Name: 表面固定生物分子的单分子荧光检测的自动化系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 了解单分子荧光共振能量转移技术，通过自动化扫描共聚焦显微镜获取固定于微流控芯片表面的生物分子荧光轨迹，用于研究核酸动态及酶相互作用。该方法为实时分析单分子动力学提供了可靠手段。

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我们感谢Chandran Sabanayagam在系统开发中的帮助，Joshua Edel在微流控装置设计方面的建议，以及哈佛大学罗兰研究所工作人员在装置部件加工方面的支持。我们感谢罗兰研究所和波士顿大学Meller课题组成员的有益讨论，以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校T. Ha课题组成员提供的有益信息。最后，我们感谢美国国家科学基金会（PHY-0701207）和美国国立卫生研究院（GM075893）提供的经费支持。

1 - 组装微流控芯片
微流控细胞由一个图案化的、2 mm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）圆盘与一片 freshly cleaned 石英盖玻片键合而成。该PDMS圆盘包含四个30 μl的矩形腔室，腔室通过入口和出口的柔性毛细管分别连接至缓冲液储液池和注射泵，以实现缓冲液的可控流动。流动池背面由一片玻璃窗支撑，并放置在定制的细胞支架上，该支架包含一个水冷式热电元件，用于调节温度。
<ol>
 <li>制备图案化PDMS圆盘时，将10份硅弹性体基质与1份固化剂混合均匀，并在真空条件下脱气1小时。</li>
 <li>将混合好的弹性体溶液轻轻倒入微流控细胞模具中。在本实验中，模具为一片直径1英寸的硅片，其上由负性光刻胶制成四条微结构（尺寸为1×104 × 1×103 × 300 μm）。将该模具置于70°C加热板上固化2小时。</li>
 <li>使用剃刀小心地将固化的PDMS圆盘从模具上剥离。通过等离子体氧化处理PDMS圆盘和1英寸玻璃窗（玻璃窗两端各含有8个直径为2 mm的预钻孔）表面30秒，然后将玻璃窗键合到PDMS圆盘的平整面（即无微通道的一面）。</li>
 <li>将一段长约2英寸的柔性熔融石英毛细管从每个玻璃窗的孔中插入，直至其进入微通道。可先插入一根针头引导，再插入毛细管，以利于操作。使用快速固化的硅胶封装材料（如Kwik-Cast）密封玻璃窗上的孔。</li>
 <li>用乙醇和水冲洗微通道，并将组装好的芯片与一块新清洁的1英寸圆形石英盖片一同进行等离子体活化处理30秒。建议使用piranha溶液清洁该盖片。将盖片键合至芯片带有微通道的一侧，以密封反应腔室。</li>
 <li>将组装完成的芯片在室温下静置过夜，使其充分固化。</li>
</ol>
* Piranha 是由 H2O2 和 H2SO4 按 1:2.5 比例配制的溶液。清洁盖玻片时，将其浸入 Piranha 溶液中，在 90°C 下处理 20 分钟。
2 - 激活表面以固定分子
在核酸研究中，最简单的表面固定方法是首先将生物素化的牛血清白蛋白（BSA）包被在玻璃或石英盖玻片上，然后包被链霉亲和素。这种方法可使生物素化的样品在室温下高度特异性地固定数天。
<ol>
 <li>将柔性管路连接至毛细管，以便使用注射器和针头轻松注入缓冲液。</li>
 <li>将含有 0.1 mg/ml 生物素化 BSA 的溶液溶于缓冲液 A（10 mM TRIS-HCl，pH 8.0，50 mM NaCl，使用 0.02 μm 滤器过滤）中，注入通道，并孵育至少 30 分钟。</li>
 <li>用 300–500 μl 缓冲液 A 流经通道，以去除通道中未结合的生物素化 BSA，注意避免在腔室内滞留气泡。</li>
 <li>注入含有 0.1 mg/ml 链霉亲和素的缓冲液 A 溶液，孵育 15 分钟，然后重复步骤 3。</li>
 <li>流经含 3–5 pM 生物素化样品的溶液。进行表面扫描以检测荧光分子的覆盖度。如有必要，可提高样品浓度以获得更佳覆盖。孵育 10 分钟后，重复步骤 3。</li>
</ol>
微流控芯片安装在电动化X-Y平台上，该平台利用光学编码直流电机实现粗调（最大25 mm）运动，以及利用两个闭环压电致动器（Physik Instrumente型号M-014或类似产品）实现精细（1 nm）运动。此操作可在激活表面以固定样品之前或之后进行。
3 - 准备成像缓冲液（IB）
成像缓冲液（IB）包含一种酶促耗氧系统和一种三重态猝灭剂（如Trolox）。由于IB需持续过夜灌流，因此应预先准备至少10 ml。
<ol>
 <li>配制 10 ml 含 0.8% w/v D-葡萄糖、至少 35 mM TRIS-HCl（pH 8.0）和 50 mM NaCl 的去离子水溶液。缓冲液浓度较高的原因有两点：Trolox 的溶解会使溶液酸化，且酶促反应会随时间推移降低溶液的 pH。由于该溶液具有较长的保存期限，可作为储备液储存。</li>
 <li>将5 mg Trolox溶于步骤1中制备的缓冲液中，涡旋震荡数分钟，随后振荡混合 &gt;10 分钟。Trolox 在 pH 值下的水中溶解度不高 &gt; 7，因此请勿急于完成此步骤。使用滤器过滤溶液 0.2 μm 过滤后在真空条件下脱气10分钟。</li>
 <li>通过混合制备“gloxy”酶溶液 60 μl 水 20 μl 5X 缓冲液 A 20 μl 过氧化氢酶，1 毫克葡萄糖氧化酶和 100 μl 10 mg/ml BSA溶液，使用滤器过滤该溶液 0.22 μm 离心过滤器</li>
 <li>将第2步的缓冲液与第3步的“gloxy”溶液轻轻混合，避免产生气泡。</li>
 <li>以恒定流速将 IB 流过通道 5 μl/min 使用机械注射泵控制流速。向IB储液槽中通入氩气气泡，以防止空气中的氧气重新溶解到缓冲液中。</li>
</ol>
表面扫描、分子定位以及单分子荧光强度轨迹的采集由一个 LabView 程序控制，该程序可实现自动化数据采集1。该程序以 0.2 μm 的分辨率对 20×20 μm2 的区域进行扫描，扫描速率为 0.1 μm/ms。数据会立即被处理，以获得所有高于背景计数的像素点的强度加权位置。一旦找到固定的分子，它们将被逐一移入共聚焦体积中，并记录供体和受体荧光染料的强度随时间的变化，直至两个荧光染料均发生光漂白。随后，程序控制载物台移动到距离原点 100 μm 的新位置，并重复扫描过程。
4 - 代表性结果
以下是一些图像，展示了组装好的微流控芯片在表面活化前以及安装到显微镜上准备进行分子固定后的状态。如果通道成功活化，表面扫描结果应与下图所示类似，在直接激发供体染料后，可观察到供体（绿色）和受体（红色）的荧光发射。这些分子逐一进入探测区域，其荧光信号随时间被记录，直至两个染料均发生光漂白，如单分子轨迹图所示。通过此类轨迹可计算出FRET效率，从而反映供体与受体之间的瞬时距离，进而用于研究具有生物学意义的分子的结构与动态特性。
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="微流控装置示意图，色谱方法，展示流体通道和毛细作用。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1： 具有四个通道的微流控细胞，每个通道均带有进样/出样毛细管。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="用于发射分析和光谱拟合的光激发装置与光谱组件示意图" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2： 安装在显微镜上、准备进行测量的细胞。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">点击此处</a>查看图2的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="瞬态吸收光谱实验装置；光学激发与发射测量系统。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3： 单分子FRET测量实验装置。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">点击此处</a>查看图3的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="荧光显微镜图像、细胞分布、强度热图、细胞生物学实验。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="荧光显微镜图像；细胞基质中蛋白质分布分析；强度标尺。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 图4和图5：用绿色激光激发的固定化FRET分子表面扫描的红色和绿色通道图像。请点击查看<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">图4</a>或<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">图5</a>的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="光子发射时间图；光学测量中的红-绿轨迹；数据波动分析。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="光子探测图；每毫秒光子数随时间变化，用于光学激发分析的关键数据。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="光子发射分析图，显示强度随时间变化，揭示瞬态吸收变化。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="光子计数图，时间与每毫秒光子数的关系，荧光发射，数据分析。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 图6、图7、图8和图9： 标记在相距8、10、16和18个碱基对的DNA分子上的供体（绿色）和受体（红色）荧光团的强度轨迹。请点击以下链接查看更大版本的<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">图6</a>、<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">图7</a>、<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">图8</a>或<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">图9</a>。

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

尽管上述方案已针对我们的特定系统以及特定染料（TMR 和 ATTO647N）进行了优化，但它绝不是唯一经过验证的方法。最近，一种由原儿茶酸（PCA）和原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD）组成的替代性除氧系统被证明可提高某些染料的光稳定性4。同样，也可使用其他三重态猝灭剂如β-巯基乙醇（BME）替代Trolox，但这些试剂可能无法抑制某些染料（特别是Cy5）的长时间闪烁现象5。
尽管通过生物素-链霉亲和素-生物素化牛血清白蛋白（BSA）进行固定是核酸研究的首选方法，但聚乙二醇（PEG）包被的表面更适用于蛋白质研究，因为它可防止非特异性吸附1。此外，在目标生物分子可能受到表面相互作用影响的情况下，可使用小于衍射极限尺寸的囊泡来包封该生物分子6。
本文中，我们采用配备硅光电倍增管的共聚焦装置来获取荧光强度轨迹。该方案同样适用于配备CCD相机的全内反射荧光显微镜（TIRF）。无论使用何种显微技术，只要对供体和受体信号进行适当校正，单分子FRET即可提供接近埃级（angstrom）的空间分辨率信息7。

<table><tbody><tr><td>熔融石英毛细管</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>熔融石英盖玻片</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>硅酮弹性体试剂盒</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Cast 封固剂</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>硅胶浇铸化合物</td></tr></tbody></table>

用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

荧光共振能量转移（FRET）显微技术已被广泛用于研究核酸和蛋白质等生物分子的结构与动态。对固定化分子进行单分子FRET（sm-FRET）测量，可实现对系统长时间的观测——直至两种染料均发生光漂白——从而获得反映生物分子动力学的时间轨迹，其时间尺度覆盖毫秒至分钟范围。为便于获取大量轨迹数据以进行统计分析，整个过程必须实现自动化，并在整个测量期间（约12小时）严格控制样品环境。这可通过自动化扫描共聚焦显微镜实现，该系统可在夜间连续检测数千个单分子；同时结合微流控芯片，实现缓冲液的可控更换、限制氧气含量，并在整个测量过程中维持恒定温度。本文将展示微流控装置的组装方法及其表面活化以固定DNA的步骤，随后说明如何配制缓冲液以最大程度提高荧光染料的光稳定性和寿命，最后介绍准备实验装置以自动采集DNA分子时间分辨单分子FRET轨迹的具体步骤。

关键词：荧光共振能量转移，单分子FRET，sm-FRET，共聚焦显微镜，微流控装置，DNA固定，光稳定性，时间轨迹，自动化数据采集，生物分子动力学

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。

荧光共振能量转移（FRET）显微技术已被广泛用于研究具有生物学意义的分子结构与动态行为，……

为了在较长时间内研究单个分子的动态行为，首先必须在空间上对这些分子进行定位。我们通过将分子固定在微流控芯片表面来实现这一目标。该操作流程始于芯片的组装，芯片包含四个用于固定生物分子的腔室。腔室通过进样和出样毛细管与外部相连。该装置由一个带有微结构的PDMS圆片与石英盖玻片键合而成。组装好的装置随后安装在荧光显微镜上，并将柔性管路连接至毛细管，以便通过腔室更换溶液，首先进行分子固定化表面活化流程，即让生物素化BSA溶液流经其中一个通道。BSA 会吸附到反应腔室中。随后使链霉亲和素溶液流过表面，链霉亲和素将与生物素结合。最后，流过生物素标记的寡核苷酸，使其与链霉亲和素结合，从而将目标分子固定在石英盖玻片表面。在整个采集过程中，以恒定流速将成像缓冲液持续注入样品室，该缓冲液旨在最大限度地延长荧光染料的寿命并保持其荧光强度。自动装置扫描表面不同区域，寻找同时带有供体和受体荧光染料的分子，随后将这些分子逐一移入探测区域，分别获取每分子的荧光强度随时间变化的轨迹，直至两种荧光染料均发生光漂白。大家好，我是波士顿大学生物医学工程系Miller教授实验室的Nicholas Dfi。今天，我们将向您展示一种利用共聚焦装置从固定的核酸分子中获取单分子荧光信号的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究核酸的动力学特性以及核酸与酶之间的相互作用。现在，让我们开始吧。Microfluid Excel 通过将一个图案化的两毫米厚聚二甲基硅氧烷（PDMS）圆盘与一片 freshly cleaned 石英盖玻片键合而成。制备图案化 PDMS 圆盘时，将 10 份硅弹性体基质与 1 份固化剂混合均匀，并在真空条件下脱气一小时。硅弹性体基质脱气完成后，轻轻将其倒入微流控细胞模具中。将弹性体混合物置于70摄氏度的加热板上固化两小时。固化后，使用刀片小心地将PDMS圆片从模具上剥离。该PDMS圆片包含四个30 µL的矩形腔室。将PDMS圆片的平面（即不含微通道的一面）与一英寸见方的玻璃窗通过等离子体氧化法融合在一起，两表面各处理30秒。该玻璃窗在微通道两端预先钻有八个直径为两毫米的孔。随后，将一段两英寸长的柔性熔融石英毛细管插入每个玻璃窗孔中。首先插入一根针，然后插入毛细管，使其到达通道。使用快速固化的硅胶浇注化合物（如Quick Cast）密封玻璃窗上的孔。在等离子体活化细胞后，用乙醇和水冲洗通道，并将新用piranha溶液清洗过的一英寸圆形石英盖玻片处理30秒。将盖玻片熔接到含有通道的细胞侧面。此时，腔室已密封。将组装好的细胞在室温下静置固化过夜。微流控芯片在室温下固化过夜后，将其放入定制的支架中，并固定在共聚焦显微镜的载物台上，以开始激活细胞表面。为实现分子固定化，将柔性管路连接至细胞的毛细管端口，以便使用注射器和针头注入缓冲液。随后向通道中注入含有0.1毫克/毫升生物素化BSA的缓冲液A溶液，并孵育至少30分钟。孵育30分钟后，加入300至500微升缓冲液A，以去除通道中未吸附的生物素化BSA，注意避免在腔室内产生气泡。接着，注入含有0.1毫克/毫升链霉亲和素（STR din）的缓冲液A溶液，并孵育15分钟。孵育15分钟后，流入300至500微升缓冲液A，以去除通道中未吸附的链霉亲和素二聚体。操作时仍需避免在腔室中产生气泡。最后，流入浓度为3至5皮摩尔的生物素化样品溶液。为了检测荧光分子的覆盖情况，需进行表面扫描。将生物素化样品孵育10分钟，并重复缓冲液的流动。如前所述，成像缓冲液（IB）包含酶法除氧系统和三重态淬灭剂（如Trol），配制IB时应先溶解Trol。将5毫克TRO锁加入10毫升葡萄糖缓冲液中，涡旋混合数分钟，并振荡至少10分钟。过滤该溶液，并在真空条件下脱气10分钟。将TRO锁溶液与Glocky酶解溶液轻轻混合，避免产生气泡。用IB溶液填充储液池。然后使用机械注射泵控制流速，以每分钟五微升的恒定流速将IB溶液通过通道，同时向IB储液池中通入氩气，以防止大气中的氧气溶解到缓冲液中。表面扫描、分子定位以及单分子荧光强度轨迹的采集均由LabVIEW程序控制，扫描范围为20乘以20平方微米，分辨率为0.2微米，扫描速度为每毫秒0.1微米。表面扫描的数据会立即进行处理，以获得所有高于背景计数的像素点的强度加权位置。一旦找到固定的分子，就会逐个将其移入共焦体积中，并记录供体和受体荧光团的强度随时间的变化，直至两种荧光团均发生光漂白。随后，载物台被程序设定移动到一个新的原点位置，距离为100毫米，然后重复扫描过程。组装完成的 MICROFLUID Excel 如图所示。这些是表面扫描图像，显示了绿色供体和红色受体通道中的单分子。图中还展示了一些典型的单分子轨迹，其中受体强度以红色显示，供体以绿色显示。我们刚刚向您展示了如何使用共聚焦装置从固定的生物分子中获得单分子轨迹。进行此实验时，重要的是要牢记每一步都需谨慎操作并留出充足时间，因为这是一项具有挑战性的实验。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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