Name: SC1（Pluripotin）使用，以支持在没有LIF的自我更新MESC (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学习使用小分子SC1在无LIF条件下维持小鼠胚胎干细胞自我更新的方法。通过免疫化学检测SSEA-1、OCT4和NANOG等多能性标志物，验证SC1可作为LIF的经济替代方案用于干细胞培养。

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作者谨感谢斯克里普斯研究所的 Sheng Ding 博士和北京大学的 Hongkui Deng 博士提供的帮助与指导。

1. MEF饲养层平板的制备
<ol>
<li>在培养胚胎干细胞前一天，解冻一管经照射处理的E14.5天CF-1小鼠胚胎成纤维（MEF）饲养层细胞（参见我们关于如何解冻胚胎干细胞的操作步骤）。</li>
<li>将MEF饲养层细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于12孔板中。于37°C、5% CO2条件下培养过夜。MEF细胞培养基：DMEM添加10% ES-PBS、1X谷氨酰胺和1X非必需氨基酸。</li>
</ol>
2. 小鼠胚胎干细胞自我更新的维持
<ol>
<li>使用胰蛋白酶消化分离ES细胞。将细胞以50,000个细胞/孔的密度接种至预先制备好的MEF饲养层培养板中，培养基为生长培养基（ Knockout MEM 添加15% KSR、4 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM 非必需氨基酸和1X BME），并加入所需浓度的SC1（我们使用了100 nM、300 nM和1 μM）。另设一阳性对照孔，添加1000 μ/ml LIF。将细胞置于37°C、5% CO2条件下培养过夜。</li>
<li>在每次传代中，于37°C、5% CO2条件下培养细胞3-4天，每48小时更换一次培养基。</li>
<li>使用胰蛋白酶以1:10至1:15的比例传代细胞，以维持与初始接种密度相近的细胞密度。经过5次传代后，可通过免疫细胞化学方法检测细胞典型多能性标志物的表达情况。</li>
</ol>
3. 多能性标志物的免疫细胞化学检测
<ol>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>加入 500 μl 固定液，在室温下固定细胞 20 分钟。</li>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>加入 500 μl 封闭缓冲液，在室温下封闭非特异性结合位点 1 小时。</li>
<li>加入 250 μl 特异性一抗（我们使用 Nanog、Sox2、SSEA1 和 Oct4，稀释比例分别为 1:500、1:2000、1:500 和 1:500），孵育细胞。</li>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>加入 250 μl 二抗，在室温下避光孵育 2 小时（我们使用 Alexa Fluor® 555 标记的驴抗小鼠 IgG，稀释比例为 1:2000；以及 Alexa Fluor® 488 标记的驴抗兔 IgG，稀释比例为 1:2000）。</li>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>在最后一次洗涤中加入 DAPI（终浓度为 1 μg/ml），孵育 5 分钟以显示细胞核。</li>
<li>在荧光显微镜下观察细胞。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
1. 形态学结果：
小鼠 ES 细胞（ESC R1）在 MEF 饲养层细胞上培养，添加 LIF 或 SC1 以维持其未分化状态下的自我更新。第二次传代后，未添加 LIF 或 SC1 的细胞（阴性对照）中可观察到分化现象；经过 5 次传代后，几乎观察不到未分化的克隆。经 LIF 处理的克隆（阳性对照）在整个 5 次传代过程中均保持未分化状态。经 300 nM 或 100 nM SC1 处理的细胞在 5 次传代后也保持未分化状态，但经 1 μM SC1 处理的细胞在第四次传代后出现细胞死亡。（应用说明图 2）表 1 总结了形态学观察结果。
2. 多能性标志物的表达
经过5代培养的小鼠ES细胞经固定后，通过免疫细胞化学检测SSEA1、Oct4、Nanog和Sox2的表达。其标志物表达情况与在LIF中维持的细胞相似。（应用说明中的图3和图4）
<img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="LIF与SC1培养的R1细胞的相差显微镜图像；细胞形态学比较。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1：在LIF或SC1中维持培养的细胞形态学比较。未观察到形态学上的差异。
<img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="R1细胞的免疫细胞化学染色，LIF和SC1培养条件，标志物Nanog、Sox2、SSEA1、Oct4及DAPI，10倍放大。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2和图3"> 图2和图3：在SC1或LIF条件下维持的胚胎干细胞中Nanog、SSEA1、Sox2和Oct4的染色结果（应用说明图4）。在SC1中维持的细胞与在LIF中维持的细胞显示出相似的多能性标志物表达水平。
表1
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>阴性对照</td>
 <td>LIF 阳性对照</td>
 <td>SC1 1 µM</td>
 <td>SC1 300 nM</td>
 <td>SC1 100 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第1代</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第2代</td>
 <td>部分细胞呈现分化形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第3代</td>
 <td>大多数细胞已分化</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第4代</td>
 <td>无胚胎干细胞克隆形成</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>观察到细胞死亡</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第5代</td>
 <td>已分化</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>观察到细胞死亡</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 <td>正常的胚胎干细胞形态</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

本文作者受雇于Stemgent公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。

小分子SC1可用于维持小鼠胚胎干细胞的自我更新并保持其未分化状态。然而，在未经过测试的细胞系上使用之前，应进行滴定以确定其最佳浓度。例如，我们在小鼠胚胎干细胞系ESC R1上测试了三种浓度：100 nM和300 nM的浓度能够维持小鼠胚胎干细胞的生长，但1 μM的浓度具有毒性。
SC1也可在无饲养层条件下使用。

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>Nanog 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 抗体</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

使用sc1（pluripotin）在无lif条件下维持小鼠胚胎干细胞自我更新

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

小鼠胚胎干细胞（ES细胞）通常在白血病抑制因子（LIF）存在下进行培养，以维持其自我更新能力。1然而，LIF 价格昂贵，且 LIF/JAK/STAT3 通路的激活并非维持自我更新状态所绝对必需的。2SC1 小分子可能是 LIF 的一种经济替代物。SC1 通过同时抑制 Ras-GAP 和 ERK1 发挥作用。3其作用机制的图示使其成为研究自我更新基本分子机制的有用工具。在此，我们演示了在 SC1 存在下培养小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）的步骤，并证明这些细胞能够在无白血病抑制因子（LIF）的条件下维持自我更新能力。在 SC1 培养条件下的细胞表现出与 LIF 维持培养的细胞相似的形态。经过五次传代后，两种条件下的细胞均呈现典型的小鼠 ES 细胞形态。在 SC1 存在下经过五次传代后，仍可观察到典型多能性标志物（Oct4、Sox2、Nanog 和 SSEA1）的表达。此外，SC1 对小鼠 ES 细胞未引起明显毒性。

SC1通过同时抑制Ras-GAP和ERK1发挥作用。我们在无LIF条件下测试了SC1在维持小鼠胚胎干细胞自我更新中的功能，结果表明SC1能够维持小鼠胚胎干细胞培养的自我更新能力。

使用SC1（Pluripotin）在无LIF条件下维持小鼠胚胎干细胞自我更新

小鼠胚胎干细胞（ES细胞）通常在白血病抑制因子（LIF）存在下进行培养，以维持其自我更新能力。然而，LIF价格昂贵，且……

您好，我是来自波士顿STEM Gen实验室的Sarah NAU。今天我们将为您演示一种在小分子C17（C one mouse）存在下维持小鼠胚胎干细胞自我更新的实验方法。通常情况下，胚胎干细胞的培养需要在白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor）存在条件下进行，以维持其自我更新能力。然而，L 的成本较高。因此，本文将提供一种经济的替代方案，即小分子 SC one。在视频的最后部分，我们将展示在 L 中培养的细胞与在 SC one 中培养的细胞之间多能性标志物表达的比较结果。下面我们开始。在培养胚胎干细胞的前一天，将一管经辐照处理的饲养层细胞解冻。以每孔10,000个细胞的密度接种饲养层细胞。在12孔板中，将细胞于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。次日，将ES细胞接种至MEF饲养层上，以每孔50,000个细胞的密度接种于制备好的饲养层培养板中，培养基为添加了SC的生长培养基，SC浓度按实验需求设定，我们使用的浓度分别为100纳摩尔、300纳摩尔和1微摩尔。作为对照，我们加入一个补充了1000微克/毫升LIF的孔。现在将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养过夜。第二天更换培养基以进行连续培养。每48小时更换一次培养基，并每三到四天按1:10的比例传代细胞，以维持与初始接种密度相似的细胞密度。经过五次传代后，即可通过免疫化学方法检测典型多能性标志物的表达，从而开始干细胞的免疫化学分析。首先用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。在室温下，用 500 µL 的 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。用 PBS 再洗涤细胞三次后，在室温下用 500 µL 封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，孵育 1 小时。接下来，向细胞中加入 250 µL 一抗，于 4 °C 条件下过夜孵育。在本实验中，我们使用 nano SOX2、SSEA1 和 OCT4 抗体进行孵育。经过另一轮洗涤后，在避光条件下，将细胞与 250 µL 荧光染料标记的二抗于室温孵育 2 小时，最后再进行一次洗涤，并在最后一次洗涤中加入 DAPI，使其终浓度为 1 µg/mL。然后孵育细胞5分钟，以染色细胞核。最后，在荧光显微镜下分析细胞。图中显示的是在饲养细胞存在下培养的小鼠ES细胞的明场图像，培养条件中分别添加了LIF或SC1，以维持其未分化状态下的自我更新。此处显示的是已传代五次的小鼠 ES 细胞。细胞经固定后，通过免疫细胞化学方法检测 SSEA-1、OCT-4、Nanog 和 SOX-2 的表达。在 C1 培养基中维持的细胞与在 LIF 中维持的细胞，其标志物表达相似。我们刚刚向您展示了如何使用小分子SC1来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新。在进行此操作时，重要的是要记住，在将SC1用于未经测试的细胞系之前，应先进行滴定以确定其最佳浓度。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利。

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生物学

SC1（Pluripotin）使用，以支持在没有LIF的自我更新MESC

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