制备人血小板裂解液（pHPL）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

本方案介绍了从富血小板血浆开始制备大量人血小板裂解液的过程。通过进行一次冻融循环，使血小板发生裂解。随后将至少10个单位的人血小板裂解液汇集为一批混合人血小板裂解液（pooled human platelet lysate 或 PHPL）。

将约三升的此液体进一步分装成等份 aliquot 并再次冷冻，以去除血小板碎片。将这些 aliquot 解冻后转移至小瓶中，离心。上清液即为去除了血小板碎片的 PHPL，其中含有可补充细胞培养的血小板源性生长因子。

剩余的血小板碎片沉淀被弃去。大家好，我是来自格拉茨医科大学干细胞研究组 Dr. TRO 实验室的 Kadina Sharmo。今天我们将向您展示一种制备人血小板分离物混合样本的实验方法。

我们将从富血小板血浆开始，进行数次冻融循环，然后去除血小板碎片。在我们的实验室中，使用该方法制备细胞培养所需的补充物，作为胎牛血清的替代品。现在让我们开始吧。

本方案从富血小板血浆（PRP）开始。该血浆可能通过细胞单采术制备，或来源于白细胞层。输血医学领域以外的人员应从当地血库或其他授权供应商处购买 PRP。

通过将每单位PRP中的20毫升转移至一个小型连接袋，并使用热合机断开连接，以检查PRP单位的无菌性。此分装样品可在制备完成后立即送至微生物学实验室进行无菌检测。重要的是，需将PRP单位在原始储存袋中冷冻至至少负20摄氏度。

当细菌检测结果为阴性后，可进行下一步操作。注意避免人血小板裂解物（现称为HPL）过度升温，将HPL样本置于37°C水浴中，直至冰晶完全消失。经过冻融步骤后，血小板应被裂解，以制备每批血小板裂解物混合液的标准化产品。

收集10至15个解冻后的PRP单位。将每个连续的HPL袋连接到汇集双联袋，然后将HPL转移至这两个袋中。使用热合机断开空的HPL袋。

将两个袋子中的内容物混合，得到最终体积为三到四升的混合人血小板裂解液，现称为PHPL。连接一个小袋，取20毫升PHPL样品，以检测混合产物的无菌性。

通过将小袋连接至汇集双联袋，分装PHPL样品以进行后续处理。将约250毫升的液体转移至小型储存袋中，然后使用热合机断开已装满的袋子。随后再进行一次冻融循环，以提高血小板破碎率及释放的生长因子量。

将分装好的 PHBL 小袋在 -20 摄氏度条件下冷冻保存，然后在 37 摄氏度水浴中解冻，操作在超净工作台内进行。

使用无菌剪刀剪开每个袋子的管口，然后将 PHPL 倒入 50 毫升的瓶中。血小板碎片常常倾向于聚集，还可能引起同种免疫反应。为避免这些情况，需在冷藏离心机中以 4,000 ×g 离心 15 分钟，去除 PHPL 中的碎片。

接下来，用移液器将血浆上清液转移至最终的储存管中，并弃去血小板沉淀，以避免细胞培养物冻存时含有碎片。将50毫升分装的PHPL再次于-20°C保存，直至进一步使用。现在，血小板碎片耗尽的PHPL已制备完成，可对其裂解物特性进行分析。

通过细胞培养检测混合血小板裂解物的功能和质量，并证明其可有效刺激细胞增殖，成功促进间充质基质细胞（MSCs）以及内皮集落形成细胞（E CFCs）的扩增，所用材料为去除血小板片段的PHPL。有关培养基配方的详细书面方案，请参见此处。混合人血小板裂解物的两种应用。

在间充质基质细胞培养中，来自供体一的MSCs使用PHPL或血小板碎片耗竭型PHPL进行培养。如图所示，与仅使用碎片耗竭型PHPL相比，此处显示出更多的碎片污染。血小板碎片无法充分支持MSC的生长。

三幅图像均在培养13天后拍摄。来自供体二的MSC在血小板碎片耗竭的PHPL中培养了9天，而非富血小板血浆。请注意，未经血小板裂解的PRP无法充分支持MSC的生长扩散。

另请参阅 Andreas Reish 在 JoVE 上发表的实验方案，该方案描述了使用去除了碎片的 PHPL 来分离和培养人脐带血来源的间充质干细胞。我们刚刚向您展示了如何制备 PHPL，以在干细胞培养中完全替代动物血清。在进行此操作时，务必要记住：在将肝素和 PHPL 添加到培养基之前，必须先去除血小板碎片。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。