人类胚胎干细胞的冻存与复苏

大家好，我是来自 STEM Gen 的 Leah Kent。今天我们将向您展示如何解冻和冻存人胚胎干细胞。现在就开始吧。

复苏人胚胎干细胞时，从液氮中取出冻存管并迅速解冻。在37摄氏度水浴中，将细胞悬液从冻存管转移至锥形管，用含人胚胎干细胞培养基稀释后离心。弃去上清液以形成小的细胞沉淀，然后在接种至六孔细胞培养板的一个孔之前，用新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞沉淀，该孔预先接种有经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。

解冻人胚胎干细胞前一天，在甲基纤维素培养基中接种一層经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞或间质细胞至经明胶包被的六孔组织培养板的一个孔中。将培养板于37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育过夜。

为确保高效且成功的解冻，请提前准备好所有必要的设备和试剂。在从液氮中取出人源 ESL 之前，使用金属镊子从液氮储存罐中取出一支冻存管的人源 E ESL。

戴手套的手将小瓶来回滚动三到五秒。使用金属镊子记录小瓶标签上的信息以去除霜冻。将小瓶浸入37°C水浴中。

轻轻旋转冻存管，并通过将冻存管靠近光源处快速观察来频繁检查解冻进程，以查看冰晶的大小。切勿将冻存管的管盖浸入水浴中，以免污染细胞。

当仅剩少量冰晶时，将冻存管浸入乙醇中进行消毒，并在无菌生物安全柜中操作，将冻存管中的内容物直接转移至一个15毫升锥形管底部。缓慢向管中加入4毫升人胚胎干细胞培养基。

加入新培养基时，轻轻摇动离心管，使细胞持续混匀。将人ES细胞在200 ×g条件下离心5分钟，离心过程中细胞保持在离心机中。从37°C培养箱中取出先前准备好的饲养层培养板，并标记相应的人ESL信息，如细胞系、传代次数和冻存复苏日期。

吸弃MEF培养基，并向孔中加入一毫升PBS。将离心后的人类胚胎干细胞（hESCs）重新置于生物安全柜中，小心吸弃上清液。注意不要吸走细胞沉淀，但应尽可能去除上清液，因为该溶液含有冷冻保存液中的DMSO。

轻轻加入2.5毫升人ESL培养基，温和悬浮沉淀。使用5毫升玻璃移液管，反复吹打3至4次，吸除MEF饲养层中的PBS。然后缓慢地将全部2.5毫升人胚胎干细胞悬液加入已准备好的六孔板孔中。

将培养板放入37摄氏度的培养箱中，并小心地前后、左右轻轻滑动培养板，使细胞均匀分布在孔内，避免菌落集中在孔的中央。切勿以环形方式旋转培养板。

在解冻后的第二天，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，使细胞贴壁。移除含有任何悬浮细胞的培养基，并向孔中加入2.5毫升新鲜的人类胚胎干细胞培养基。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜孵育，并继续培养至集落达到可传代的状态。人胚胎干细胞冻存实验方案始于生长在六孔板上的健康中等大小的人胚胎干细胞集落。用IV型胶原酶孵育培养物后，使用5毫升玻璃移液管刮取集落，收集至锥形管中，离心形成松散的细胞沉淀。

吸去上清液后，重悬细胞沉淀。先用人类胚胎干细胞培养基重悬，再用两倍体积的冷冻保存液稀释。将细胞均匀分配至1毫升分装液中，分装于冻存管内并进行冷冻保存。

在细胞离心过程中，于生物安全柜内标记好冻存管，注明细胞系代数和冻存日期。人胚胎干细胞（E es细胞）常规冻存密度为每支冻存管加入六孔板中一个孔的细胞量。人胚胎干细胞（E ESL）离心结束后，将离心管移回生物安全柜内。

从离心管中吸去上清液，注意不要扰动松散的细胞沉淀。用适量的人类ESL培养基重悬细胞沉淀。

取0.5毫升人ESL培养液，每支冻存管加入适量培养液。吸取时动作务必轻柔，因为人ES细胞在冷冻时以相对较大的集落片段保存效果更佳。缓慢地轻轻晃动离心管，同时加入适量的2×人ES细胞冻存液至细胞中。

加入冻存液后，用移液器极其轻柔地吹打混合溶液一到两次，然后迅速但轻柔地将一毫升细胞悬液加入每个冻存管中。将冻存管放入异丙醇冻存盒中，并置于-80摄氏度冰箱中过夜。在异丙醇冻存盒中，细胞将在次日以每分钟降低1摄氏度的速率进行冷冻。

使用金属镊子迅速将冻存管转移至液氮储存罐中。人类胚胎干细胞传代后的第一天，小克隆可能呈透明状，在显微镜下不易观察。由于新传代的人类胚胎干细胞倾向于增殖较慢。

它们在培养中可能需要数天时间才能形成稳定的集落。我们刚刚向您展示了如何冻存和复苏人胚胎干细胞培养物。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。