A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

通过在称为 ISTH 的技术中结合原位杂交和四染色，可以确定病毒抗原特异性免疫效应细胞与病毒感染的细胞和组织之间的相对数量和空间关系。ISTH 首先将新鲜的 SIV 感染组织包埋在 Agriros 中。使用振动器将组织切成 200 微米厚的切片，并对病毒抗原进行染色。

特异性 CD 8 阳性细胞使用 fit C 标记的 MHC 四聚体。冷冻后，使用低温恒温器将这些染色切片进一步切成 8 微米厚的切片，并进行原位杂交以定位病毒感染的细胞。共聚焦显微镜用于对双染色切片进行成像，并最终重建原始的厚切片，以揭示免疫效应子和靶细胞之间的关系。

使用该程序检查早期 SIV 感染已被证明是随后疾病严重程度的良好预测指标。大家好，我是来自明尼苏达大学微生物学系 Ashley HA 实验室树的 Chinen Lee。我是 Pam Skinner，明尼苏达大学兽医生物医学科学系的助理教授。

今天我们将向您展示一个 inside in the institute 杂交或简称 ISTH 的程序。除了我们今天展示的 Inci Teer 染色结合 Inci 杂交外，我们还常规使用 Inci Teer 染色结合免疫组织化学来确定抗原特异性 CD 8 T 细胞原位的位置、丰度和蛋白质表达谱。今天协助我们进行厚切片原位 you temer 染色的是 Heon Kim 博士和 Terry Matala，并协助我们进行薄切片制备和原位 you 杂交，所以让我们开始吧。

要开始此程序，请将含有无菌 PBSH 的 Vibram 浴冷却至 2 摄氏度。将振动器刀片角度设置为 27 度。尽可能将新鲜组织放在冰上冷藏，并在收获组织后 24 小时内开始手术。

为了最大限度地减少降解冷却，vibram 还有助于切割新鲜组织，修剪掉结缔组织，用手术刀将样品切成小块，然后将碎片放入乳清船中，并用 4% 的低熔点覆盖。PBS 中的农产品在 40 摄氏度左右融化。确保组织与培养皿底部接触，如果组织块漂浮，则将其向下推，在冰上凝固 3 到 5 分钟。

这里使用的是脾脏组织，但淋巴结、阴道、宫颈、子宫或其他新鲜组织也可以用手术刀使用。切开组织周围的 agros，并使用镊子小心地将 agros 包埋的组织转移到组织块上。继续用 Loctite 胶涂布 Vibram 组织块。

一旦组织块放在组织块上，就不要移动它。在冰上晾干约 10 分钟。接下来，将组织块安装在振动器中，并使用死慢前进速度和相对较高的振幅将组织切成 200 微米厚的切片。

使用画笔将切割的切片转移到预装有 1 毫升冷冻 PBSH 的 24 孔组织培养板孔中的专用组织室中。将最多四个组织切片放入每个组织室中。标记样品并用橡皮筋将盖子固定在板上，以便对病毒特异性 T 细胞的组织切片进行染色。

首先在封闭缓冲液中将 ZI 偶联的四聚体稀释至 nwt 0.5 μg/mL。将溶液以每孔 1 毫升的浓度移液到 24 孔板中。将新鲜切割的组织转移到组织室中的板上，并在 4 摄氏度下振荡过夜。

在包含不同样品的组织腔室之间保持一个空孔，以防止后续步骤中溶液的交叉污染。在此步骤中，可以添加针对细胞外或细胞表面蛋白的抗体。对于洗涤，在初次孵育后准备一个含有冷冻 PBSH 的 24 孔组织培养板。

将组织腔室转移到预装板上，每次 20 分钟，洗涤两次，确保在转移前排空组织腔室中的大部分液体。此外，在移动组织腔室时，不要将一个样品的内容物滴入另一个样品中，并监测组织腔室中的切片，以确保它们不会粘在侧面。固定后，用新鲜的 4% Paraldehyde in PBS 溶液在室温下固定切片 2 小时。

用冷 PBSH 洗涤两次，每次 5 分钟，以放大来自四聚体的信号。将切片与兔抗 fitzy 抗体在封闭缓冲液中以 1 比 10， 000 的比例孵育 1 至 3 天。在这个阶段，可以添加针对细胞内表位的抗体。

确保在添加抗体之前渗透细胞并阻断非特异性位点。在第二次长孵育后，可能还需要抗原修复，以放大信号。在 PBSH 中洗涤切片 3 次，每次至少 20 分钟，每次最多数小时。

使用适当的荧光标记抗体进行最终孵育。例如，可以使用山羊抗兔 SI 3 结合兔抗 fitzy 抗体，使四聚体染色细胞发出红色荧光。如果使用小鼠抗体对目标蛋白质（如 CD 8）进行复染以观察杀伤性 T 细胞，则可以使用山羊抗 US Alexa 488 与小鼠抗体结合并使抗体染色细胞发出绿色荧光，必须凭经验确定每种抗体的稀释液。

孵育 1 到 3 天，在孵育期间通过包裹板和锡纸来保护切片避光，然后随着光照淬灭植物落下。最后，再次固定切片以将四聚体和抗体固定到位。用含有 4 毫克/毫升 N 型没食子酸甘油的甘油明胶洗涤并安装在显微镜载玻片上，在零下 20 摄氏度下储存，直到准备用于原位杂交的薄切片。

现在可以用共聚焦显微镜分析原位四聚体染色切片，以确定抗原特异性 CD 的定位、丰度和蛋白质表达模式，图像中显示来自 SIV 感染的隐窝 meac 的脾组织切片用 gag 四聚体染色以标记 SIV 特异性 CD、8 个阳性 T 细胞、CD 20 抗体和 CD 3 抗体。由于抗体抗体的抗体在继续之前，原位分析四聚体很重要。

通过在加热块上以 70 摄氏度加热 200 微米厚的切片 5 分钟来开始薄切片程序，以便从载玻片上分离厚切片。分离切片后，首先用 OCT 填充塑料模具的底部，将它们嵌入干冰上的 OCT 中。然后将组织放在 OCT 顶部并用 OCT 覆盖。

使用低温恒温器从 OCT 包埋切片上切下 8 微米厚的切片，并将 8 微米切片粘附到筒仓载玻片上。然后可以将载玻片储存在零下 80 摄氏度的密封盒中，用于随后的原位杂交。标准原位杂交用于通过 S 35 标记的病毒特异性 rib 探针检测病毒感染的细胞。

该程序还包括使用核轨道乳液和安装载玻片的涂层切片。在荧光兼容的重要介质中，使用配备 epi 管蓝色反射装置的 BioRad MRC 1000 共聚焦显微镜获取共聚焦图像。使用用于红色四荧光染料的 EPI one 605 和用于原位杂交的绿色 CD 8 荧光染料的 EPI 2 522 DF 32 可视化原位四染色。

在开发的无线电签名中，将 EPI 两个蓝色反射用于原位杂交信号产生的银粒。要开始图像采集，请从左到右和从上到下从每个部分采集图像，并确保捕获每个图像时与其相邻图像有大约 20% 的重叠。为避免重建的蒙太奇图像中出现间隙，请根据 Excel 文件中的 bro 和 column 命名每个图像。

从载玻片中收集数据完成后，使用共聚焦辅助软件将每个通道的 Z 系列图像投影到单个图像中，使用作者提供的 Photoshop 7作程序，自动将来自三个通道的投影图像合并为一个 RGB 图像。然后将合并的图像分层拼接在一起，以生成整个部分的蒙太奇图像。使用 metamorph 或 Photoshop 将单个银粒和四聚体染色与蒙太奇中的细胞相关联。

分配病毒 RNA 阳性和四聚体阳性细胞的中心或 OID 的 XY 坐标。将 OID 数据导出到 Excel 文件中，作为每个细胞的数字，并使用在 Excel 文件中收集的数据，从切片中四聚体阳性和病毒 RNA 阳性细胞的总数中确定免疫效应细胞或 e 细胞与病毒靶标或 T 细胞的比率，以捕获四聚体阳性和 RNA 阳性细胞之间的空间关系。将它们各自的绘图从 Excel 文件复制并粘贴到 Photoshop 中的 Photoshop 文档中。

降低图层的不透明度以对齐和缩放网格，使其与颜色一致，选择，然后复制并粘贴到新图层中。蓝色 RNA 阳性细胞的位置丢弃了用于对齐网格的层，四聚体阳性和病毒 RNA 阳性细胞的位置将在扁平化图像中显示。使用此处显示的 ISTH 方法，我们能够跟踪阴道内接种后在该入口和感染扩散到的淋巴组织中对 SIV 感染的免疫反应。

感染后 10 天，这些组织部位有大量感染细胞，但最晚 3 天后，有绿色染色 CD A 阳性细胞，但目前还没有。红色染色的 SIV 特异性 tetra 阳性细胞。因此，免疫反应为时已晚，无法清除感染。

然而，在感染后 3 周，感染细胞的减少清晰可见，尤其是在进入入口处。我们使用 ISTH 表明减少的程度与空间接近度和四聚体阳性免疫效应细胞的相对数量相关。N-S-I-V-R-N-A 阳性靶细胞，我们称之为体内 E 与 T 比率。

使用这种方法可以很容易地可视化空间关系，在这个受感染的淋巴结中，效应细胞为红色，病毒靶标为蓝色。许多效应细胞和靶细胞非常接近，有些区域许多效应细胞围绕着一个 S-I-V-R-N-A 阳性细胞，而在其他区域，一个 S-I-V-R-N-A 阳性细胞单独存在。ETT 的比率是简单地计算的，因为单元格的位置是由 Excel 文件中每个单元格的数字确定并记录的。

病毒感染的最佳控制与红色效应子的大量过量与绿色靶标的 43 比 1 相关。在这种情况下，在感染开始的子宫颈和阴道中，淋巴结中的 ETT 比率较低。高 ETT 比率与病毒载量从峰值降低之间的正相关表明，进入门户处更强大的免疫反应转化为更好的感染控制。

我们刚刚向您展示了如何同时检测非常特异性的 CDAT 细胞和原位病毒感染细胞。这项技术使我们能够同时可视化组织中的抗原特异性 T 细胞和病毒感染细胞。该技术可用于评估基于 CD 8 阳性 T 细胞的疫苗以及其他无价值病原体和宿主相互作用 在执行此程序时。

获得杂交结果之前，请务必保持所有试剂 RNA 的游离状态。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。