用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

为了在较长时间内研究单个分子的动态行为，首先必须在空间上对这些分子进行定位。我们通过将分子固定在微流控芯片表面来实现这一目标。该操作流程始于芯片的组装，芯片包含四个用于固定生物分子的腔室。

腔室通过进样和出样毛细管与外部相连。该装置由一个带有微结构的PDMS圆片与石英盖玻片键合而成。组装好的装置随后安装在荧光显微镜上，并将柔性管路连接至毛细管，以便通过腔室更换溶液，首先进行分子固定化表面活化流程，即让生物素化BSA溶液流经其中一个通道。

BSA 会吸附到反应腔室中。随后使链霉亲和素溶液流过表面，链霉亲和素将与生物素结合。最后，流过生物素标记的寡核苷酸，使其与链霉亲和素结合，从而将目标分子固定在石英盖玻片表面。

在整个采集过程中，以恒定流速将成像缓冲液持续注入样品室，该缓冲液旨在最大限度地延长荧光染料的寿命并保持其荧光强度。自动装置扫描表面不同区域，寻找同时带有供体和受体荧光染料的分子，随后将这些分子逐一移入探测区域，分别获取每分子的荧光强度随时间变化的轨迹，直至两种荧光染料均发生光漂白。大家好，我是波士顿大学生物医学工程系Miller教授实验室的Nicholas Dfi。

今天，我们将向您展示一种利用共聚焦装置从固定的核酸分子中获取单分子荧光信号的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究核酸的动力学特性以及核酸与酶之间的相互作用。现在，让我们开始吧。

Microfluid Excel 通过将一个图案化的两毫米厚聚二甲基硅氧烷（PDMS）圆盘与一片 freshly cleaned 石英盖玻片键合而成。制备图案化 PDMS 圆盘时，将 10 份硅弹性体基质与 1 份固化剂混合均匀，并在真空条件下脱气一小时。硅弹性体基质脱气完成后，轻轻将其倒入微流控细胞模具中。

将弹性体混合物置于70摄氏度的加热板上固化两小时。固化后，使用刀片小心地将PDMS圆片从模具上剥离。该PDMS圆片包含四个30 µL的矩形腔室。

将PDMS圆片的平面（即不含微通道的一面）与一英寸见方的玻璃窗通过等离子体氧化法融合在一起，两表面各处理30秒。该玻璃窗在微通道两端预先钻有八个直径为两毫米的孔。随后，将一段两英寸长的柔性熔融石英毛细管插入每个玻璃窗孔中。

首先插入一根针，然后插入毛细管，使其到达通道。使用快速固化的硅胶浇注化合物（如Quick Cast）密封玻璃窗上的孔。在等离子体活化细胞后，用乙醇和水冲洗通道，并将新用piranha溶液清洗过的一英寸圆形石英盖玻片处理30秒。

将盖玻片熔接到含有通道的细胞侧面。此时，腔室已密封。将组装好的细胞在室温下静置固化过夜。

微流控芯片在室温下固化过夜后，将其放入定制的支架中，并固定在共聚焦显微镜的载物台上，以开始激活细胞表面。为实现分子固定化，将柔性管路连接至细胞的毛细管端口，以便使用注射器和针头注入缓冲液。随后向通道中注入含有0.1毫克/毫升生物素化BSA的缓冲液A溶液，并孵育至少30分钟。

孵育30分钟后，加入300至500微升缓冲液A，以去除通道中未吸附的生物素化BSA，注意避免在腔室内产生气泡。接着，注入含有0.1毫克/毫升链霉亲和素（STR din）的缓冲液A溶液，并孵育15分钟。

孵育15分钟后，流入300至500微升缓冲液A，以去除通道中未吸附的链霉亲和素二聚体。操作时仍需避免在腔室中产生气泡。最后，流入浓度为3至5皮摩尔的生物素化样品溶液。

为了检测荧光分子的覆盖情况，需进行表面扫描。将生物素化样品孵育10分钟，并重复缓冲液的流动。如前所述，成像缓冲液（IB）包含酶法除氧系统和三重态淬灭剂（如Trol），配制IB时应先溶解Trol。

将5毫克TRO锁加入10毫升葡萄糖缓冲液中，涡旋混合数分钟，并振荡至少10分钟。过滤该溶液，并在真空条件下脱气10分钟。将TRO锁溶液与Glocky酶解溶液轻轻混合，避免产生气泡。

用IB溶液填充储液池。然后使用机械注射泵控制流速，以每分钟五微升的恒定流速将IB溶液通过通道，同时向IB储液池中通入氩气，以防止大气中的氧气溶解到缓冲液中。表面扫描、分子定位以及单分子荧光强度轨迹的采集均由LabVIEW程序控制，扫描范围为20乘以20平方微米，分辨率为0.2微米，扫描速度为每毫秒0.1微米。

表面扫描的数据会立即进行处理，以获得所有高于背景计数的像素点的强度加权位置。一旦找到固定的分子，就会逐个将其移入共焦体积中，并记录供体和受体荧光团的强度随时间的变化，直至两种荧光团均发生光漂白。随后，载物台被程序设定移动到一个新的原点位置，距离为100毫米，然后重复扫描过程。

组装完成的 MICROFLUID Excel 如图所示。这些是表面扫描图像，显示了绿色供体和红色受体通道中的单分子。图中还展示了一些典型的单分子轨迹，其中受体强度以红色显示，供体以绿色显示。

我们刚刚向您展示了如何使用共聚焦装置从固定的生物分子中获得单分子轨迹。进行此实验时，重要的是要牢记每一步都需谨慎操作并留出充足时间，因为这是一项具有挑战性的实验。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。