Name: 汇集人类血小板裂解液作为一种有效的补充（pHPL）的动物血清自由人干细胞培养制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-30T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 了解从富血小板血浆制备人血小板裂解液的方法，通过冻融循环裂解血小板并离心去除碎片。该方案可产生约三升富含生长因子的无动物血清培养基补充剂，用于支持间充质基质细胞和内皮集落形成细胞的高效增殖。

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本工作得到了奥地利科学基金会（FWF，项目号 N211-NAN，授予 DS）和奥地利研究促进署（FFG，项目号 N200，授予 DS）的支持。作者感谢 Claudia Url 提供出色的技术协助以及 Monica Farrell 进行语言编辑。

1. 起始材料
以通过细胞单采术制备或从白膜层获得的富血小板血浆（PRP）单位开始。
2. 无菌检查
为进行无菌检查，通过将液体转移至一个连接的小袋（Baxter）中，从每单位PRP中取20 mL样品。通过热封断开此小袋。
3. PRP 样本的冷冻
制备完成后，立即将PRP单元在原始储存袋中冷冻至至少-20°C，无需进一步处理。
4. HPL 单位的解冻
当细菌检测结果为阴性时，将人血小板裂解液单位（现称为HPL单位）在37°C（水浴）中解冻，直至冰状凝块消失。切勿对HPL进行加热。
5. HPL 单位的汇集
为制备标准化产品，至少取十到十五个解冻的HPL单位用于制备一池血小板裂解物。将HPL袋依次连接至汇集双联袋（MacoPharma），并将HPL转移至这两个袋中。通过热合断开空的HPL袋。混合两个袋中的内容物，获得3至4 L的汇集人血小板裂解物（pHPL）。连接一个小袋（Baxter），取20 mL pHPL样品用于检测汇集产品的无菌性。通过热合断开该小袋。
6. pHPL 的分装
分装pHPL，以获得适合后续处理的等分试样。将小袋（Baxter）连接到汇集双联袋（Macopharma），并将最多250 mL的液体转移至小储存袋（Baxter）中。通过热封断开已装满的袋子。
7. pHPL 分装样品的再次冷冻
通过额外的冻融步骤提高血小板碎片化的速率以及释放的生长因子的量。将分装好的小袋pHPL再次于至少-20°C条件下冷冻。
8. pHPL 分装样品的再次解冻与分装
在37°C（水浴）中解冻pHPL袋。使用无菌剪刀剪开袋子的管路，将内容物转移至50 mL离心管（Falcons BD）中，并将pHPL倒入离心管内。此步骤需在超净工作台中进行，以避免细菌或真菌污染。
9. 去除血小板碎片
由于血小板碎片容易聚集并可能引起同种免疫反应，因此需从pHPL中去除。将pHPL小瓶在4,000g离心15分钟（4°C）。在超净工作台中，用移液器将上清液转移至最终储存小瓶（BD Falcon）中，并弃去血小板沉淀，以避免细胞培养中出现碎片。
10. pHPL 的储存
将50 mL pHPL小瓶中的样品再次冷冻至至少-20°C，并保存以供实验使用。
11. pHPL 在细胞培养中的应用
最初向培养基中添加不含防腐剂的肝素，以避免凝胶形成。在37°C下解冻一份无菌人血小板裂解液（pHPL） aliquot，并通过添加8–10%补充至培养基中。
培养基
MSC培养基：
取500 mL a-MEM，加入56 mL解冻后的pHPL（详见参考文献1）和不含防腐剂的肝素（2 IU/mL，即224 μL储存液），使pHPL终浓度为10%（肝素可防止血浆中纤维蛋白原聚集导致培养基凝固）。此外，加入青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 μg/mL）溶液和2 mM L-谷氨酰胺（均来自Sigma）。
使用20 μm孔径的真空滤膜（Millipore）过滤培养基。妥善标记瓶子（内容物、日期）。
ECFC 培养基：
取一瓶（500 mL）EBM 培养基，向基础培养基中加入细胞因子分装液、56 mL pHPL、不含防腐剂的肝素（10 IU/mL，即 1120 μL 原液）、青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 μg/mL）溶液以及 2 mM L-谷氨酰胺，然后使用孔径为 20 μm 的真空滤器（Millipore）过滤。妥善标记瓶身（注明内容物和日期）。
<img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="血浆与白膜层制备示意图；血液离心后分离为血浆、白膜层和红细胞。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1：从当地血库或其他授权机构提供的全血捐献中制备富血小板血浆。血液经离心后可分离为血浆、白膜层和红细胞。可将4个O型血的白膜层单位与1个AB型血的血浆混合后进行离心，以获得富含血小板的血浆。一份质量合格的富血小板血浆约300 mL，其浓度应达到每毫升含1×109个血小板，或总量达3×1011个血小板。
<img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="MSC培养基制备示意图；包含肝素、L-谷氨酰胺、青霉素、人血小板裂解物（pHPL）。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2">
<img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="内皮集落培养方法；含EBM-2、EGM-2 + pHPL添加剂用于ECFC生长的示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3">

<ol><li>Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Platelets and wound healing.</a> Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).</li>
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<li>Giacco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-activated+platelets+induce+proliferation+of+human+skin+fibroblasts+by+stimulating+autocrine+production+of+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1.</a> FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).</li>
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</ol>

在某些地区，富血小板血浆（PRP）可从白膜层中获取，而白膜层通常是经检测的献血血液在制备浓缩红细胞过程中产生的废弃副产品（图1）。理想情况下，PRP应立即用于后续pHPL的制备，因为在过期的血小板浓缩物中，由于血小板储存损伤及降解，生长因子的可用性可能降低20。此外，建议采用血型O型的血小板与血型AB型的血浆配伍来制备PRP，以避免ABH抗原和同种凝集素可能产生的影响。迄今为止，细胞培养主要使用胎牛血清（FBS），但其存在异种免疫反应21以及传播已知和未知病原体的风险。尽管自体血清或无血清培养基等替代方案已被尝试，但在许多应用中尚未成功取代FBS22。在既往研究中，我们比较了pHPL与FBS对间充质基质细胞扩增的影响，结果显示pHPL在细胞增殖方面具有更高的效率7,8,23。Reinisch et. al.11已证明在EGM-2培养基中添加pHPL、并在无动物血清条件下实现内皮祖细胞的分离和大规模扩增，该方法亦由Nicole A. Hofmann作为JoVE实验方案进一步展示。MSC和ECFC培养基制备的详细操...

<table><tbody><tr><td>双层袋 (2 x 3.5L)</td><td>MacoPharma</td><td>VDL 8000XQ</td><td>原用于腹水穿刺</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon BD</td><td>2098</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 移液管</td><td>Costar</td><td>4501</td><td></td></tr><tr><td>血浆袋 (600 mL)</td><td>Baxter International Inc.</td><td>R4R2021</td><td></td></tr><tr><td>无菌管路焊接仪</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>TSCD-II</td><td></td></tr><tr><td>焊接设备</td><td>Fresenius Kabi</td><td>Compo Seal</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>夹钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

制备人血小板裂解液（phpl）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

血小板源性生长因子已被证明能有效刺激细胞增殖in vivo1,2和in vitro. 这一效应已在经凝血酶激活的血小板作用下的间充质基质细胞（MSCs）、成纤维细胞和内皮集落形成细胞中被报道3-5或通过冻融循环裂解6-14在将血小板释放物加入细胞培养基之前。血小板源性生长因子的营养作用已在多项试验中用于组织工程和再生治疗的研究。1,15-17效率的差异被认为至少部分是由于生长因子的个体浓度不同所致18,19以及血小板制备方面目前缺乏标准化的操作规程。15,16本方案提供了一种可行的操作流程，用于制备来源于40至50份单次献血所常规制备的富血小板血浆（PRP）的人源血小板裂解物（pHPL）。通过多次冻融循环，破坏血小板膜结构，从而高效释放生长因子至血浆中。最后，通过离心去除血小板碎片，以避免形成大量聚集体并清除潜在抗原。将pHPL应用于标准细胞培养体系，是推动在无动物蛋白系统中扩增细胞治疗产品的有前景工具。

人血小板裂解液是生长因子的丰富来源，也是细胞培养中一种高效的补充剂。本方案介绍了从富血小板血浆开始，通过多次冻融循环并去除血小板碎片，制备大量人血小板裂解液的过程。

制备人血小板裂解液（pHPL）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

血小板源性生长因子已被证明可有效刺激体内1,2及体外的细胞增殖。该效应已在……中被报道。

本方案介绍了从富血小板血浆开始制备大量人血小板裂解液的过程。通过进行一次冻融循环，使血小板发生裂解。随后将至少10个单位的人血小板裂解液汇集为一批混合人血小板裂解液（pooled human platelet lysate 或 PHPL）。将约三升的此液体进一步分装成等份 aliquot 并再次冷冻，以去除血小板碎片。将这些 aliquot 解冻后转移至小瓶中，离心。上清液即为去除了血小板碎片的 PHPL，其中含有可补充细胞培养的血小板源性生长因子。剩余的血小板碎片沉淀被弃去。大家好，我是来自格拉茨医科大学干细胞研究组 Dr. TRO 实验室的 Kadina Sharmo。今天我们将向您展示一种制备人血小板分离物混合样本的实验方法。我们将从富血小板血浆开始，进行数次冻融循环，然后去除血小板碎片。在我们的实验室中，使用该方法制备细胞培养所需的补充物，作为胎牛血清的替代品。现在让我们开始吧。本方案从富血小板血浆（PRP）开始。该血浆可能通过细胞单采术制备，或来源于白细胞层。输血医学领域以外的人员应从当地血库或其他授权供应商处购买 PRP。通过将每单位PRP中的20毫升转移至一个小型连接袋，并使用热合机断开连接，以检查PRP单位的无菌性。此分装样品可在制备完成后立即送至微生物学实验室进行无菌检测。重要的是，需将PRP单位在原始储存袋中冷冻至至少负20摄氏度。当细菌检测结果为阴性后，可进行下一步操作。注意避免人血小板裂解物（现称为HPL）过度升温，将HPL样本置于37°C水浴中，直至冰晶完全消失。经过冻融步骤后，血小板应被裂解，以制备每批血小板裂解物混合液的标准化产品。收集10至15个解冻后的PRP单位。将每个连续的HPL袋连接到汇集双联袋，然后将HPL转移至这两个袋中。使用热合机断开空的HPL袋。将两个袋子中的内容物混合，得到最终体积为三到四升的混合人血小板裂解液，现称为PHPL。连接一个小袋，取20毫升PHPL样品，以检测混合产物的无菌性。通过将小袋连接至汇集双联袋，分装PHPL样品以进行后续处理。将约250毫升的液体转移至小型储存袋中，然后使用热合机断开已装满的袋子。随后再进行一次冻融循环，以提高血小板破碎率及释放的生长因子量。将分装好的 PHBL 小袋在 -20 摄氏度条件下冷冻保存，然后在 37 摄氏度水浴中解冻，操作在超净工作台内进行。使用无菌剪刀剪开每个袋子的管口，然后将 PHPL 倒入 50 毫升的瓶中。血小板碎片常常倾向于聚集，还可能引起同种免疫反应。为避免这些情况，需在冷藏离心机中以 4,000 ×g 离心 15 分钟，去除 PHPL 中的碎片。接下来，用移液器将血浆上清液转移至最终的储存管中，并弃去血小板沉淀，以避免细胞培养物冻存时含有碎片。将50毫升分装的PHPL再次于-20°C保存，直至进一步使用。现在，血小板碎片耗尽的PHPL已制备完成，可对其裂解物特性进行分析。 通过细胞培养检测混合血小板裂解物的功能和质量，并证明其可有效刺激细胞增殖，成功促进间充质基质细胞（MSCs）以及内皮集落形成细胞（E CFCs）的扩增，所用材料为去除血小板片段的PHPL。有关培养基配方的详细书面方案，请参见此处。混合人血小板裂解物的两种应用。在间充质基质细胞培养中，来自供体一的MSCs使用PHPL或血小板碎片耗竭型PHPL进行培养。如图所示，与仅使用碎片耗竭型PHPL相比，此处显示出更多的碎片污染。血小板碎片无法充分支持MSC的生长。三幅图像均在培养13天后拍摄。来自供体二的MSC在血小板碎片耗竭的PHPL中培养了9天，而非富血小板血浆。请注意，未经血小板裂解的PRP无法充分支持MSC的生长扩散。另请参阅 Andreas Reish 在 JoVE 上发表的实验方案，该方案描述了使用去除了碎片的 PHPL 来分离和培养人脐带血来源的间充质干细胞。我们刚刚向您展示了如何制备 PHPL，以在干细胞培养中完全替代动物血清。在进行此操作时，务必要记住：在将肝素和 PHPL 添加到培养基之前，必须先去除血小板碎片。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

汇集人类血小板裂解液作为一种有效的补充（pHPL）的动物血清自由人干细胞培养制备

本文介绍了基于解离的单细胞非克隆型单层（NCM）生长的人多能干细胞（hPSC）培养方案。这一新方法利用Rho相关激酶抑制剂或层粘连蛋白异构体521（LN-521），适用于大量生产均一的hPSCs，以及进行基因操作和药物筛选。...

人类多能干细胞培养、维持与遗传分析的替代培养体系

所述方案可使实验室利用可编程液体处理机器人和96孔板，以较低的劳动力、经验及设备投入成本，实现可扩展的、贴壁培养的干细胞高通量培养。在此系统中传代超过20次的诱导多能干细胞（iPSCs）仍维持了多能性、正常的核型，并可分化为心肌细胞。...

基于96孔板的可扩展iPSC培养与生产及机器人液体处理系统应用

本方案提供了一种简单高效的方法，仅使用来源于人胎盘的条件培养基，在明胶包被的培养皿中传代培养人多能干细胞（hPSCs），无需额外添加外源性成分或hPSC特异性的合成基质。...

一种在胎盘条件培养基中利用明胶培养人多能干细胞的新颖培养模型

本方案描述了一种在96孔板体系中由人多能干细胞生成肝细胞样细胞的半自动化方法。该过程快速且成本效益高，可用于生产质量可控的肝细胞样细胞批次，服务于基础和应用型人类研究。...

多能干细胞向类肝细胞的半自动化生产

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。...

从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

本方案介绍了一种可制备富血小板血浆（PRP）的装置，用于在100%自体成纤维细胞培养系统中促进细胞的体外扩增。...

自体富血小板血浆的制备及其在体外人成纤维细胞扩增中的促进作用

为避免在饲养细胞上培养的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在酶法或机械传代过程中存在的局限性，我们建立了一种快速、高效、成本低且得率高的收获方法，该方法利用EDTA介导的去黏附作用，用于收获维持在人包皮成纤维细胞饲养层上生长的hESC或hiPSC克隆。...

通过乙二胺四乙酸介导的去黏附实现饲养细胞上人多能干细胞快速、经济、无酶传代

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。...

从多能干细胞生成人血管类器官

异源性（化学或动物来源）产品在细胞治疗制备/操作步骤中的引入，与宿主患者免疫反应性增加及病原体传播风险升高相关。本文介绍一种完全无异源成分的细胞分离与 体外...

一种用于人类治疗的无异种来源创新方法分离与培养人脂肪源性干细胞

近期技术进步使得大规模生产成为可能 体外...

一种用于药物开发的全人源肝细胞培养系统

了解从富血小板血浆制备人血小板裂解液的方法，通过冻融循环裂解血小板并离心去除碎片。该方案可产生约三升富含生长因子的无动物血清培养基补充剂，用于支持间充质基质细胞和内皮集落形成细胞的高效增殖。

制备人血小板裂解液（pHPL）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

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