Name: 由Stemgent人类TF慢病毒重新编程人类成纤维细胞生成诱导多能干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-08T19:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 了解如何使用慢病毒载体将转录因子导入人成纤维细胞以生成诱导多能干细胞。该方法通过形态学和分子标记确认细胞多能性，为再生医学研究提供患者特异性细胞来源。

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1. 重编程
<ol>
<li>以每孔 1 × 105 个细胞的密度将 BJ 细胞接种于 6 孔板中。在 37°C、5% CO2 条件下，用 2 ml 生长培养基（450 ml EMEM 加 50 ml 经 ES 认证的 FBS、5 ml 10 mM 非必需氨基酸、5 ml 青霉素/链霉素、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺和 0.9 ml 55 mM β-巯基乙醇）培养细胞过夜。</li>
<li>同日，开始制备 MEF 饲养层板：将 0.1% 的明胶水溶液加入 6 孔板中，37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
<li>孵育后，吸除 BJ 细胞的培养基，每孔加入 2 ml 含 6 μg/ml 多聚素（polybrene）、500 μl hOct4-慢病毒、50 μl hSox2-慢病毒、50 μl hNanog-慢病毒和 50 μl hLin28-慢病毒的生长培养基。轻轻摇动培养板以确保培养基均匀覆盖。37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
<li>同日，从液氮中取出一管 CF-1 MEF 细胞并解冻。吸除明胶包被孔中的液体（见步骤 1.2），按每孔 0.2 × 105 个细胞的密度加入 MEF 饲养层细胞。每孔总体积应为 2 ml MEF 生长培养基（450 ml DMEM 加 50 ml FBS 和 5 ml 非必需氨基酸）。</li>
<li>次日，用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 消化 BJ 细胞，200 × g 离心 5 分钟。吸除上清，用生长培养基重悬细胞。吸除 MEF 饲养层板中的培养基（见步骤 1.4），每孔加入 2 ml BJ 细胞悬液，细胞浓度约为 5 × 104 个细胞/孔。37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
<li>重新接种 24 小时后，更换为人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基（400 ml DMEM/F12 加 100 ml Knockout 血清替代物、5 ml 10 mM 非必需氨基酸、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺、0.9 ml 55 mM β-巯基乙醇和 20 ng/ml 人重组 bFGF）。此后每 24 小时换液一次，持续 7 天。</li>
<li>七天后，将培养基更换为 MEF 条件培养基（见第 2 部分）。</li>
</ol>
2. 小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基的制备
<ol>
<li>以每孔 2 x 105 个细胞的密度，将 CF-1 MEF 饲养层细胞接种于 6 孔板中，每孔加入 2 ml MEF 生长培养基。在 37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
<li>更换为人胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基。在 37°C、5% CO2 条件下继续孵育过夜。</li>
<li>连续四天，每 24 小时收集一次上清液，并通过 0.22 μm 滤膜过滤。</li>
<li>在上清液中添加 50 ng/ml 的 bFGF。</li>
</ol>
3. iPS 克隆筛选与传代
<ol>
<li>选择一个类似胚胎干细胞（ES）的克隆，并将其重新接种于已接种CF-1 MEF饲养层细胞的培养皿中，培养基为添加了10 μM Stemolecule Y27632的人胚胎干细胞/诱导多能干细胞（ES/iPS）培养基。在37°C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
<li>前七天内每24小时更换一次培养基（不添加Stemolecule Y27632）。七天后，更换为MEF条件培养基（制备方法见第2节）。持续传代培养细胞，直至其呈现典型的人胚胎干细胞形态。</li>
</ol>
4. 多能性标志物的免疫细胞化学检测
<ol>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>加入 500 μl 固定液，在室温下固定细胞 20 分钟。</li>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>加入 500 μl 封闭缓冲液，在室温下封闭非特异性结合位点 1 小时。</li>
<li>加入 250 μl 特异性一抗，在 4°C 条件下孵育过夜（我们使用 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4、SSEA-3、Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28，稀释比例为 1:100）。</li>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>加入 250 μl 二抗，在室温下避光孵育 1 小时（我们使用 Goat anti-Mouse IgM Cy3 conjugate、Goat anti-Mouse IgG Cy3 conjugate、Goat anti-Rat IgM Cy3 conjugate 和 Goat anti-Rabbit Cy3 conjugate，稀释比例为 1:300）。</li>
<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞三次。</li>
<li>在最后一次洗涤液中加入 DAPI（终浓度为 1 μg/ml），孵育 5 分钟以显示细胞核。</li>
<li>在显微镜下观察细胞。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果
1. 形态学结果：
人包皮成纤维细胞（BJ细胞）被共同转导了Oct4、Sox2、Nanog和Lin28。转导后第4天即可观察到形态学变化，第17天时细胞簇变得更加紧密（图1）。在第25天手动挑选克隆，并在CF-1 MEF饲养层细胞上进行培养。为了促进重编程后诱导性多能干细胞（iPS细胞）克隆的形成，每次传代时初始过夜接种均使用Stemolecule Y27632（一种ROCK抑制剂）。经过连续三轮的克隆挑选和传代后，观察到具有良好形态的iPS细胞克隆。
2. 多能性标志物的表达：
为了进一步表征分离的诱导多能干细胞（iPS细胞）克隆，我们检测了这些细胞中是否存在在胚胎干细胞（ES细胞）中常见表达的多能性标志物。这些克隆显示出强烈的碱性磷酸酶（AP）活性（图2）。此外，我们对iPS细胞克隆进行免疫细胞化学（ICC）分析，使用一组针对多能性标志物的特异性抗体，包括表面标志物TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4和SSEA-3，以及核内标志物Oct4、Sox2和Nanog。分离的iPS细胞克隆对所有检测标志物均呈阳性（图3）。ICC结果表明，这些iPS细胞表现出典型的多能性标志物表达模式，证明其与未分化的人胚胎干细胞高度相似。
<img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig1.jpg" alt="干细胞分化；显微镜图像；细胞结构观察；生物研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1： 转导后BJ细胞的形态学变化。转导后（A）4天和（B）17天形成的典型iPS细胞克隆的明场图像。
<img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig2.jpg" alt="干细胞集落生长，显微镜图像，组织培养，细胞增殖研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 图 2： 重编程的 BJ 细胞的碱性磷酸酶（AP）活性。使用 Stemgent 碱性磷酸酶染色试剂盒对三个不同的集落进行染色。
<img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig3.jpg" alt="免疫荧光检测结果；利用DAPI分析干细胞标志物Tra-1-80、Sox2、SSEA。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3：人诱导多能干细胞高表达以下胚胎干细胞特异性标志物：表面标志物 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4 和 SSEA-3，以及核内标志物 Oct4、Nanog 和 Sox2。

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (1917).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Rho%2FROCK+pathway+reduces+apoptosis+during+transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors.</a> J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).</li>
</ol>

本文作者受雇于Stemgent公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。

这些结果表明，Stemgent 人转录因子慢病毒套装可通过在人成纤维细胞中诱导转导的转录因子异位表达，高效生成诱导多能干细胞（iPS）克隆。在设计重编程实验时，应考虑多个变量以优化重编程效率。首先，在初次转导步骤中，可能需要调整活性病毒与靶细胞的比例（感染复数，M.O.I.），以达到最佳的转导效率。其次，靶细胞的生长状态会影响重编程效果，健康且具有增殖能力的细胞更易于进行重编程。第三，在针对不同细胞数量修改实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整靶细胞数量。最后，可考虑使用ROCK抑制剂（如Y27632），因为近期研究已证明其有助于提高人胚胎干细胞（hES）克隆的存活率，从而确保重编程成功。4,5

<table><tbody><tr><td>人TF慢病毒套装</td><td>Stemgent</td><td>00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-81 抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0009</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0003</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-3 抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0014</td><td></td></tr></tbody></table>

利用stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

2006年，山中伸弥及其同事首次证明，通过逆转录病毒介导的方式递送并表达 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，能够诱导小鼠成纤维细胞进入多能状态。1 该研究团队还报道，使用逆转录病毒载体递送相同转录因子的人源版本，可成功将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）。2 此外，James Thomson 等 报道，通过慢病毒介导共表达另一组因子（Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28），也能够将人类体细胞重编程为 iPS 细胞。3
诱导多能干细胞（iPS细胞）在形态、增殖能力以及分化为体内所有组织类型的能力方面与胚胎干细胞（ES细胞）相似。与胚胎干细胞相比，人类iPS细胞具有显著优势，因其在不涉及胚胎破坏所引发的伦理问题的前提下，展现了胚胎干细胞的关键特性。患者特异性iPS细胞的生成克服了个性化再生医学治疗中的一个重要障碍，避免了移植非自体细胞可能引发的免疫排斥反应。
本文展示了使用 Stemgent 人源转录因子慢病毒套装对人成纤维细胞进行重编程的实验方案。我们还显示，使用该套装重编程的细胞在转导后第4天即开始呈现诱导性多能干细胞（iPS）的形态特征。通过使用 Stemolecule Y27632，我们在经过三轮连续的克隆挑选和传代后，成功筛选出具有正确形态的iPS细胞。此外，我们证实重编程后的细胞表达多能性标志物碱性磷酸酶（AP），表面标志物 TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-4 和 SSEA-3，以及核内标志物 Oct4、Sox2 和 Nanog。

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

2006年，Yamanaka 及其同事首次证明，通过逆转录病毒介导递送并表达 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 可诱导……

您好，我叫 Brad Hamilton。我是 STEM Gen 公司研发部门的一名科研人员。今天我们将向您展示一种利用慢病毒递送重编程因子来重编程人类成纤维细胞的实验方法。该方法既可用于生成诱导多能干细胞（IPS细胞），也可用于研究重编程过程。IPS细胞在形态、增殖能力以及分化为机体所有组织类型的能力方面均与胚胎干细胞（ES细胞）相似。与ES细胞相比，人类IPS细胞具有显著优势，因其在不涉及破坏胚胎所带来的伦理问题的前提下，仍具备ES细胞的关键特性。生成患者特异性的诱导多能干细胞（iPS细胞）可避免异体移植细胞可能引发的免疫排斥反应，从而克服了个性化再生医学治疗中的一个重要障碍。现在我们开始操作。在本实验方案的多个步骤中，需用甲醇处理过的培养基替换正在发育的iPSC或诱导多能干细胞的原有培养基。制备该培养基需要六天时间，因此请至少在开始实验前一周启动准备工作。首先，在六孔板的每孔中接种。在2毫升甲基生长培养基中加入2 × 10⁵ cfu甲基饲养细胞的孔板，于37°C及5%二氧化碳条件下过夜培养。次日，更换为人类E-S-I-P-S细胞培养基。将培养基置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜孵育。收集上清液，并在四天内每24小时更换一次新鲜培养基。通过0.22微米滤器过滤上清液。向收集的上清液中添加浓度为每毫升15纳克的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）。最终可获得约16毫升的甲基黄酮素条件培养基，将每天收集的上清液在4°C下分别保存。甲基黄酮素条件培养基可在4°C保存1至2周，或在-20°C保存数月。现在，您已确保甲基纤维素条件培养基将在需要时准备就绪，接下来我们讨论细胞的准备工作。生成诱导性多能干细胞（iPSC）的首要步骤是利用慢病毒将四种具有干细胞特征的转录因子导入人包皮成纤维细胞或BJ细胞。为准备转导，需将BJ细胞以每六孔板孔1×10⁵个细胞的密度接种，并进行培养。在当天，将细胞置于2 mL培养基中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜培养。通过向六孔板中加入2 mL用蒸馏水稀释的0.1%明胶，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜孵育，开始制备饲养层培养板。明胶可包被孔板表面，为细胞提供附着基质。现在BJ细胞已准备好进行慢病毒转导，以制备用于转导的病毒。在两毫升新鲜培养基中添加终浓度为六微克每毫升的聚凝胺（polybrene）和四种慢病毒，每种慢病毒分别表达一种人类转录因子：T4、SO2、Nanog和Lin28，确保每种病毒的感染复数（multiplicity of infection, MOI）相同。这些慢病毒均包含在人源重编程因子慢病毒套装中。进行转导时，只需将BJ细胞的生长培养基更换为含有病毒的培养基，然后轻轻摇动培养板，使培养基均匀覆盖底部。同一天在37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜孵育。从液氮中取出一管cf one meth饲养细胞并解冻。移除甲基饲养板中的明胶溶液，此时各孔已包被明胶。将0.2 × 10⁵个细胞加入2 mL甲基纤维素生长培养基中。在37°C和5%二氧化碳条件下过夜培养。次日，用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化BJ细胞，并在200 × g下离心5分钟。离心后，吸除上清液，并将细胞重悬于生长培养基中。移除甲醇饲养板中的培养基，每孔加入 2 毫升 BJ 细胞悬液。每孔 BJ 细胞浓度应约为 5 × 10⁴ 个细胞。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜孵育。在甲醇饲养层板上的BJ细胞复苏24小时后，将培养基更换为人类E-S-I-P-S培养基，即胚胎干细胞或诱导性多能干细胞培养基。此后每24小时更换培养基，持续七天。第7天，将胚胎干细胞培养基更换为2毫升甲醇条件培养基。甲醇饲养层细胞一直提供诱导多能干细胞生长所需的可溶性因子，但现在我们需要添加更多这些因子以维持培养体系的健康状态。甲醇饲养细胞在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育过夜后，所获得的甲醇条件培养基含有所有由甲醇饲养细胞分泌的可溶性因子。通过显微镜观察，选择一个细胞克隆；该克隆在预先铺有ccf1甲醇饲养细胞的24孔板中呈现为新鲜、致密、圆顶状的小型结构，随后将选定的克隆转入人E-S-I-P-S培养体系中进行培养。培养基中添加10微摩尔的干细胞分子Y 2 7 6 3 2，该成分为一种依赖性激酶抑制剂。前七天内，每24小时更换一次培养基，但更换时不再补充干细胞分子Y 2 7 6 3 2。7天后更换为甲醇培养基。继续用该培养基传代培养细胞，直至细胞呈现出典型的人类胚胎干细胞形态。观察具有清晰边缘的小型、致密、圆顶状克隆集落。克隆应大小均一，且核质比高。此时，您已培养出具有胚胎干细胞（ES细胞）形态的克隆，但它们是否也表达ES细胞特征性的基因？为确定这一点，可对克隆进行染色，检测多能性标志物，如TRA-1-80、TRA-1-60、SSEA-4、SSEA-3、T-4-sox-2、nanog和SSEA-1。首先，用PBS轻柔洗涤细胞3次。接下来，在室温下用500微升4%多聚甲醛或其他固定剂固定细胞20分钟。20分钟后，用PBS洗涤细胞3次，以去除多余的固定剂。随后，每孔加入500微升封闭缓冲液，在室温下孵育1小时，以阻断非特异性结合。封闭步骤完成后，向每孔加入250微升用封闭缓冲液按1:100稀释的一抗溶液。将细胞在4°C下与一抗共同孵育过夜，次日进行后续操作。用PBS洗涤细胞3次，以去除未结合的一抗。随后在避光条件下，将细胞与250 µL按1:300比例稀释于封闭缓冲液中的二抗于室温孵育1小时，避免荧光淬灭。用 PBS 清洗细胞三次，直至第三次清洗。加入终浓度为每毫升 1 微克的 DPI 以染色细胞核。最后，检测你的诱导多能干细胞中基因的表达情况。在显微镜下观察到人皮肤成纤维细胞在共转导 T4、SOX2、Nanog 和 Lin28 后的形态学结果：转导后第4天即可观察到形态学变化，到第17天时细胞簇变得更加紧密。为了进一步表征分离的诱导多能干细胞（iPS）克隆，我们检测了胚胎干细胞（ES 细胞）中常见的多能性标志物的表达情况。这些克隆表现出强烈的碱性磷酸酶活性。此外，对iPS细胞集落进行了免疫化学染色（ICC），使用了一系列多能性标志物特异性抗体，包括表面标志物TRA-1-60、SSEA-4和SSEA-3，以及核内标志物Oct4、SOX2和Nanog。分离得到的iPS细胞集落对所有标志物均呈阳性。ICC结果显示，这些iPS细胞表现出正确的多能性标志物表达模式，表明这些iPS细胞与未分化的人胚胎干细胞（ES细胞）非常相似。我们刚刚向您展示了如何利用干细胞基因的慢病毒载体组，通过重编程人成纤维细胞来生成诱导多能干细胞（iPS细胞）。在进行该实验操作时，需考虑多个重要因素。首先，在初次转导步骤中，可能需要调整活性病毒与靶细胞的比例，以达到最佳的转导效率。其次，靶细胞的生长条件会产生影响。健康且具有增殖能力的细胞更易于进行重编程。第三，在针对不同细胞数量调整实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整目标细胞数量。最后，可考虑使用ROCK抑制剂（如Y 2 7 6 3 2），因为近期研究表明该抑制剂有助于提高人类阳性克隆的存活率。以上即为全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

由Stemgent人类TF慢病毒重新编程人类成纤维细胞生成诱导多能干细胞

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

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使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

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关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

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利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

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本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

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利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

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