由Stemgent人类TF慢病毒重新编程人类成纤维细胞生成诱导多能干细胞
December 8th, 2009
我们展示了为生成诱导多能干的干细胞，人类体细胞用慢病毒介导的人为因素OCT4，SOX2，NANOG和Lin28交付协议。多能性证实了形态学和胚胎干（ES）细胞特异性标志物的存在。
大家好，我是 Brad Hamilton。我是 STEM Gen 研发部门的一名科学家。今天，我们将向您展示如何使用慢病毒递送的重编程因子对人类成纤维细胞进行重编程的程序。
该程序可用于生成 IPS 细胞和研究重编程过程。IPS 细胞在形态、增殖和分化能力以及身体的所有组织类型方面与 ES 细胞相似。人类 IPS 细胞比 ES 细胞具有明显的优势，因为它们表现出 ES 细胞的关键特性，而不存在破坏胚胎以获得细胞的道德困境。
患者特异性 IPS 细胞的产生通过消除非自体移植细胞免疫排斥的可能性，规避了个性化再生医学治疗的重要障碍。那么让我们开始吧。在本实验步骤的几个时间点，您将发育中的 IPSC 或诱导多能干细胞的培养基替换为 meth 条件培养基。
准备这种培养基需要 6 天时间。因此，至少在您想要开始实验前一周开始。首先播种每口井的 6 孔。
孔板用 2 次 10 到 5 cf 一个冰毒饲养细胞在 2 毫升冰毒生长中。培养基在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。第二天，将培养基更换为人 E-S-I-P-S 细胞培养物。
培养基在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。收集上清液并更换为新鲜培养基，每 24 小时更换一次，持续 4 天。通过 0.22 微米过滤器过滤上清液。
在收集的上清液中补充每毫升 15 ng 的 BFGF 碱性成纤维细胞生长因子。您最终将得到大约 16 毫升的冰毒调节培养基，每天将收集的上清液分别储存在 4 度 SIU 中。冰毒调节培养基可以在 4 摄氏度下储存一到两周，或在零下 20 摄氏度下储存几个月。
现在您已经确定您的冰毒条件培养基将在需要时准备就绪，让我们谈谈制备细胞。生成 IPSC 的首要任务是利用慢病毒转导人包皮成纤维细胞，或具有干细胞四种转录特征的 BJ 细胞。为了制备转导，以 1 倍 10 的密度接种 BJ 细胞，将 BJ 细胞接种到六孔板的第五个细胞中，并进行培养。
细胞在 2 毫升中生长，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下中过夜。将两毫升用水稀释的 0.1% 明胶加入六孔板中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜，开始制备冰毒饲养板。明胶覆盖在孔中并用作基质。
现在 BJ 细胞已准备好进行慢病毒转导，以准备用于转导的病毒。在两毫升新鲜培养基中补充每毫升 6 微克多脑和四种慢病毒，每种病毒都表达一种人类转录因子。T 4，SO 2 nanog 和 lin 28，使得每个都具有相同的感染或 MOI 复数。
这些慢病毒都包含在人重编程因子慢病毒集中。要进行转导，只需将 BJ 细胞生长培养基替换为含病毒的培养基即可。轻轻摇动板，使培养基均匀地覆盖底部。
在同一天在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。从液氮中取出一小瓶 cf one meth 饲养细胞并解冻。从冰毒喂食板中取出明胶溶液，现在每个喂食板都涂有明胶。
好吧，在两毫升冰毒生长中向第五个细胞中加入 0.2 乘以 10。中等。将 MES 在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。第二天，用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 分离 BJ 细胞，并以 200 G 离心 5 分钟。
离心后，吸出上清液并将细胞重悬于生长培养基中。从冰毒饲养板中取出培养基，并在每孔中加入 2 毫升 BJ 细胞悬液。BJ 细胞浓度应约为每孔 10 至第四个细胞的 5 倍。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。消退 24 小时后，将 BJ 细胞退去 24 小时后，将甲基苯丙胺饲养板上的 BJ 细胞替换为人 E-S-I-P-S，即胚胎干细胞或诱导多能干细胞培养物。中等。继续每 24 小时更换一次介质，持续 7 天。
第 7 天，用 2 mL 冰毒条件培养基替换 ES 细胞培养基。甲基饲养细胞一直在提供培养 IPS 细胞所需的可溶性因子。但现在我们需要添加更多这些因素来保持文化的健康。
冰毒条件培养基包含冰毒饲养细胞分泌的所有可溶性因子，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。通过范围，选择一个细胞集落。其特点是，在新鲜的 24 孔板中呈小而紧凑的圆顶状外观，您在 24 小时前使用 CCF 之前，一个冰毒饲养细胞在人 E-S-I-P-S 培养物中消退选定的菌落。
培养基补充有 10 微摩尔茎分子 Y 2 7 6 3 2。依赖性激酶抑制剂。在前 7 天每 24 小时更换培养基，不补充茎分子 Y 2 7 6 3 2。
7 天后，将培养基换成冰毒。条件培养基继续传代细胞，直到它们显示出典型的人 ES 细胞形态。寻找小而紧凑的圆顶，如具有锋利边缘的菌落。
集落应该是均匀的，并且具有较高的细胞核与细胞质比率。此时，您已经开发了具有 ES 细胞形态的集落，但它们是否也表达了 ES 细胞的基因特征？为了找出多能性标志物的菌落染色，例如 TRA 180、1、TRA one、60、SSEA 4、s、SE、a 3、T、4 sox、2 nanog 和 SSEA one：开始用 PBS 轻轻洗涤细胞 3 次。
接下来，用 500 μL 4% 多聚甲酸酯、醛或其他固定剂在室温下固定细胞 20 分钟。20 分钟后，用 PB S3 洗涤细胞更多次，以去除多余的固定剂。接下来，通过在室温下将细胞在每孔 500 μL 封闭缓冲液中孵育 1 小时来阻断非特异性结合。封闭步骤后，向每个细胞中加入 250 μL 一抗，在封闭缓冲液中稀释 1 至 100
。第二天，将细胞在 4 摄氏度下在一抗中孵育过夜。用 PBS 洗涤细胞 3 次，以去除未结合的一抗。将细胞与 250 μL 稀释液 1 比 300 的二抗和封闭缓冲液在室温下孵育 1 小时，避光以避免与二抗孵育后发生光漂白。
用 PBS 洗涤细胞 3 次，直到第三次洗涤。以每毫升 1 微克的浓度添加 DPI 以对细胞核进行染色。最后，看啊，分析 IPS 细胞的基因表达。
在显微镜形态学结果下，早在转导后第 4 天就观察到用 T 转导的 cot 4 个、SOX、2 nanog 和 lin 28 的人类 4 个皮肤成纤维细胞的形态学变化，并且在第 17 天细胞簇变得更加紧密，表达多元效力标志物。为了进一步表征分离的 IPS 细胞集落，我们寻找了 ES 细胞中表达的常见多能性标志物的存在。菌落表现出强碱性磷酸酶活性。
此外，使用一组多能性标志物特异性抗体对 IPS 细胞集落进行免疫化学或 ICC，包括表面标志物 TA 180 1 TRA 1、60、SSEA 4 和 SS EEA 3，以及核标志物、T 4、SOX 2 和 Nanog。分离的 IPS 集落对所有标记物均呈阳性。ICC 结果表明，IPS 细胞表现出适当的多能性标志物表达模式，表明这些 IPS 细胞与未分化的人 E es 细胞非常相似。
我们刚刚向您展示了如何通过使用 stem gen 对人成纤维细胞进行重编程来生成 IPS 细胞。人重编程因子慢病毒集。执行此过程时，重要的是要考虑几个因素。
首先，在初级转导步骤中，可能需要修改活性病毒与靶标的比率，以实现最佳转导效率。其次，靶细胞的生长条件会影响。重编程的健康细胞和增殖细胞更容易重编程。
第三，当针对不同的细胞数量修改方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整目标细胞数量。最后，应考虑应用岩石抑制剂，例如 Y 2 7 6 3 2 以帮助确保成功的重编程，因为最近的研究表明它在增强人类 Yes 菌落存活方面的效用。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了一种使用慢病毒载体从人类成纤维细胞生成诱导多能干细胞（iPSCs）的详细协议。该过程涉及关键转录因子的传递，所得多能细胞通过其形态和特定标记物进行表征。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 细胞重编程
- 再生医学
背景
- 诱导多能干细胞（iPSCs）与胚胎干细胞（ESCs）具有相似的特性。
- iPSCs可以从体细胞生成，而不涉及与ESCs相关的伦理问题。
- 患者特异性iPSCs可以通过减少免疫排斥风险来增强个性化医疗。
- 该协议利用慢病毒载体引入重编程因子。
研究目的
- 展示从人类成纤维细胞生成iPSCs的可靠方法。
- 提供有关重编程过程及其在再生医学中的应用的见解。
- 通过形态和分子表征确认生成的细胞的多能性。
使用的方法
- 为iPSCs培养制备甲基条件培养基。
- 使用重编程因子对人类包皮成纤维细胞进行慢病毒转染。
- 在特定条件下培养和维持iPSCs。
- 对衍生的细胞集落中的多能标记物进行表征。
主要结果
- 成功生成具有类似于ESCs形态的iPSCs。
- 在衍生的集落中确认了多能标记物的表达。
- 该协议允许高效生产患者特异性iPSCs。
- 展示了在个性化再生疗法中的潜在应用。
结论
- 该协议有效地从人类成纤维细胞生成iPSCs。
- iPSCs表现出多能性的关键特征，使其在研究和治疗中具有价值。
- 该方法为未来的再生医学研究提供了基础。
常见问题
Executive Industry Relevance
Generation of patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human fibroblasts enables disease modeling and target validation without ethical constraints of embryonic stem cells. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a renewable, genetically matched human cell system for pathway interrogation and phenotypic screening. The lentiviral delivery of defined transcription factors offers a scalable, reproducible method to produce iPSCs for downstream assay development and preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a human genetic context using iPSCs derived from patient fibroblasts.
- Operational Value: Provides a renewable source of pluripotent cells for consistent target engagement and pathway modulation studies.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming target relevance in a disease-relevant human system prior to lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized iPSC-derived cells suitable for assay preparation and compound screening workflows.
- Operational Value: Enables production of uniform cell colonies with defined morphology and marker expression for reproducible assay performance.
- Scalability: Lentiviral transduction allows for consistent iPSC generation across multiple wells and plates, supporting medium-to-high throughput screening preparation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Patient-specific iPSCs bridge discovery and preclinical validation by maintaining genetic fidelity to the donor.
- Mechanistic De-risking: Expression of pluripotency markers (TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, Oct4, Sox2, Nanog) confirms cellular identity, reducing ambiguity in downstream differentiation and toxicity studies.
- Predictive Confidence: Morphological and molecular characterization of iPSC colonies enables go/no-go decisions based on pluripotency fidelity before preclinical investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a human-relevant system for mechanistic insight and assay readiness.
- Discovery Biology: Lentiviral reprogramming supports hypothesis testing by generating iPSCs that reflect patient-specific genetics for target validation.
- Screening: Produces conditioned medium and feeder-independent iPSC colonies suitable for assay standardization and compound testing.
- Analytics: Enables quantification of pluripotency via marker expression (alkaline phosphatase, surface and nuclear markers) to assess reprogramming efficiency and consistency.
- Translational Research: Patient-derived iPSCs support continuity into preclinical models by preserving genetic background for disease-relevant differentiation.
- Enterprise Reuse: The Stemgent Human TF Lentivirus Set provides a reusable platform for iPSC generation across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through confirmed pluripotency and reduction of mechanistic ambiguity in human cells.
- Operational Value: Standardization of iPSC production via lentiviral transduction and defined culture conditions (meth conditioned medium, Y-27632).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via early biological de-risking, reducing late-stage failure risk in regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets using patient-specific iPSC models that predict clinical translatability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral transduction, stem cell culture, and immunofluorescence characterization.
- Dependent on lentiviral vector infrastructure and biosafety protocols for handling reprogramming factors.
- Necessitates standardized feeder cell preparation and conditioned medium production for consistent iPSC maintenance.
- Adaptation to alternative fibroblast sources may require optimization of transduction efficiency and selection conditions.
- Practical limitations include variability in reprogramming efficiency based on cell passage, donor variability, and MOI titration needs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
0:09
Introduction
1:05
Preparing Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) Conditioned Medium
2:39
Transducing Human-Foreskin-Fibroblast (BJ) Cells with Stem-Cell-Specific Transcription Factors
6:33
Selecting and Passaging Induced Pluripotent Stem Cell Colonies
9:43
Representative Results: Induced Pluripotent Stem Cell Colonies Morphologically Resemble Stem-Cells and Express Markers of Pluripotency
7:33
Staining Resulting Colonies for Markers of Pluripotency
11:07
Conclusion
