Name: 人类胚胎干细胞冷冻和解冻 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习人类胚胎干细胞冷冻和解冻的标准操作流程，掌握液氮储存、37°C水浴复苏及饲养层培养技术。该方法确保细胞高存活率，适用于干细胞长期保存与后续实验研究。

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1. 解冻人胚胎干细胞
实验前准备
<ol>
 <li>在解冻人胚胎干细胞（hES细胞）前一天，将经照射处理的CF1品系小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层接种于经明胶包被的6孔组织培养板的一个孔中，使用MEF培养基（DMEM基础培养基添加10%热灭活胎牛血清和1%非必需氨基酸）。于37°C、5% CO2条件下培养过夜。</li>
 <li>在从液氮中取出hES细胞之前，务必准备好所有必需的设备和试剂，确保解冻过程高效且成功。</li>
</ol>
解冻人胚胎干细胞
 <ol start="3">
 <li>使用金属镊子从液氮储存罐中取出一管人胚胎干细胞（hES细胞）冻存管。</li>
 <li>将冻存管在戴着手套的双手之间滚动3-5秒，以去除表面霜冻。</li>
 <li>记录冻存管标签上的信息。</li>
 <li>用金属镊子将冻存管浸入37°C水浴中。轻轻摇晃冻存管，并频繁（但迅速！）将其举至光源前观察解冻进程，以判断冰晶大小。切勿将冻存管的管盖浸入水浴中，以免造成细胞污染。</li>
 <li>当仅剩少量冰晶时，将整个冻存管浸入乙醇中进行表面消毒。</li>
 <li>在无菌生物安全柜内，将冻存管中的内容物直接转移至15 mL锥形离心管底部。</li>
 <li>缓慢向离心管中加入4 mL hES细胞培养基（DMEM/F-12基础培养基，添加20% Knockout血清替代物、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、0.2% β-巯基乙醇和4 ng/mL bFGF）。在加入新培养基的同时，轻轻摇动离心管，使细胞持续均匀混合。</li>
 <li>以200 × g离心5分钟。</li>
 </ol>
hES 细胞接种
<ol start="11">
 <li>当hES细胞处于离心过程中时，准备MEF饲养层培养板，并标注相应的hES细胞信息：细胞系、传代次数和解冻日期。</li>
 <li>当离心剩余时间约为2分钟时，吸除MEF培养基，并向孔中加入1.0 mL PBS。</li>
 <li>将离心后的hES细胞移回生物安全柜，小心吸除上清液。注意不要吸走细胞沉淀，但应尽可能去除上清液，因为该溶液中含有冷冻保存液中的DMSO。</li>
 <li>使用5 mL玻璃移液管加入2.5 mL hES细胞培养基，轻轻吹打3–4次，使细胞沉淀非常轻柔地重悬。</li>
 <li>吸除MEF饲养层孔中的PBS，然后缓慢将全部2.5 mL hES细胞悬液加入6孔板中已准备好的孔内。</li>
 <li>将培养板放入37°C培养箱中，轻轻地前后、左右滑动培养板，使细胞在孔内均匀分布。切勿以环形方式旋转培养板，以免细胞集落集中在孔中央。</li>
 <li>在37°C、5% CO2条件下孵育过夜，使细胞贴壁。</li>
 <li>解冻后的第二天，移除培养基（包括任何漂浮的细胞），并向孔中加入2.5 mL新鲜的hES细胞培养基。</li>
 <li>可选步骤：可将移除的培养基和细胞转移至另一块预先准备好的MEF饲养层培养板中。此步骤通常可形成新的细胞集落，可与原始解冻样品中的细胞平行培养。</li>
 <li>将培养板在37°C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
</ol>
2. 冻存hES细胞
<ol>
 <li>当 hES 细胞在离心机中离心时，在生物安全柜内标记好冻存管，包括细胞系名称、传代次数和冻存日期。hES 细胞冻存的典型密度为每支冻存管冻存一个六孔板中的单孔细胞。 </li>
 <li>hES 细胞离心结束后，将离心管移回生物安全柜。小心吸除上清液，注意不要扰动松散的细胞沉淀。</li>
 <li>用适量的 hES 细胞培养基重悬细胞沉淀：每支冻存管加入 0.5 mL hES 细胞培养基。吹打时务必轻柔，因为 hES 细胞以相对较大的集落片段形式冻存时复苏效果更佳。</li>
 <li>在轻轻摇动离心管的同时，缓慢加入适量（每支冻存管 0.5 mL）的 2X hES 细胞冻存液（60% 定义型胎牛血清、20% hES 细胞培养基和 20% DMSO）。加入冻存液后，极其轻柔地吹打混合 1 至 2 次。</li>
 <li>迅速而轻柔地将 1 mL 细胞悬液加入每支冻存管中。</li>
 <li>将冻存管放入异丙醇冻存盒中，并置于 -80°C 冰箱中过夜。在异丙醇冻存盒中，细胞将以每分钟 1°C 的速率缓慢降温冻存。</li>
 <li>次日，使用金属镊子迅速将冻存管转移至液氮储存罐中。</li>
</ol>
代表性结果
人类胚胎干细胞解冻后的第一天，小克隆可能呈透明状，在显微镜下不易观察。由于新解冻的胚胎干细胞增殖较慢，可能需要数天才可形成明显的克隆（图1）。
图1. 细胞回收与生长。 从液氮中解冻的hES细胞被拍摄了图像 &nbsp;解冻后第1、7和11天

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique</a>. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
</ol>

随附视频演示了一种人胚胎干细胞（hES细胞）的冻存与复苏方法。冻存在液氮中的细胞应进行复苏 尽快进行灌流 以获得最佳复苏效果。解冻细胞时务必格外小心：尽量减少对细胞的操作，并轻柔吹打。一管人胚胎干细胞（hES细胞）可接种至一个6孔板的单孔，或接种至4孔板的全部孔中，并立即放入培养箱。由于在四个独立孔中培养可降低整个培养物因污染而丢失的风险，且在较小的表面积上更易于定位hES细胞克隆，因此首次解冻hES细胞时，建议使用4孔板。
解冻 hES 细胞后的第一天，细胞集落较小，可能呈透明状。应每天更换 hES 细胞培养基，即使在显微镜下尚未观察到明显的集落，因为 hES 细胞可能需要数天的培养时间才能形成稳定的集落。解冻细胞时必须使用新铺的 MEF 饲养层，因为集落通常需要在解冻后 10 至 12 天才能达到适合传代的大小。
解冻时 低代次 人胚胎干细胞（hES细胞）冻存管在使用时，建议扩增并额外冻存多管细胞，以保留低代次细胞库存，用于后续培养和实验。同时，常规将所有“多余”的健康hES细胞进行冻存，以维持充足的冷冻储备，也是一种良好实践。最成功的解冻及后续培养案例，通常来源于高质量、未分化、处于活跃分裂状态的hES细胞克隆，并以较大细胞团块形式轻柔操作，有助于提高冻存后复苏效率。最终细胞团块的大小应与常规传代时接种的团块大小相似或略大。

<table><tbody><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>用于MEF培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），已认证</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>热灭活&lt;br/&gt;用于MEF培养基</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（Knockout Serum Replacement）</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>预先筛选以确保支持hES细胞生长</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>终浓度为[4 ng/mL]</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 mM（100倍浓缩液）&lt;br/&gt;终浓度为[1倍]</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>用D-MEM/F-12配制1 mg/mL的新鲜溶液</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>A型，猪源</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2560</td><td>用于冻存培养基</td></tr><tr><td>定义型胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH300.70.01</td><td>用于冻存培养基</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140675</td><td>用于常规培养</td></tr><tr><td>4孔板</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td>用于解冻细胞</td></tr><tr><td>5 mL玻璃移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27E</td><td>独立包装</td></tr><tr><td>15 mL锥形管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>聚丙烯材质</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5000-1020</td><td>容量1.5 mL</td></tr><tr><td>程序降温盒</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>Mr. Frosty&amp;#8221;</td></tr></tbody></table>

人类胚胎干细胞的冻存与复苏

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

自从詹姆斯·汤姆森等1998年开发了一种在培养中分离和培养人胚胎干细胞（hES）的技术，此后，将细胞冷冻以备后续使用，以及从冻存细胞库中解冻并扩增细胞，已成为常规hES细胞培养中的重要操作步骤。由于hES细胞对冻融过程中的应激极为敏感，必须格外小心。本文演示了从液氮冻存库中快速解冻hES细胞、将其接种至小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，以及为长期保存而进行慢速冷冻的正确操作技术。

自从 James Thomson 等人在 1998 年开发出分离和培养人胚胎干细胞（hES）的技术以来，将细胞冷冻以备后续使用，以及从冻存细胞中复苏并扩增细胞，已成为常规 hES 细胞培养中的重要操作步骤。由于 hES 细胞对冻融过程中的应激极为敏感，必须格外小心。本文演示了从液氮中快速复苏 hES 细胞、将其接种在小鼠胚胎饲养层细胞上的正确技术，以及用于长期保存的缓慢冷冻方法。

自James Thomson等人于1998年开发出在培养中分离和培养人胚胎干细胞（hES）的技术以来，冷冻细胞以备后续使用，以及解冻和扩增细胞……

大家好，我是来自 STEM Gen 的 Leah Kent。今天我们将向您展示如何解冻和冻存人胚胎干细胞。现在就开始吧。复苏人胚胎干细胞时，从液氮中取出冻存管并迅速解冻。在37摄氏度水浴中，将细胞悬液从冻存管转移至锥形管，用含人胚胎干细胞培养基稀释后离心。弃去上清液以形成小的细胞沉淀，然后在接种至六孔细胞培养板的一个孔之前，用新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞沉淀，该孔预先接种有经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。解冻人胚胎干细胞前一天，在甲基纤维素培养基中接种一層经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞或间质细胞至经明胶包被的六孔组织培养板的一个孔中。将培养板于37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育过夜。为确保高效且成功的解冻，请提前准备好所有必要的设备和试剂。在从液氮中取出人源 ESL 之前，使用金属镊子从液氮储存罐中取出一支冻存管的人源 E ESL。戴手套的手将小瓶来回滚动三到五秒。使用金属镊子记录小瓶标签上的信息以去除霜冻。将小瓶浸入37°C水浴中。轻轻旋转冻存管，并通过将冻存管靠近光源处快速观察来频繁检查解冻进程，以查看冰晶的大小。切勿将冻存管的管盖浸入水浴中，以免污染细胞。当仅剩少量冰晶时，将冻存管浸入乙醇中进行消毒，并在无菌生物安全柜中操作，将冻存管中的内容物直接转移至一个15毫升锥形管底部。缓慢向管中加入4毫升人胚胎干细胞培养基。加入新培养基时，轻轻摇动离心管，使细胞持续混匀。将人ES细胞在200 ×g条件下离心5分钟，离心过程中细胞保持在离心机中。从37°C培养箱中取出先前准备好的饲养层培养板，并标记相应的人ESL信息，如细胞系、传代次数和冻存复苏日期。吸弃MEF培养基，并向孔中加入一毫升PBS。将离心后的人类胚胎干细胞（hESCs）重新置于生物安全柜中，小心吸弃上清液。注意不要吸走细胞沉淀，但应尽可能去除上清液，因为该溶液含有冷冻保存液中的DMSO。轻轻加入2.5毫升人ESL培养基，温和悬浮沉淀。使用5毫升玻璃移液管，反复吹打3至4次，吸除MEF饲养层中的PBS。然后缓慢地将全部2.5毫升人胚胎干细胞悬液加入已准备好的六孔板孔中。将培养板放入37摄氏度的培养箱中，并小心地前后、左右轻轻滑动培养板，使细胞均匀分布在孔内，避免菌落集中在孔的中央。切勿以环形方式旋转培养板。在解冻后的第二天，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，使细胞贴壁。移除含有任何悬浮细胞的培养基，并向孔中加入2.5毫升新鲜的人类胚胎干细胞培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜孵育，并继续培养至集落达到可传代的状态。人胚胎干细胞冻存实验方案始于生长在六孔板上的健康中等大小的人胚胎干细胞集落。用IV型胶原酶孵育培养物后，使用5毫升玻璃移液管刮取集落，收集至锥形管中，离心形成松散的细胞沉淀。吸去上清液后，重悬细胞沉淀。先用人类胚胎干细胞培养基重悬，再用两倍体积的冷冻保存液稀释。将细胞均匀分配至1毫升分装液中，分装于冻存管内并进行冷冻保存。在细胞离心过程中，于生物安全柜内标记好冻存管，注明细胞系代数和冻存日期。人胚胎干细胞（E es细胞）常规冻存密度为每支冻存管加入六孔板中一个孔的细胞量。人胚胎干细胞（E ESL）离心结束后，将离心管移回生物安全柜内。从离心管中吸去上清液，注意不要扰动松散的细胞沉淀。用适量的人类ESL培养基重悬细胞沉淀。取0.5毫升人ESL培养液，每支冻存管加入适量培养液。吸取时动作务必轻柔，因为人ES细胞在冷冻时以相对较大的集落片段保存效果更佳。缓慢地轻轻晃动离心管，同时加入适量的2×人ES细胞冻存液至细胞中。加入冻存液后，用移液器极其轻柔地吹打混合溶液一到两次，然后迅速但轻柔地将一毫升细胞悬液加入每个冻存管中。将冻存管放入异丙醇冻存盒中，并置于-80摄氏度冰箱中过夜。在异丙醇冻存盒中，细胞将在次日以每分钟降低1摄氏度的速率进行冷冻。使用金属镊子迅速将冻存管转移至液氮储存罐中。人类胚胎干细胞传代后的第一天，小克隆可能呈透明状，在显微镜下不易观察。由于新传代的人类胚胎干细胞倾向于增殖较慢。它们在培养中可能需要数天时间才能形成稳定的集落。我们刚刚向您展示了如何冻存和复苏人胚胎干细胞培养物。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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