实该蛋白定位于横小管。此外，利用非荧光疏水性阴离子DPA⁻进行的FRET测量（数据未显示）进一步证明，EGFP基团距离横小管膜内层仅数纳米。 
EYFP-ClC1 表达的定位与功能评估
转染了编码骨骼肌氯离子通道（ClC1）N端EYFP标签融合蛋白的pEYFP-ClC1质粒的肌纤维，显示出EYFP荧光条带（图4A），其分布模式与EGFP-DHPRα1s表达所观察到的模式相似（图3A），并与di-8-ANEPPS染色所示的T小管排列相对应（图2E）。正如预期，EYFP-ClC1（图4A）与SHG图像（图4B）叠加后的结果（图4C）表明，SHG条带位于EYFP荧光条带之间的较大间距中央。
为了评估EYFP-ClC1的表达是否如功能性氯离子通道过表达所预期的那样，显著增加肌纤维的静息电导，我们通过酶解法分离了转染FDB肌肉的肌纤维，并采用先前描述的双微电极实验装置6,11,13研究其电生理特性。图5展示了两个肌纤维的实验结果：其中一个肌纤维表达大量EYFP-ClC1（通过标准荧光显微镜下的整体荧光强度测量确定，结果未显示），另一个为未转染的对照组。图5A中的电压记录（来自表达EYFP-ClC1的肌纤维）表明，由于静息电导过高，该纤维几乎无法兴奋。需要使用高达400nA（0.5ms）的电流刺激脉冲才能引发非常微弱的动作反应（无超射，图5A）。当将外部Tyrode溶液替换为含有500 μM氯离子通道阻断剂9-ACA的溶液后，仅需200 nA的电流脉冲即可引发动作电位（图5B），尽管其速度明显慢于且波形宽于对照组肌纤维中记录到的动作电位（图5C）。与预期一致，加入9-ACA对这一对照组肌纤维影响极小（图5D）。
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="SHG 和 Di-8-ANEPPS 图像、肌纤维示意图、光学激发、光谱分析。" border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 1"> 图 1. 体内电穿孔法的转染效率。 使用 pmR-mCherry 转染的 FDB 肌肉的明场（A）和荧光（B）图像。电穿孔操作后天数：12 天。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">点击此处</a>查看图 1 的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="荧光显微镜：EGFP标记、SHG、Di-8-ANEPPS、蛋白质结构叠加。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图2"> 图2. α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP在FDB肌纤维中的表达与定位。 图A和图B分别为表达α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP的肌纤维的EGFP荧光图像和二次谐波生成（SHG）图像。图C为图A与图B图像的叠加。图D和图E分别为另一根表达α-肌动蛋白结合蛋白-EGFP的肌纤维的荧光图像及其经di-8-ANEPPS染色后的图像。图F为图D与图E图像的叠加。电穿孔处理后天数：6天。
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="EGFP-α1s-DHPR 荧光显微镜图像、SHG 成像、与肌纤维局部放大的叠加分析。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 3"> 图 3. FDB 肌纤维中 EGFP-DHPRα1s 的表达与靶向定位。图 A 为表达 EGFP-DHPRα1s 的一组肌纤维的 EGFP 荧光图像。图 B 为图 A 中方框区域的放大图像，以更清晰地显示蛋白表达的条带状模式。图 C 为与图 A 对应的 SHG 图像。图 D 为图 A 与图 C 图像的叠加结果。图 E 为图 D 中所示区域的进一步放大图像。电穿孔处理后天数：20 天。
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="肌纤维的显微镜图像以及显示蛋白质分析中光强度与距离关系的图表。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 4"> 图 4. FDB 肌纤维中 EYFP-ClC1 的表达与定位。图 A 和图 B 分别为表达 EYFP-ClC1 的肌纤维的 EYFP 荧光图像和 SHG 图像。图 C 为图 A 和图 B 图像的叠加。图 D 为沿图 C 中白色标示线测得的强度分布曲线。电穿孔实验后天数：7 天。
<img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt='&lt;a href="https://europepmc.org/article/MED/20018887"&gt;膜片钳实验图：转染细胞与对照组在Tyrode/9-ACA处理下膜电位随时间变化。&lt;/a&gt;' data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 5"> 图5. 表达转基因EYFP-ClC1的肌纤维的电生理学评估。 图A和图B分别为表达EYFP-ClC1的肌纤维在9-ACA处理前和处理后对电流脉冲响应的电压记录。图C和图D分别为未转染肌纤维在9-ACA处理前和处理后对电流脉冲响应所诱发的电压记录（动作电位）。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们在此描述了为实现将DNA质粒有效转染至骨骼肌纤维所需遵循的详细步骤 体内 电穿孔。本方法的主要优势在于操作简便，且侵入性极小，因而对动物几乎不构成健康风险。实际上，上述电穿孔方案仅涉及每只足部进行两次皮下注射，随后实施电刺激程序，整个过程在麻醉条件下对动物具有良好的耐受性。在我们机构，这些操作被整体认定为非手术性操作，因其不涉及皮肤切开。此外，电穿孔操作的温和性是实现高效质粒转染及肌纤维后续蛋白表达的关键因素，因为任何显著的细胞损伤都会削弱其高效进行活性蛋白合成的能力。
对本文所述方案进行微调后，可（且已被）应用于小鼠足部较大的肌肉（例如 趾长伸肌，EDL； 胫骨前肌，TA；以及比目鱼肌）。此外，仅通过按比例增加总DNA量，我们已成功将此处所述的完全相同的操作流程应用于成年大鼠的FDB和IO肌肉的转染。
尽管转染方案在肌肉纤维中表达转基因蛋白的水平始终存在差异，但这种变异性可在生理学实验中加以利用：非表达纤维可作为对照，而表达水平不同的纤维则可用于分析表达水平与功能变化...

使用dna转染哺乳动物骨骼肌 体内 电穿孔

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

对细胞生物学日益增长的兴趣之一是表达经过转基因修饰的关键蛋白质形式（例如，荧光标记的构建体和/或突变体变体），以研究其内源性分布及功能相关性。为在完全分化的细胞中实现这一目标，已实施的一种有趣方法是in vivo 通过各种方法将质粒转染到特定组织（如肝脏）中1，骨骼肌2,3，甚至大脑4. 本文详细介绍了一套高效将遗传物质转染至肌肉纤维的必要操作步骤趾短屈肌（FDB）和interosseus (IO) 成年小鼠的眼外肌，使用一种in vivo 电穿孔方法。实验参数已经过优化，以最大限度地增加转染的肌纤维数量，同时尽量减少可能影响单根肌纤维中表达蛋白质量和数量的组织损伤。我们已验证，采用本文所述方法可获得高水平的可溶性蛋白，例如 EGFP 和 ECFP。3，钙蛋白酶（calpain）、FKBP12、β2a-二氢吡啶受体（β2a-DHPR）等；结构蛋白，即微型抗肌萎缩蛋白（minidystrophin）和α-辅肌动蛋白（α-actinin）；以及膜蛋白，即α1s-二氢吡啶受体（α1s-DHPR）、雷诺丁受体1（RyR1）、心肌Na/Ca2+交换器、NaV1.4 钠通道、SERCA1 等，在应用于小鼠和大鼠的 FDB、IO 及其他肌肉时。其中部分蛋白质的高效表达已通过生物化学方法验证3以及功能性证据5然而，迄今为止我们最常用的验证方法是标准荧光显微镜和双光子激光扫描显微镜（TPLSM），这些方法不仅能够鉴定荧光标记蛋白构建体的整体表达情况，还能确定其详细的细胞内定位。该方法同样可用于转染编码具有生理学意义蛋白的质粒（如本文所示），或用于转染旨在抑制正常表达蛋白的干扰RNA（siRNA）（此应用尚未被我们测试）。值得注意的是，对FDB和IO肌纤维进行转染对于哺乳动物肌肉生理学研究具有特别重要的意义，因为从这些肌肉经酶解分离得到的肌纤维目前是研究兴奋性及兴奋-收缩耦合基本机制最为合适的模型之一，可在电流钳或电压钳条件下进行相关研究。2,6-8.

我们详细描述了利用电穿孔技术将质粒DNA高效转染至活体小鼠足部肌肉纤维，以及随后通过荧光显微镜观察蛋白表达的实验步骤。

使用DNA转染哺乳动物骨骼肌 体内 电穿孔

人们对细胞生物学日益增长的兴趣之一是表达经过转基因修饰的关键蛋白形式（例如，荧光标记的构建体和/或突变体……）

可以在体内进行电穿孔，以转染DNA、质粒，并在成年小鼠的趾短屈肌（flexor digitorum brevis，FDB）或骨间肌（interosseous，IO）中实现转基因表达。该操作首先对小鼠进行麻醉。将小鼠一只足底的足跟部位作为第一处透明质酸酶注射位点，将针头从足跟处刺入，并在皮下沿足部走向推进。一小时后，对动物重新进行麻醉，并将血浆注射到之前注射透明质酸酶的同一足部皮下区域。10分钟后，按图示将镀金的针灸针插入皮下。必要时，将针连接至刺激器后，给予电穿孔脉冲。该操作可在对侧足部重复进行。经过两到八天的时间后，处死动物，分离肌肉组织，并通过显微镜下观察荧光来验证目标蛋白的转染情况。大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校（UCLA）Davy Geffen医学院生理学系Julio Vera实验室的Marino DeFranco。今天，我们将向您展示一种将表达转基因蛋白的质粒体内转染至成年小鼠肌纤维的操作方法。在我们的实验室中，该方法用于研究转基因蛋白的表达与定位，以及蛋白过表达对肌纤维生理功能的影响。现在，让我们开始吧。在开始进行活体电穿孔实验之前，必须扩增哺乳动物表达质粒，使其浓度达到每微升TE缓冲液中含有2至5微克质粒。我们常规使用Qiagen扩增试剂盒，并遵循生产商及其提供的说明书操作。我们建议使用带有CMV启动子的商业化表达质粒，例如来自Invitrogen的EEG FPC1或EEG FPN1。由于该启动子在骨骼肌中具有很好的作用效果，我们将演示体内转染的实验步骤。使用P EEG FPN一，我们预先配制了含有每毫升2毫克透明质酸酶的无菌Tyro溶液。该溶液在使用前保持室温，用于动物准备。进行转染时，我们使用连接至经批准的气体麻醉机的麻醉箱，并以含4%异氟烷的氧气对动物进行深度麻醉。麻醉成功后，涂抹眼膏以保护小鼠在后续麻醉过程中眼睛免于干燥。将动物置于设定为37摄氏度的加热垫上，并通过面罩持续给予麻醉维持麻醉状态。通过检查脚趾夹捏反射来监测麻醉深度。当动物达到深度麻醉状态时，在解剖显微镜下观察，使用一根1英寸长、33号的无菌针头，将10 µL高浓度UR溶液注射到小鼠一只脚足垫的皮下。进针点选择在足跟附近，穿透皮肤后，将针头沿皮下向前推进至脚趾基部。注射时推进约四分之一英寸，轻柔注入溶液，以防止皮肤过度隆起。另一只脚重复此操作。如有需要，注射的酶可在约一小时内通过水解透明质酸，使肌纤维周围的结缔组织逐渐软化。这将促进随后注射到纤维间质空间中的DNA质粒的扩散。注射透明质酸酶后，断开麻醉装置，将小鼠放入笼中。动物将在三到四分钟内从麻醉状态恢复。 一小时后，再次对动物进行麻醉。吸取10微升质粒溶液，滴加一滴于洁净的小型凝胶托盘背面。用注射器吸取该液滴，并将其注射至足垫部位。按照透明质酸酶溶液用于较大蛋白质的相同操作步骤，可注射更大体积的血浆。当所需体积超过15微升时，我们建议注射量不超过20微升。我们建议使用组织胶封闭针头穿刺处的皮肤，以防止DNA从穿刺点泄漏的风险。断开麻醉装置，将小鼠放入笼中。让小鼠完全从麻醉中恢复，并等待10至15分钟以准备进行电穿孔。按照之前的方法对动物进行麻醉。选取动物的一只脚，在足跟处皮下插入一根镀金的针灸针或电极，另一根置于脚趾基部。两根针相互平行，并垂直于足部的长轴。针灸针的直径为160 µm，长度为13 mm。它们以单个无菌包装出售。根据针头间距调整脉冲幅度，以输送电压脉冲，产生大约每厘米100伏的电场。将脉冲持续时间调整为20毫秒，频率调整为1赫兹。使用微型夹连接器将电极头部连接到电刺激器上。通过施加20次电脉冲刺激足部肌肉。在示波器内监测电压波形。对刺激无明显收缩反应。如果麻醉水平足够，可根据需要在仍处于麻醉状态下进行操作。在另一只脚重复上述电穿孔操作后，将动物放回笼中并继续观察。在完全从麻醉中恢复之前，动物应在五分钟内恢复全部活动能力。若无不良反应且操作过程正常，作为额外预防措施，将卡芬（carfin）以0.027毫克/毫升的浓度加入动物的饮水中，持续两天。作为一种镇痛蛋白，其表达可在转染后两到八天内进行检测。然而，许多蛋白的持续表达已可观察到持续数月之久。通过商用质粒 P EEG FPN1（编码 EGFP 蛋白）对 FDB 肌肉进行电穿孔转染后，可使用手持式紫外灯或高亮度紫外二极管发出的紫外光轻松观察转染效率。在体视显微镜下观察小鼠足部，可以发现大多数肌纤维已通过本实验方案成功转染，表现为大部分肌纤维呈现绿色荧光。体视显微镜可显示肌肉整体的转染模式。重复进行此项观察。使用落射荧光显微镜可观察到EGFP在成束肌纤维甚至单个肌纤维中的表达模式。通过比较肌肉的明场图像与荧光图像，可评估mCherry蛋白在FDB肌纤维中表达的效率。为评估新表达的转基因蛋白在细胞内的定位，可采用双光子激光扫描显微镜进行观察。同时获取荧光标记蛋白的图像和细胞结构明确标志物的图像。最常见的细胞结构标志物是来自肌节肌球蛋白各向异性的二次谐波生成（SHG）图像，该信号以M线为中心的A带和染料产生。通过使用八安普（eight anep）染料对肌纤维进行染色，并用其膜电位示踪荧光染料标记肌纤维的表面膜和横管系统（T小管系统）膜，可获得附录荧光图像。在荧光图像中，T小管表现为沿肌纤维长轴大致垂直取向的狭窄荧光条带，这些条带之间的间距不相等。它们之间由一段长距离分隔，横跨M线，以及一段较短的距离，横跨Z线。此处展示的是结构肌蛋白α-肌动蛋白结合蛋白（alpha actinin）标记变体表达的一个示例。该蛋白是Z线的主要组成成分， routinely 被用作该结构的标志物。我们通过质粒P-E-G-F-P Fpn人非肌性α-肌动蛋白（在C末端与EGFP融合标记）转染FDB肌和眼外肌，在转染后第6天观察发现，α-肌动蛋白主要表达于沿肌纤维轴向等距分布的狭窄条带处。每个肌节可见一条带。通过将EGFP荧光分布与SHG或D八偶联图像进行比较，叠加图像显示了这些条带与Z线的共定位。α-肌动蛋白和EGFP条带与SHG条带交替排列，表明它们位于两个连续M线的中点，这与转染肌肉纤维中以d an up α-肌动蛋白染色的Z线位置一致。EGFP条带位于每对T小管的中央，而T小管已知位于Z线两侧。这表明转基因α-肌动蛋白被靶向至Z线。图三展示了N端EGFP标记的DHPR alpha 1s的表达与靶向定位。EGFP荧光主要呈现为成对的条带，其分布模式与T管系统（T-tubules）的模式相似。将二次谐波（SHG）信号与EGFP-DHPR alpha 1s图像叠加显示，在每两个连续的SHG条带之间均存在两条EGFP荧光条带，表明DHPR alpha 1s已正确靶向至T管系统的二联体（dyad）结构。此外，未展示的共聚焦成像结果（abstaining）为DHPR alpha 1s在横管（T-tubule）上的靶向定位提供了明确证据。使用质粒P-EYFP-CLC1转染的肌纤维，该质粒编码在骨骼肌氯离子通道CLC1的C末端融合EYFP标签的表达构建体，其EYFP荧光信号的分布与T管系统的排列一致，如图中dyad和abstaining所示。正如预期，EYFP CLC1 与二次谐波（SHG）图像的叠加显示，SHG 信号带位于 EYFP 荧光带之间较大的间隔区域中心。为了评估 EYFP CLC1 的表达是否如功能性氯离子通道过表达所预期的那样，显著增加了肌纤维的静息电导，我们通过酶解法分离了转染的 FDB 肌肉纤维，并采用双微电极实验装置研究其电生理特性。该图像显示了两根肌纤维的实验结果。一根表达了大量EYFP标记的clc蛋白，其全局荧光强度是在标准荧光显微镜下通过荧光强度测量获得的；另一根为未转染的对照组。电压记录来自表达 EYFP-CLC-1 的肌纤维。当用含有 500 微摩尔氯离子通道阻断剂 9-瑞宁羧酸（9-ACA）的溶液替换外部台氏液时，即使施加比激发对照纤维所需更大的电流脉冲，转染纤维也仅产生微小的再生性反应。较小的脉冲可引发动作电位，但其速度明显较慢、波形更宽，与预期结果一致，与对照纤维中记录到的动作电位相比差异显著。向对照肌纤维中添加九种 a CA 对其影响极小。我们得出结论：由于静息氯离子电导过高，表达 EYFP-CLC 的肌纤维几乎不具备兴奋性。我们刚刚向您展示了如何通过电穿孔法将表达转基因蛋白的质粒转染到活体骨骼肌纤维中，以及如何评估转染效率、转染蛋白的定位及其功能。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。I.

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