隔离和动物血清自由膨胀的人脐血源性间质基质细胞（MSCs），内皮细胞集落形成祖细胞（ECFCs）

这个协议描述不使用动物血清中产生自体对实验移植的目的的间质基质细胞和内皮细胞集落形成细胞的分离和随后的扩大。

人类脐带是祖细胞容易获得的来源。在本文中，我们描述了一种分离和随后扩增的方案 内皮祖细胞 e CFC，血管壁内的细胞亚群和间充质祖细胞。MSC 来源于单个人类脐带。

首先用剪刀纵向剪开人脐静脉，然后从内血管表面刮下细胞。将细胞从刮刀转移到培养瓶中，等待菌落生长。一些刮下的细胞将表现出祖细胞表型，并将大量增殖以形成大菌落。

一旦这些细胞增殖，e CFC 就可以在新培养瓶中扩增。为了进一步分析，也可以从人脐带中分离出间充质细胞群。将脐带的一部分切成小块，然后转移到无菌培养板中。

几天后，在血管间脊髓组织块周围可以看到基质细胞的生长。将这些细胞转移到新的培养瓶中并扩增它们以进行进一步分析。该方案允许您在 3 到 4 周内从单个起始材料索中获得两种类型的祖细胞谱系。

嗨，我是来自奥地利格拉德医科大学干细胞研究部门 T Strong 博士实验室的 Andreas Danish。今天，我们将向您展示一种从一种脐带密码中分离、扩增和分析人间充质和内皮通道细胞的程序。关于术语，只有一个说明。

我们的细胞被称为多能间充质基质细胞或 MSE 和内皮结肠形成前细胞或 e CSC。我们在实验室中使用该程序来研究非血细胞祖细胞的功能和生物学。那么让我们开始吧。

在细胞分离步骤之前，用 inadine 擦拭层流组织培养罩并收集无菌细胞培养板。细胞培养瓶、PBS 灭菌手术器械、细胞刮刀、试管架、25 mL 试纸 PET 和装有平头针的 5 mL 注射器。请记住在 37 度水浴中预热 alpha MEM 和 EGM 两种细胞培养基。

现在将脐带转移到层流中，并在 PBS 中洗涤两次。要去除污染的血液，请使用无菌的 5 毫升注射器在一侧插管脐带静脉。现在用 PBS 冲洗脐静脉，直到液体流出。

绳子的另一端变得完全透明，没有红色。通过在 75 平方厘米的培养瓶中加入 15 至 20 mL 预热的 EGM 两种培养基，开始内皮集落形成祖细胞分离。将脐带放入装满无菌 PBS 的新板中，并使用手术剪刀将脐带剪成两块，每块长约 5 厘米。

现在插入手术剪刀的一个刀片并纵向切割静脉。此时，助手可以使用镊子固定静脉，同时进行进一步的切割。将静脉开放的脐带放入新板中。

在没有 PBS 的情况下，使用细胞刮刀在静脉内表面摩擦至少 1 厘米的区域。在 EGM 两种培养基中清洗刮刀，以将摩擦的容器细胞释放到培养瓶中。此过程需要重复最多 10 次。

关闭烧瓶，将其放入 37 度、5% 二氧化碳和 95% 湿度的培养箱中。现在 e CFC 已经分离出来，让我们继续讨论 MSC。现在内皮层已被刮掉，使用无菌手术刀将脐带切成非常小的碎片。

1 到 2 毫米。Maximum 使用无菌镊子将这些碎片转移到预先标记的培养板中。在用培养基填充之前，将板子打开至少 5 分钟，以使碎片粘附在塑料表面。

以尽可能低的速度轻轻加入 30 至 35 mL 预热的 α 修饰 MEM。关闭板并将其放入 37 度、5% 二氧化碳和 95% 湿度的培养箱中。从脐带片中生长出的间充质基质细胞需要 3 到 7 天，之后细胞可以扩增。

同时，ECFC 可以扩展，这将在下一步中向您展示。第二天，使用倒置显微镜检查细胞。如果刮擦程序正确完成，第一个增殖的细胞簇将完全可见。

更换 E GM 两种培养基以去除所有未附着的细胞和颗粒。继续扩增细胞并每周更换两次 1/3 的培养基。10 到 12 天后，将定期观察到非常大的内皮集落。

现在，去除培养基并用 PBS 洗涤以去除剩余的蛋白质使用。0.05% 胰蛋白酶 0.7 毫摩尔 EDTA 分离细胞。将细胞转移到新的培养容器中时，请务必选择合适尺寸的培养瓶，以实现低接种密度。

这将有助于进一步扩展。我们的实验室通常将 20 多个大菌落的后代退到 4 个 225 平方厘米的培养瓶中。不要忘记每周更换两次 1/3 的培养基。

在下一节中，类似的协议用于 MSC 扩增。三到七天后，使用倒置显微镜检查附着组织附近梭形细胞的外观。当有足够的细胞生长时，这些碎片往往会随着它们失去与塑料的接触而附着。

10 到 12 天后，取出组织块。使用胰蛋白酶 EDTA 溶液将 MSC 从塑料袋中分离出来，并将细胞转移到大小和数量合适的新培养基预装培养瓶中，以保证细胞扩增过程中的低接种密度。一旦两种细胞类型都扩增完毕，就需要每周两次更换 1/3 的培养基。

染色后进行流式细胞术，以检测指示祖细胞表型的细胞表面标志物表达，并确定没有造血细胞污染。在细胞培养板中以每平方厘米 3 或 10 个细胞的极低接种密度接种纯收获的 e CFC，以保证单菌落生长 14 天后每周两次交换三分之一的培养基。文化的终结。

去除介质。用 PBS 洗涤两次，并用冰冷的固定液固定菌落 在冰箱中放置 15 分钟，丢弃固定液，将板打开晾干 10 分钟。用蒸馏水将细胞再水化 10 分钟。

加入 Harris 血红素溶液，对固定菌落染色 12 分钟。去除血红素溶液并用自来水冲洗板。去除残留的染色液。

使用体视显微镜拍摄每个菌落的照片，并将 jpeg 或 TIFF 格式文件导入您的计算机。使用 image J 软件打开照片并分析每个菌落的准确细胞数，如以下动画所述。打开 image J 软件并使用下拉菜单中的文件打开功能导入菌落图像。

使用该过程继续。Subtract background 函数。使用图像 J 菜单中的椭圆或画笔选择功能标记菌落边距。

使用编辑清除外部功能清除周围图像，然后选择图像裁剪来裁剪图片。使用图像调整阈值功能手动调整阈值，以便所有单元格都完全着色。红。通过选择计算菌落的细胞数。

分析，分析颗粒。选择针对每种细胞类型优化的适当设置，然后选择 okay If performed correctly。该方案允许分离几乎纯净的细胞群，这些细胞群具有人内皮细胞和间充质祖细胞的特征，它们彼此自体，因为它们来自同一条脐带。

从第 5 天开始，纺锤形间充质细胞将从连接到培养板的脐带下方出现。一到两天后，形成祖细胞或 e CFC 的第一簇内皮集落将在倒置显微镜下变得可见。这个快速增长的巨大 e CFC 菌落在 11 天后形成。

MSC 和 E CFC 都可以传代并进一步扩增。我们建议使用流式细胞术对所有培养产物进行后续分析，以确认适当的表型。请记住，内皮细胞系和间充质细胞系都会对 CD 73、CD 1 46、CD 29 和 CD 1 0 5 的特异性抗体产生反应。

请注意，MSC 表达大腿 1，使用抗 CD 90 抗体检测。E CFC 对 CD 31 呈阳性，CD 31 也称为血小板内皮细胞粘附分子或 pcam。众所周知，E CFCs 在脊髓中 CD 34 免疫反应性表达可以通过重复培养来降低。

两种细胞类型的血细胞标志物如 CD 45 H-L-A-D-R 和 CD 14 均保持阴性。使用 Image J 软件可以通过计数每个菌落的准确细胞数来评估 E CFC 中的祖细胞层次结构。我们刚刚向您展示了在执行此程序时如何从人类脐带密码中分离、扩展和分析 MACES 和 ECE。

在无菌条件下工作并在后续研究中使用细胞之前检查表型和纯度非常重要。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。