成人内皮细胞集落形成祖细胞的分离和大型规模扩张

只需使用不含动物血清的优化培养基培养总血即可。在 75 平方厘米的培养瓶中，E CFC 粘附在培养瓶表面以去除大部分红细胞和白细胞。第 1 天洗涤培养瓶，第 5 天通过更换总培养基去除剩余细胞。

每隔一天进行一次菌落筛查，或者如果方便，每周筛查 3 次。您应该在第 12 天左右观察第一批菌落。嗨，我叫 Nicole Hoffman，来自医科大学 grots 干细胞研究部门的实验室。

今天，我们将向您展示一种从成人外周血中分离和扩增形成内皮集落的祖细胞或 ECFC 的简化过程。在我们的实验室中，我们使用这个过程来研究 ECFC 在体外和体内的功能和生物学。那么让我们开始吧。

本节首先介绍用于培养的内皮生长培养基 2 的制备和过滤灭菌。EFC 在 20 度的水浴中预热 37 毫升培养基。从肘静脉抽取 5 毫升成人外周血，放入 6 毫升不含防腐剂的肝素钠血液真空管中。

血样必须在采集后两小时内在层流罩中处理。一个带通气盖的 1 75 平方厘米烧瓶、1 个 25 毫升移液器和两个 5 毫升移液器，位于层流工作台中。使用 25 毫升移液器在培养瓶中预填充 15 毫升预热补充的 E GM two。

打开血液档案，使用 5 毫升移液器将所有 5 毫升血液直接转移到培养瓶中。使用移液管用剩余的 5 毫升战前 E GM 2 冲洗空血瓶。将此体积添加到烧瓶中。

关闭培养瓶的通气盖，现在应该有 25 毫升。将培养瓶置于 37 度、5% 二氧化碳和 95% 湿度的培养箱中 24 小时。第二天，在 37 度的水浴中预热 20 毫升补充的 e GM 2 和 30 毫升 PBS，并将 2 个 25 毫升移液器和三个 10 毫升移液器放在层流罩中。

从培养箱中取出装有样品的培养瓶，并使用 25 毫升移液器去除含有非贴壁细胞的培养基血液混合物。注意不要用移液器刮擦培养瓶表面。为避免刮擦贴壁细胞，将 10 mL 预热 PBS 轻轻加入到培养瓶细胞贴壁内表面，并将培养瓶从一侧倾斜到另一侧。

立即取出并丢弃 PBS。重复此作，洗涤两次。接下来，快速而轻柔地工作。

为避免细胞分离，向培养瓶中加入 20 毫升新鲜预热 e GM 二，然后将其放回培养箱中。注意不要将培养瓶引出培养箱超过 5 分钟，每隔一天使用低倍光学显微镜检查培养瓶中是否有 ECFC 生长。从第二天开始，在将战前 20 毫升 EGM 2 接种后第五天，在 37 度的水浴中，并准备 2 个 25 毫升移液器。

快速工作以防止干燥。使用这些备件用新鲜的预热补充 e GM two 替换培养基，这将去除非贴壁细胞。将培养瓶放回培养箱中，每天重复筛选过程。

用新鲜补充的 EGM 替换 30% 的培养基。每周两次。具有鹅卵石形态的典型菌落应在第 12 天左右出现。

标记培养瓶的顶部外侧以指示每个菌落的位置。让菌落生长到第 28 天，除非单个细胞开始分离。一旦确定了原代菌落，就可以在第 14 天和第 28 天之间收获它们，具体取决于它们的大小。

将 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 溶液和 20 毫升 PBS 预热至 37 度。注意不要接触培养瓶的表面，将所有培养基转移到 falcon 管中。稍后用于淬灭胰蛋白酶活性，并用 10 毫升战前 PBS 小心洗涤细胞。

加入 5 毫升 tripsin EDTA，并在 37 度下孵育溶液约 5 分钟，或直到细胞分离。注意孵育时间不要超过 7 分钟，因为胰蛋白酶在孵育后会对细胞产生毒性，请用力敲击培养瓶的侧面以帮助细胞在反应后分离。通过添加大约 10 毫升保存的用过的培养基来淬灭 tryin 蛋白酶活性。

将细胞悬液转移到 50 ml falcon 管中。用 10 ml PBS 洗涤培养瓶一次，并将洗涤液添加到收获的细胞悬液中。在冷冻离心机中以 300 倍 G 离心细胞悬液 7 分钟以收集细胞并去除胰蛋白酶，弃去上清液并立即将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中。

将重悬的细胞放在冰上。按照 Ricardo 和 Phelan 的另一个 JoVE 协议中的描述确定细胞数。然后继续进行 ECFC 扩展。

如果回收的 E CFC 超过 360， 000 个 E CFC，则在回收的 E CFC 少于 260， 000 个 E CFC 的情况下继续进行扩展步骤。考虑在大规模扩增之前进一步扩增细胞。方法是将大约 75， 000 个 EFC 接种在 20 毫升 E GM 中，在 75 平方厘米的细胞培养瓶中接种 2 个 EFC，再培养一周或直到达到汇合。

按照随附的书面方案补充 500 毫升 E GM 二，并在 37 度的水浴中预热该混合物。对于每个大约 2， 500 平方厘米的培养空间，准备一个四层细胞工厂或 CA 4。此外，收集两个新鲜的 Tyvek 瓶盖和一个特殊的无菌漏斗，并将它们储存在层流罩中，以每平方厘米 100 个细胞的起始细胞密度接种 E CFC。

首先，计算每个 CF 4 的细胞数 250.2， 800。将细胞重悬于 500 毫升新鲜的 E GM 2 中，并倒入 CF 4 中。使用无菌漏斗，使用带盖的 Tyvek 盖关闭一个通气孔，并将 CF 纵向倾斜 4 到 1，以允许介质在所有四个层之间均匀分布。

现在，腔室可以向后倾斜，并且可以打开 Tyvek 盖的盖子。请务必使用两个红色盖子保护打开的通风口。这些瓶盖可以在前往培养箱的途中与 CF four 一起购买。

将 CF 4 放入培养箱中，取下红色盖子，以便每周至少更换一次 20% 的气体与战前培养基的培养基，直到 CF 4 汇合。这个过程取决于供体，可能会在 10 到 14 天后发生。最后，如前所述，通过使用战前 Tripsin EDTA 和用过的培养基来淬灭蛋白酶活性，可以收获细胞。

此外，在第 12 天左右使用大约 200 毫升 PVS 进行洗涤。ECFC 集落将开始以典型的鹅卵石形态出现，如您在该集落中看到的那样，或者像第 12 天发现的这个集落一样，以一些分组细胞的形式出现。随着菌落的生长，更多的细胞形成典型的鹅卵石形态。

正如您在这里看到的，15 天后和 18 天后通过免疫化学，分离的 e CFC 可以用典型的内皮细胞表面标志物（如 CD 1 46、CD 1 44、CD 31 发酵和血管性血友病因子）来表征。我们刚刚向您展示了如何在执行此程序时从成人外周血中分离和扩增形成祖细胞的内皮集落。重要的是要记住，该协议的成功率取决于供体，范围为 50% 到 70%就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。