上颌Barbel斑马鱼的研究方法
2009年11月23日
斑马鱼的上颌barbel外皮感觉器官含有外胚层，中胚层和神经嵴衍生物。更重要的是，成人barbel可再生后近端截肢。本视频介绍上颌barbel开发和演示了手术协议，barbel标本收集，嵌入和下游成像诱导再生。
大理石是在两栖动物、爬行动物和鱼类中发现的异质感觉结构集合。斑马鱼长出两对弹珠，一对较小的鼻腔和一对较大的上颌骨。这些透明的附属物可用于研究几种斑马鱼细胞类型的发育、维持和再生。
该视频介绍了上颌骨大理石的发育，并演示了诱导再生的手术方案。几天或几周后收集倒钩，然后解剖和包埋再生和对照。大家好，我是德保罗大学 LeClair 实验室的 Elizabeth LeClair，我是来自西北大学 Fried 医学和儿童纪念研究中心的 Ya Chesky。
今天我们将向您展示一些研究斑马鱼上颌骨大理石的程序。我们使用这些程序来研究斑马鱼大理石的生长和发育。那么让我们开始吧。
在每次受精后大约 30 到 40 天，上颌杠铃在上颌骨后腹角附近表现为透明的上皮芽。随着斑马鱼的成熟，杠铃延伸到一个狭窄的胡须腿附属物，长几毫米。成熟的杠铃包含几种重要的细胞类型，包括色素细胞、腺体细胞、味蕾、循环血管和有髓神经。
最重要的是，大理石在其发展的各个阶段都是透明的。与其他斑马鱼器官一样，上颌杠铃可以在近端截肢后再生。在本节中，我们演示了在上颌骨底部夹住杠铃的程序。
这也可以称为单侧切除术。手术当天，准备两个小鱼水罐，一个用于麻醉，一个用于恢复。麻醉罐含有 0.015% trica，缓冲至 pH 7.0。
在鱼水中，回收罐包含鱼、水和一滴亚甲蓝，以控制真菌感染。通过浸入 trica 水箱麻醉一到三条成年斑马鱼，观察直到游泳动作停止并且胃肠道通气变得缓慢而规律。根据鱼的大小，完全麻醉可能需要 2 到 5 分钟。
使用观赏鱼网将鱼转移到培养皿上的湿纸巾上。使用钝铲，调整鱼的方向，使它们彼此平行。将左侧朝上，将纸巾的一部分折叠在鱼上，以保持鱼的湿润。
接下来，在立体显微镜下使用低角度入射光照射头部，观察培养皿。使用细镊子专注于左上颌大理石的基部。紧紧抓住略远离上颌骨边缘的大理石干。
提起大理石，在镊子的近端插入一把细尖的弹簧剪刀，以保持稳定。剪刀可以接触镊子或培养皿的底部。沿着大理石的轴滑动剪刀的钳口，直到刀刃接近上颌骨的边缘。
切开大理石轴并取出截肢的大理石。这种组织可以单独固定和分析。手术后，将鱼转移到回收箱中。
让鱼恢复几个小时到过夜，然后将鱼放回饲养系统。等待一到两周，让倒钩再生。在下一节中，我们将向您展示如何制备用于分析的固定大理石组织。
该程序从手术后几天、几周或几个月收集并固定的弹珠开始。用缓冲盐水溶液冲洗固定的组织，并从头部左侧解剖掉再生的大理石。不要忘记正确的倒钩，它用作临时存储的控制。
将每对匹配的弹珠移液到培养皿上的一滴盐水中。盖上盖子，走时放在长凳上。将凝胶加热 150 毫升 2% agris，直至完全溶解。
在 50 至 60 摄氏度的水浴中平衡溶液。接下来，组装标准凝胶电泳装置，并向样品中添加 1 到 4 个小齿。将融化的 agros 倒入水平表面上的凝胶模具中，加入刚好足以形成一些非常浅的井。
立即将剩余的 aros 放回温水浴中。插入长玻璃牧场移液器，使移液器达到与 aros 相同的温度。凝胶冷却后，取下梳子，然后取下凝胶模具。
为了牢固地固定凝胶，请用您最喜欢的颜色的实验室胶带将两面贴上胶带。胶带应延伸到 aros 表面上方几毫米，以便稍后可以将额外的 agros 倒入体视显微镜载物台上的凝胶模具位置。放大空井并聚焦边缘。
使用装有弯曲昆虫针的手柄，将培养皿中的弹珠移液到孔附近的凝胶表面。将弹珠拖入井中，然后将它们推到底部。将杠铃彼此平行并靠在孔的长边缘上 包埋前，使用细移液管或实验室纸巾去除多余的液体。
使用加热的玻璃移液管在组织周围轻轻添加新鲜的熔融 agro。在 agros 变硬之前进行最后一刻的调整，不要把井装得太满。通过在附近添加一张带编号的小纸条来记录样本编号。
包埋所有标本后，通过在顶部倒入一层薄薄的 aros 来抚平凝胶的上表面。尽可能少用，这样凝胶就保持透明，便于摄影。凝胶硬化后，可以在体视显微镜下对其进行拍照，以记录每对大理石的大小和形状，并收集形态测量结果以供进一步分析。
可以用手术刀或剃须刀片从凝胶中切出含有匹配弹珠对的琼脂块。然后可以通过标准方法处理这些用于石蜡组织学或冷冻切片。或者，可以用用水冲洗的细针从浆料中解剖出单个大理石，然后处理用于其他下游应用，例如整装免疫组织化学或共聚焦显微镜。
最后，可以将整个凝胶密封在袋子中并冷藏。标本将保存数周。我们刚刚向您展示了如何观察和分析发育和再生的上颌杆。
这是斑马鱼的一个新系统，所以有很多东西有待发现。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概览
本视频介绍了斑马鱼上颌须的发育和再生，这是一个体表感觉器官。它详细介绍了一种诱导再生的手术方案和随后须样本的分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生生物学
- 发育生物学
背景
- 上颌须是斑马鱼的一个感觉结构。
- 它包含各种细胞类型，包括色素细胞和味觉细胞。
- 须可以在切断后再生。
- 了解其发育可以提供有关再生机制的见解。
研究目的
- 展示上颌须切断的手术程序。
- 观察和分析再生过程。
- 为进一步的组织学分析准备样本。
使用的方法
- 使用手术方案切断上颌须。
- 收集和固定再生样本和对照样本。
- 将样本嵌入琼脂中进行成像。
- 进行组织学处理以供进一步分析。
主要结果
- 观察到上颌须的成功再生。
- 样本准备用于详细的形态学分析。
- 手术方案对研究再生有效。
- 获得了关于须细胞组成的见解。
结论
- 斑马鱼上颌须可以作为研究再生的模型。
- 了解其发育可以为再生生物学提供信息。
- 所概述的方法可以应用于其他再生研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
The zebrafish maxillary barbel provides an optically clear, genetically tractable in vivo system for studying multicellular tissue regeneration. Its capacity to regenerate multiple cell types—including sensory neurons, vasculature, pigment cells, and epithelial structures—enables mechanistic de-risking of regenerative targets in early discovery. This model supports predictive confidence in pathway validation by allowing direct visualization of cellular dynamics during repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to tissue regeneration and sensory organ development.
- Operational Value: Provides a reproducible surgical model for amputation and regeneration tracking with internal contralateral controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized biological specimens for quantitative morphometric analysis.
- Operational Value: Embedding in agarose gel allows storage, imaging, and downstream processing for histology or immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant studies of regenerative mechanisms through conserved cellular pathways.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of regrowth relative to anatomical landmarks for comparative analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The maxillary barbel model integrates into discovery biology workflows by providing a live-animal platform for hypothesis testing in regeneration and sensory biology, with outputs feeding into histological and imaging-based analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through inducible regeneration and live imaging of multicellular tissue repair.
- Screening: Enables assay readiness via standardized specimen embedding and morphometric quantification under stereomicroscopy.
- Analytics: Generates quantitative readouts on regrowth rate, morphology, and tissue organization comparable to contralateral controls.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through conserved regenerative cell types and genetic accessibility in zebrafish.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for iterative testing of genetic or pharmacological modulators of regeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of multicellular regeneration dynamics.
- Operational Value: Standardization via surgical landmarking, paired controls, and agarose embedding for consistent specimen preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing ambiguity in mechanistic models of tissue repair.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of regenerative targets based on in vivo functional validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in zebrafish husbandry, microsurgery, and stereomicroscopic dissection.
- Instrumentation needs include fine forceps, spring scissors, agarose gel electrophoresis setup, and stereo microscope for imaging.
- Cross-team standardization requires standardized anesthesia, amputation plane, and recovery protocols.
- Adaptation considerations across model systems are limited by the optical clarity and genetic accessibility unique to zebrafish.
- Practical limitations include the two-week regeneration timeline and dependence on post-fertilization age for consistent barbel maturation.
