Name: 一种技术，同时可视化病毒特异性CD8 + T细胞和病毒感染的细胞原位 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 47 s
Description: 学习原位四聚体染色与原位杂交联合技术（ISTH），用于同时可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的空间关系。该方法可定量分析免疫效应细胞与靶细胞的相互作用，为评估病毒感染结局提供重要工具。

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感谢 J. Sedgewick 在设置共聚焦显微镜以捕获银颗粒图像方面提供的帮助；部分由美国国立卫生研究院研究基金 AI48484（A.T.H.）、AI20048（R.A.）和 AI066314（C.J.M.）以及国家研究资源中心基金 RR00169（加州大学戴维斯分校灵长类动物研究中心，CNPRC）资助。

该方法已用于李 et al., Science 323, 1726-1729 (2009) 报道的研究中，详见 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009)</a>。
原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）联合实验方法
ISTH 实验流程可分为四个步骤：1）对组织中抗原特异性的 CD8+ T 细胞进行 IST 染色；2）通过原位杂交（ISH）检测病毒感染的 RNA+ 细胞；3）对 IST 染色的细胞和病毒 RNA+ 细胞进行共聚焦显微镜成像；4）图像分析，包括图像拼接图的构建以及四聚体阳性细胞和病毒 RNA 阳性细胞的定位图谱绘制。
1. 组织切片中抗原特异性CD8+ T细胞的IST染色。
 <ol>
 <li>使用振动切片机或手术刀将新鲜组织切成200 μm厚的切片。</li>
 <li>将振动切片机浴槽用无菌 PBS-H 预冷，并冷却至 0–2 ℃&deg; C. 将振动切片机刀片角度设置为较陡的27&deg;尽可能将组织置于冰上保持低温，以最大限度减少降解。冷藏后的组织在使用振动切片机进行切片时也更易于操作。</li>
 <li>用手术剪刀或解剖刀将组织切成约0.5 cm宽、0.25 cm高的小块。将组织块放入称量舟或小培养皿中，并用约40&deg;将4% PBS缓冲的低熔点琼脂糖在融化后冷却至适宜温度。确保组织与培养皿底部充分接触，若组织漂浮则将其轻轻压下。置于冰上凝固，通常需要3-5分钟。 </li>
 <li>用Loctite胶将振动切片机组织块进行包被。用解剖刀切除组织周围的琼脂糖，然后用镊子小心地将包裹在琼脂糖中的脆弱组织转移至涂有胶的振动切片机组织块上。组织一旦放置在组织块上后，不得再移动。置于冰上干燥约10分钟。</li>
 <li>将组织块固定于振动切片机上，使用极慢的前进速度和相对较高的振幅，切成200 μm厚的切片。速度和振幅设置因不同振动切片机而异。若无振动切片机，或组织不适合振动切片，则使用手术刀将组织切成薄条。 </li>
 <li>用毛笔将切片转移至含有1 ml预冷PBS-H的24孔细胞培养板孔中的组织切片架内，每孔切片架中放置不超过四片组织切片。用记号笔在细胞培养板盖上标注实验样本信息，并用橡皮筋将盖子固定于板上。 </li>
 <li>对于使用振动切片机切割效果不佳的组织（如肠道），可改用手术刀或剃须刀片尽可能切成薄条。使用手术刀切割的组织条，每个孔中仅放置一片。</li>
 <li>切完组织后立即进行染色。在固定前始终将切片置于低温环境中，以最大限度减少降解，并避免切片干燥。将切片保存在预冷的无菌 PBS-H 中。</li>
 <li>在4°C下，将组织切片与0.5 mg/ml的FITC偶联四聚体溶液在避光条件下孵育过夜。此孵育步骤中可同时加入针对细胞外表位的小鼠或非兔源抗体，例如抗-CD8抗体，按1:200比例用封闭液稀释。本步骤及后续所有孵育步骤均使用1 ml溶液/孔，并在4°C下进行。&deg;将培养板置于摇床上。不同实验样本的组织腔室之间至少间隔一个空孔，以防止后续步骤中溶液交叉污染。 </li>
 <li>一抗孵育后，用预冷的PBS-H溶液洗涤切片两次，每次20分钟。操作时将组织腔室转移至另一含有预冷PBS-H的24孔细胞培养板中。移动组织腔室时，注意避免一个实验样本的液体滴入另一个样本中。后续所有孵育和洗涤步骤均需类似地将组织腔室转移至盛有相应溶液的新鲜培养板中。操作过程中应持续观察组织腔室中的切片，确保切片未黏附于腔室侧壁。 </li>
 <li>用新鲜的PBS缓冲的4%多聚甲醛在室温下固定切片2小时。用冷的PBS-H洗涤2次，每次5分钟。</li>
 <li>用兔抗FITC抗体（例如Biodesign，1:10,000）在封闭液中孵育一至三天。如需共标记，可在此次孵育中同时加入针对细胞内表位的非兔来源抗体。若选择此方案，需在第二次孵育前根据需要暴露表位，并对细胞进行通透和封闭处理。</li>
 <li>若使用针对需要从甲醛固定中进行抗原修复的胞内表位的抗体，可在微波炉中将样本置于0.01 M尿素溶液中煮沸3次，每次10秒，每次加热间隔2分钟。需格外小心，因沸腾溶液可能导致组织切片被冲出孔外。若发生此情况，可用画笔将切片从组织腔侧壁或培养板盖上轻轻推回至相应组织腔底部。若抗体无需抗原修复，则省略此步骤。</li>
 <li>若使用靶向细胞内表位的抗体，在第二次孵育前，用含0.3% Triton X-100和2%正常山羊血清的PBS-H对组织切片中的细胞进行透化和封闭处理，持续一小时。随后在含0.3% Triton X-100和2%正常山羊血清的PBS-H中进行后续抗体孵育步骤。</li>
 <li>第二次孵育后，用 PBS-H 洗涤切片 20 分钟至数小时，重复两次，共洗涤三次。随后进行最终孵育，使用适当荧光标记的二抗，例如将 Cy3 标记的山羊抗兔 IgG 和 Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 各自按 1:1000 比例溶于封闭液中。孵育时间为 1 至 3 天。孵育期间及之后应将培养板用锡箔纸包裹，避光保存，以防荧光分子发生光淬灭。 </li>
 <li>用 PBS-H 洗涤切片 20 分钟至数小时，重复两次，共洗涤三次。 </li>
 <li>对于结合原位杂交的原位四聚体染色，将切片在4%多聚甲醛中后固定1小时，以固定四聚体和抗体的位置，然后再次用PBS-H冲洗切片并封片。</li>
 <li>使用画笔将切片转移至显微镜载玻片上。每张切片用含4mg/ml对羟基苯丙酸丙酯或其他含荧光保护剂的封片剂（如甘油/明胶）覆盖，并加盖盖玻片。将载玻片置于避光的玻片盒中，于-20℃保存。&deg;用酒精清洗培养板并去除盖子上的标签。培养板可重复使用。</li>
 <li>使用共聚焦显微镜分析染色的组织切片，然后可继续进行原位杂交（ISH）。</li>
</ol>
2. 通过原位杂交检测病毒RNA阳性感染细胞。
该原位杂交方案根据我们先前发表的方案4,5进行了如下修改：
<ol><li>从较厚的原位四聚体染色切片中重新切下5-8微米厚的切片。
<ol><li>200 微米厚的切片在 70 ℃ 下加热&deg;在 5 分钟内升温至 C 以使组织切片从载玻片上脱落。 </li>
 <li>然后将切片置于干冰上用OCT包埋。 </li>
 <li>使用冷冻切片机从厚切片中切下8微米的切片，并将其贴附于硅烷化载玻片上。</li>
 <li>载玻片可保存于 -80&deg;在密封盒中于 C 条件下进行后续原位杂交。</li>
</ol>
</li>
<li>原位杂交
<ol>
 <li>将切片依次浸入90%乙醇和DEPC处理水中，每步3分钟，以重新水化组织切片。</li>
 <li>在98℃下，使用10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）加热处理组织切片以进行通透化&deg;在水浴中 37 °C 孵育 15 分钟。</li>
 <li>室温下冷却组织切片 20–30 分钟。 </li>
 <li>用经DEPC处理的水洗涤两次，每次3分钟。</li>
 <li>将切片浸入含0.25%乙酸酐的0.1 M TEA（三乙醇胺，pH 8.0）溶液中，孵育10分钟以乙酰化组织切片。</li>
 <li>将载玻片转移至 0.1 M TEA（pH 8.0）中，孵育 5 分钟。 </li>
 <li>将切片与探针杂交 35S标记的病毒特异性（如HIV-1、SIV）反义探针或正义探针（HIV-1、SIV的阴性对照） 35S标记的LCMV核糖探针（正义与反义链混合）</li>
 <li>在42℃过夜杂交后，用2xSSC洗涤切片两次，每次5分钟&deg;C. </li>
 <li>用STE溶液（0.5 M NaCl，1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 7.5）洗涤切片5分钟。</li>
 <li>在37℃下用RNase A和T1在STE中消化切片&deg;30 分钟，C</li>
 <li>用含50%甲酰胺的2x SSC缓冲液清洗切片5分钟。</li>
 <li>用1x SSC缓冲液清洗切片10分钟。</li>
 <li>用 0.5 x SSC 溶液清洗切片 15 分钟。 </li>
 <li>在含有0.3 M醋酸铵的70%、80%和100%乙醇中依次脱水，每次5分钟。</li>
 <li>用核径迹乳胶覆盖切片</li>
 <li>在暗室中干燥1小时。</li>
 <li>4℃下孵育切片&deg;C，SIV 感染 11 天，LCMV 感染 3 天。</li>
 <li>在 D19（Kodak，货号# 146 4593）中显影 3 分钟，用 dH₂O 漂洗 30 秒，用快速定影液（Rapid Fixer，Kodak，货号# 146 4106）定影 4 分钟，再用 dH₂O 漂洗，每次 5 分钟，共 3 次。</li>
 <li>依次在70%、80%和无水乙醇中脱水，每步5分钟。</li>
 <li>使用与荧光兼容的Permount封片剂封片。</li>
</ol>
</li>
</ol>
3. 获取共聚焦显微镜图像。
 <ol>
 <li>使用 Bio-Rad MRC 1000 共聚焦显微镜，或其他配备 Epi2-Blue Reflection 装置的共聚焦显微镜，采集 ISTH 图像。</li>
 <li>使用 Epi1-605 检测红色四聚体荧光染料，Epi2-522 DF32 检测绿色 CD8 荧光染料，Epi2-Blue Reflection 检测银颗粒（放射自显影中显影的 ISH 信号），放大倍数为 20x（用于 SIV）或 60x（用于 LCMV）。</li>
 <li>在每个视野的三个通道中，以 1 微米为间隔连续采集 Z 轴序列图像。</li>
 <li>按从左到右、从上到下的顺序采集每张切片的图像，并根据其在 Excel 文件中的行和列命名每幅图像。</li>
 <li>每幅图像应与相邻图像保留约 20% 的重叠区域，以避免重建拼接图像时出现间隙。</li>
 </ol>
4. 图像分析：拼接图像重建、细胞中心点计算与空间分析。
<ol>
 <li>使用共聚焦助手软件（Confocal Assistant，版本 4.02）将Z轴序列图像按每个通道投影为单幅图像。</li>
 <li>使用 Photoshop 7.0 的动作程序，自动将三个通道的投影图像合并为一幅 RGB 图像。</li>
 <li>在 Photoshop 7.0 中将合并后的图像按图层拼接，生成一幅拼合图像。</li>
 <li>通过 MetaMorph（版本 7.1.3）或作者提供的 Photoshop 程序，将单个银颗粒和四聚体染色信号与细胞对应，并标定 SIV RNA+ 细胞和四聚体+细胞中心（质心）的 X、Y 坐标。</li>
 <li>将质心数据以数字形式导出至 Excel 文件。通过 Excel 文件中切片内四聚体+细胞与病毒 RNA+ 细胞的总数计算 E:T 比值。</li>
</ol>
通过将红色四聚体阳性细胞和蓝色SIV RNA阳性细胞各自的图表从Excel文件中复制并粘贴到Photoshop文档中，可捕获二者之间的空间关系。将图层不透明度降低以对齐和缩放网格，使其重合后，选择蓝色RNA阳性细胞的位置并将其复制粘贴到新图层中，随后删除用于对齐网格的图层，最终在合并后的图像中显示出四聚体阳性细胞与病毒RNA阳性细胞的位置分布。
5. 附加说明
若切割感染性组织：
在生物安全二级增强型（BSL2.5）实验室中操作。使用剃刀刀片时需特别小心。使用镊子将刀片装入振动切片机的刀片架中。若无法用镊子安装刀片，则应在将组织放入浴槽前完成安装，且不得更换刀片。切片完成后，使用镊子取出刀片。在取出刀片前，先用70%乙醇或DMQ喷洒刀片进行消毒。与常规操作一致，刀片应丢弃至锐器容器中。每次接触组织或罐中受污染的PBS后，应更换外层手套或用消毒剂冲洗。操作结束后，若处理的是传染性材料，需向罐中的PBS加入DMQ消毒剂，并静置数分钟后再行移除。将已消毒的PBS排入下水道。随后用水冲洗罐体，以去除盐分和残留消毒剂。用DMQ清洁工作区和实验器具，再用水冲洗器具。
由生物素化MHC单体制造四聚体：
从贝克曼库尔特公司获取生物素化的MHC I类分子，例如使用Gag（SLYNTVATL）、Pol（ILKEPVHGV）或无关MART肽（ELAGIGILTV）制备的HLA-A *0201/B2m/肽分子。在NIAID四聚体中心制备使用Gag（KIRLRPGGK）或Nef（QVPLRPMTYK）肽的生物素化HLA-A *0301/B2m/肽分子。四聚体通过在8小时内分6次加入FITC标记的ExtraAvidin（Sigma）至生物素化的Mamu A*01/B2m/肽单体中，最终达到4.5:1的摩尔比而生成。缓慢加入ExtraAvidin的原因在于反应早期单体过量，可确保所加入的每分子ExtraAvidin均能结合四个生物素位点。而在反应后期，由于剩余单体减少，该过程效率降低，ExtraAvidin未完全结合四个位点的可能性增加。若一次性加入全部ExtraAvidin，反应效率将降低，导致更多ExtraAvidin分子仅结合2个或3个单体。

<ol><li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li>
<li>Qingsheng, L. i, Skinner, P. J., Ha, S. -J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li>
<li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li>
<li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li>
<li>Li, Q. ingsheng, Estes, J. acobD., Schlievert, P. atrickM., Duan, L. ijie, Brosnahan, A. mandaJ., Southern, P. eterJ., Reilly, C. avanS., Peterson, M. arnieL., Schultz-Darken, N. ancy, Brunner, K. evinG., Nephew, K. arlaR., Pambuccian, S. tefan, Lifson, J. effreyD., &amp, J. ohnV. C. arlis, Haase, A. shleyT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于本报告中使用病毒RNA作为病毒感染细胞的标志物，因此杂交前的所有试剂都应为无RNA酶的。此处描述的原位杂交步骤经过改良，以保留原位四聚体染色的荧光信号。由于原位杂交检测到的病毒感染细胞所产生的放射自显影信号位于约一个细胞直径的深度，因此用于原位四聚体染色的厚切片必须重新切割为5–8微米厚的切片。
本文所述的原位四聚体与原位杂交（ISTH）联用新技术，可实现对病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染靶细胞之间空间关系的同步可视化、定位及分析。该方法可用于评估基于CD8+ T细胞的疫苗，以及其他非病毒病原体与宿主相互作用的研究。本文描述的图像分析方法亦可调整用于研究任何两类在原位相互作用的细胞群体之间的空间关系，例如，我们近期在利用猕猴免疫缺陷病毒感染恒河猴的非人灵长类动物模型研究HIV-1性传播时，即应用了质心定位作图法6

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;溶液与试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;PBS-H 含肝素（100 μg/ml 或 18.7 U/ml）的磷酸盐缓冲液，用于抑制RNase&lt;/li&gt; &lt;li&gt;含肝素（100 μg/ml 或 18.7 U/ml）的 RPMI 组织培养基，用于抑制 RNase 活性&lt;/li&gt; &lt;li&gt;PBS 中的 4% 低熔点琼脂糖&lt;/li&gt; &lt;li&gt;含2%正常山羊血清（或荧光素偶联抗体所用物种的血清）的PBS。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;含2%正常山羊血清和0.3%吐温-100的PBS&lt;/li&gt; &lt;li&gt;MHC I类分子-FITC偶联四聚体&lt;/li&gt; &lt;li&gt;抗FITC抗体，例如BioDesign兔抗FITC&lt;/li&gt; &lt;li&gt;与多种物种IgG高度交叉吸附的荧光素偶联抗兔IgG，适用于多重标记，例如Cy3标记的山羊抗兔IgG&lt;/li&gt; &lt;li&gt;经高度交叉吸附处理的荧光素标记抗小鼠 IgG，适用于多重标记&lt;/li&gt; &lt;li&gt;新鲜的 PBS 缓冲液配制的 4% 多聚甲醛&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0.01M 尿素&lt;/li&gt; &lt;li&gt;含 4mg/ml 没食子酸丙酯的甘油/明胶&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;特殊设备&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;振动切片机&lt;/li&gt; &lt;li&gt;手术刀&lt;/li&gt; &lt;li&gt;剃须刀片&lt;/li&gt; &lt;li&gt;手术剪&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Loctite 快速固化瞬干胶（产品编号 #46551）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;镊子&lt;/li&gt; &lt;li&gt;#2 驼毛画笔。可用剃刀片修剪至所需粗细&lt;/li&gt; &lt;li&gt;24孔平底组织培养板，例如 Falcon 目录号 #353226&lt;/li&gt; &lt;li&gt;组织腔室&lt;/li&gt; &lt;li&gt;锡箔&lt;/li&gt; &lt;li&gt;纸板载玻片夹，例如 Fisher 目录号 12-587-10&lt;/li&gt; &lt;li&gt;共聚焦显微镜&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;IST试剂快速参考&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;PBS-H（含肝素的磷酸盐缓冲液）&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;450 ml 1× PBS&lt;/li&gt; &lt;li&gt;50 ml 1X PBS + 10X 肝素&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;1x PBS + 10X 肝素&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;500 ml 1X PBS &lt;/li&gt; &lt;li&gt;500 mg 肝素粉末（存放于干燥化学品储存架） &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;PBS-H/2% NGS（正常山羊血清）&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;49 ml PBS-H，置于 Falcon 管中 &lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 ml NGS（存放于-20℃冰箱中，以1 ml分装） &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;PBS-H/2% NGS/0.3% Triton X-100&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;49 ml PBS-H/0.3% Triton X-100，置于 Falcon 管中 &lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 ml NGS（存放于-20℃冰箱中，以1 ml分装） &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;PBS-H/0.3% Triton X-100&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;500 ml PBS-H &lt;/li&gt; &lt;li&gt;1.5 ml Triton X-100（这是一种在干燥化学品储存架上找到的黏稠液体） &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;4% LMP 琼脂糖&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;2 g LMP琼脂糖粉末 &lt;/li&gt; &lt;li&gt;50 ml PBS &lt;/li&gt; &lt;li&gt;振荡至混合均匀，微波加热至粉末溶解。 &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;GG-NPG（含正丙基没食子酸酯的明胶甘油）&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;将一瓶甘油明胶置于50度水浴中融化&lt;/li&gt; &lt;li&gt;加入0.06 g没食子酸丙酯（位于Terri的架子上），充分振荡混匀&lt;/li&gt; &lt;li&gt;置于水浴中，间歇摇动，直至溶解。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;分装至1 ml离心管（棕色管）中&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;4% 多聚甲醛&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;4 g 多聚甲醛粉末（存放于干燥化学品储存架） &lt;/li&gt; &lt;li&gt;在量筒中加入约10 ml PBS-H，再加入pf粉末 &lt;/li&gt; &lt;li&gt;加水至体积约为 70 ml &lt;/li&gt; &lt;li&gt;加入一滴管 NaOH。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt;搅拌至溶解（通常约20-30分钟） &lt;/li&gt; &lt;li&gt;加入 HCl，直至 pH 达到 7–8。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt;加水至 100 ml。 &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;0.01 M 尿素&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;0.3 g 尿素（存放于干燥化学品储存架）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;500 ml 水&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

一种可同时原位可视化病毒特异性cd8+ t细胞与病毒感染细胞的技术 in situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

病毒特异性CD8+ T细胞的数量及其相对于被感染靶细胞数量和位置的分布，被认为在决定感染结局（从清除到慢性持续性感染）方面至关重要。本文介绍了一种评估免疫效应细胞（E）即病毒特异性CD8+ T细胞与感染靶标（T）之间空间关系和定量关系的方法，该方法结合原位四聚体（IST）染色以检测病毒特异性CD8+ T细胞，以及原位杂交（ISH）技术以检测发生免疫防御与感染交战的组织中的病毒RNA阳性细胞。IST染色与ISH的联用简称为ISTH，可实现免疫效应细胞与靶细胞位置的可视化与定位绘图，并便于确定E:T比值。这些参数继而可用于分析空间邻近性与免疫应答的时机及强度之间的关系，从而预测早期感染的结局。

一种结合原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）的技术，能够实现病毒特异性CD8+ T细胞与其病毒感染靶细胞之间空间邻近性的可视化、定位和分析，并确定这些免疫效应细胞与靶细胞之间的数量关系及其对感染结局的影响。

一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

病毒特异性CD8+ T细胞的数量及其相对于被感染靶细胞数量和位置的分布，被认为在决定感染结局（从病毒清除到慢性持续性感染）方面至关重要。

通过结合原位杂交与四聚体染色技术（称为ISTH），可确定病毒抗原特异性免疫效应细胞与病毒感染的细胞及组织之间的相对数量和空间关系。ISTH首先将新鲜的SIV感染组织包埋于琼脂糖中，随后使用振动切片机将组织切成200微米厚的切片，并对病毒抗原进行染色。使用FITC标记的MHC四聚体检测特异性CD8+细胞。冷冻后，利用恒冷箱将这些染色组织进一步切成8 µm厚的切片，并进行原位杂交以定位病毒感染的细胞。采用共聚焦显微镜对双重染色切片进行成像，最终重建原始的厚切片，以揭示免疫效应细胞与靶细胞之间的关系。采用此方法检测早期SIV感染已被证明可有效预测后续疾病的严重程度。大家好，我是明尼苏达大学微生物学系Ashley Ha实验室的Chinen Lee。我是明尼苏达大学兽医生物医学科学系的助理教授Pam Skinner。今天我们将向您展示一种在研究所内进行原位杂交的方法，简称ISTH。除了今天演示的使用原位四聚体染色（inci teer staining）与原位杂交（inci hybridization）相结合的方法外，我们还常规采用原位四聚体染色与免疫组织化学相结合的技术，以原位确定抗原特异性CD8+ T细胞的位置、丰度及其蛋白表达谱。今天协助我们完成厚切片原位四聚体染色的是Heon Kim博士和Terry Matala，协助我们进行薄切片制备及原位杂交的是。现在让我们开始吧。开始此操作前，将含有无菌 PBSH 的 Vibram 浴冷却至接近 2 摄氏度。将振动刀片角度设置为 27 度。在可能的情况下，始终将新鲜组织置于冰上保持低温，并在组织收获后 24 小时内开始操作。为了尽量减少冷缺血造成的组织降解，使用振动切片机（vibram）也有助于切割新鲜组织：先去除结缔组织，再用解剖刀将组织切成小块，将组织块放入载蜡槽中，并用4%低熔点琼脂糖（Agros）覆盖，该琼脂糖在PBS中溶解，溶解温度约为40摄氏度。确保组织与培养皿底部充分接触，若组织块漂浮，需将其压下，随后在冰上固定3至5分钟。此处使用脾脏组织，但也可使用淋巴结、阴道、宫颈、子宫或其他新鲜组织，并用手术刀进行操作。用手术刀切除组织周围的琼脂糖块，然后用镊子小心地将嵌入琼脂糖的组织转移至组织块上。接着，用Loctite胶水涂覆Vibram组织块。一旦将组织块放置在组织块上，就不要再移动。在冰上干燥约10分钟。接着，将组织块安装到振动切片机上，使用极慢的前进速度和相对较高的振幅，将组织切成200微米厚的切片。使用画笔将切好的组织切片转移至置于24孔细胞培养板孔内的专用组织孵育腔中，每个孔预先加入1毫升预冷的PBSH。每个组织孵育腔中可放入最多四个组织切片。标记样品，并用橡皮筋将盖子固定在培养板上，以进行针对病毒特异性T细胞的染色。将ZI偶联的四聚体首先用封闭缓冲液稀释至每毫升约0.5微克。将该溶液以每孔1毫升的量加入24孔板中。将新切的组织转移至板内的组织腔室中，并在4摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。在含有不同样本的组织腔室之间保留一个空的腔室，以防止后续步骤中溶液的交叉污染。在此步骤中，可加入针对细胞外或细胞表面蛋白的抗体。洗涤时，在初次孵育后，准备一个含有预冷 PBSH 的 24 孔组织培养板用于洗涤。每次将组织腔室转移至预装好的培养板中，用 PBS 缓冲液清洗两次，每次 20 分钟。转移前务必排干组织腔室中的大部分液体。移动组织腔室时，避免将一个样本的内容物滴入另一个样本中，并观察组织腔室内的切片，确保其未粘附在腔室侧壁上。固定后，在室温下用新鲜的 4% 多聚甲醛 PBS 溶液固定切片两小时。用冷的PBSH洗涤两次，每次五分钟，以放大四聚体信号。将切片与兔抗fitzy抗体在封闭缓冲液中以1:10,000的比例于4℃孵育一至三天。在此阶段，可加入针对细胞内表位的抗体。在添加抗体之前，务必对细胞进行透化处理，并封闭非特异性结合位点。在第二次长时间孵育（旨在扩增信号）之后，可能还需要进行抗原修复。每次用 PBSH 洗涤切片，至少 20 分钟，可长达数小时，共洗涤三次。使用适当的荧光标记抗体进行最终孵育。例如，可使用山羊抗兔SI3抗体结合兔抗fitzy抗体，使四聚体染色的细胞呈现红色荧光。若使用小鼠抗体对感兴趣蛋白（如CD8）进行复染以可视化杀伤性T细胞，则可使用山羊抗小鼠Alexa 488抗体结合小鼠抗体，使抗体染色的细胞呈现绿色荧光。每种抗体的稀释比例需通过实验确定。孵育一至三天，在此期间及之后用锡箔纸包裹培养板以保护切片免受光照，因为光照会淬灭荧光。最后再次固定切片，以确保四聚体和抗体牢固结合。洗涤后，用含有4毫克/毫升对苯二酚（N-propyl gallate）的明胶甘油封片剂将切片封固于载玻片上，于-20 °C保存，直至进行原位杂交前制备薄切片。现在可以使用共聚焦显微镜分析原位四聚体染色切片，以确定抗原特异性CD8+ T细胞在组织中的定位、丰度及蛋白质表达模式。图中所示为SIV感染的猕猴脾脏组织切片，使用gag四聚体染色标记SIV特异性CD8+ T细胞，并用CD20抗体和CD3抗体进行染色。由于后续步骤中抗体的复染信号将会丢失，因此在继续下一步之前，必须先完成对原位四聚体的分析。通过将200微米厚的切片置于加热块上于70摄氏度加热五分钟，开始薄切片程序，以使厚切片从载玻片上脱落。切片脱落后，将其包埋于OCT中并置于干冰上：首先在塑料模具底部填充OCT，然后将组织置于OCT之上，并用OCT覆盖组织。使用冷冻切片机从OCT包埋的组织中切下8 µm厚的切片，并将8 µm切片贴附至硅化载玻片上。切片随后可置于密封盒中，于-80 °C保存，以备后续进行原位杂交。采用标准原位杂交方法，利用³⁵S标记的病毒特异性核糖探针检测病毒感染的细胞。该步骤还包括用核径迹乳胶包被切片并封片。使用配备反射蓝光管装置的 BioRad MRC 1000 共聚焦显微镜，在与荧光兼容的封片介质中获取共聚焦图像。原位四聚体染色通过 EPI one 605 检测红色四聚体荧光染料，以及通过 EPI 2 522 DF 32 检测绿色 CD8 荧光染料，用于原位杂交。使用EPI双蓝反射来观察在放射自显影中由原位杂交信号产生的银颗粒。开始图像采集时，应从每张切片的左到右、上到下依次采集图像，并确保每幅图像与其相邻图像之间有约20%的重叠。为避免重建的拼接图像中出现间隙，应在Excel文件中根据图像的行和列对每幅图像进行命名。当载玻片的数据采集完成后，使用共聚焦辅助软件，通过作者提供的Photoshop七步操作程序，将每个通道的Z轴序列图像投影为单个图像，并自动将三个通道的投影图像合并为一个RGB图像。然后将合并后的图像分层拼接，生成整个切片的拼合图像。使用Metamorph或Photoshop将单个银颗粒和四聚体染色与拼合图像中的细胞对应起来。为病毒RNA阳性细胞和四聚体阳性细胞的中心或OID分配XY坐标。将OID数据以每个细胞的数值形式导出至Excel文件，并利用Excel文件中收集的数据，根据切片中四聚体阳性细胞与病毒RNA阳性细胞的总数，确定免疫效应细胞（E细胞）与病毒靶细胞（T细胞）的比例，以捕捉四聚体阳性细胞与RNA阳性细胞之间的空间关系。从Excel文件中复制各自的图表并粘贴到Photoshop文档中。降低图层的不透明度，以对齐和缩放网格，使其颜色重合，选择后复制并粘贴到新图层中。丢弃用于对齐网格的图层后，蓝色RNA阳性细胞以及四聚体阳性与病毒RNA阳性细胞的位置将在合并后的图像中显现。通过此处展示的ISTH方法，我们能够追踪SIV感染在阴道内接种后于该入口部位及感染扩散所及的淋巴组织中的免疫应答过程。感染后10天，这些组织部位存在大量感染细胞，但即使到了三天后，仍仅有绿色染色的CD8阳性细胞，尚未出现红色染色的SIV特异性四聚体阳性细胞。因此，免疫反应出现过晚，无法清除感染。然而，在感染后三周，感染细胞的数量明显减少，尤其是在入侵门户处。我们采用 ISTH 方法显示，这种减少的程度与四聚体阳性免疫效应细胞的空间 proximity 及相对数量相关。N-S-I-V-R-N-A 阳性的靶细胞，我们称之为体内 E 与 T 的比值（E:T 比值）。通过该方法，可轻松可视化此感染淋巴结中效应细胞（红色）与病毒靶细胞（蓝色）之间的空间关系。许多效应细胞与靶细胞彼此靠近，某些区域可见多个效应细胞围绕单个S-I-V-R-N-A阳性细胞，而其他区域则可见S-I-V-R-N-A阳性细胞单独存在。当细胞位置被确定并记录在Excel文件中时，E:T比值可直接根据各类细胞的数量计算得出。对病毒感染的最佳控制与红色效应细胞相对于绿色靶细胞的显著过量相关，比例达到43比1。在此情况下，在感染起始部位——宫颈和阴道中的ETT比值低于淋巴结中的比值。高ETT比值与病毒载量从峰值下降之间存在正相关关系，表明在感染入口处更强烈的免疫反应可转化为对感染更有效的控制。我们刚刚向您展示了如何在原位同时检测特异性的 CDAT 细胞和病毒感染细胞。该技术使我们能够在组织中同时观察抗原特异性 T 细胞和病毒感染细胞。在进行此操作时，该技术可用于评估基于 CD8 阳性 T 细胞的疫苗以及其他非病毒病原体与宿主之间的相互作用。在进行杂交实验之前，保持所有试剂无RNA酶污染非常重要。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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一种技术，同时可视化病毒特异性CD8 + T细胞和病毒感染的细胞原位</em

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

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本视频介绍了在人类肺癌组织切片中，利用荧光标记抗体对驻留的肿瘤浸润性CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可通过共聚焦显微镜对CD8...

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本视频演示了一种 原位 利用荧光多光谱成像技术分析肿瘤组织中不同亚群的浸润性T细胞。将肾细胞癌组织冷冻切片用抗体处理，标记表达特定抑制性受体并呈现免疫治疗耐受表型的CD8+ T细胞。通过多光谱显微镜观察标记后的切片，以鉴定不同的CD8+...

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T细胞信号复合体形成的实时活体成像

本方案描述了一种对人肺肿瘤组织切片中经荧光标记抗体标记的驻留性肿瘤浸润CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可利用共聚焦显微镜对CD8...

体外 利用共聚焦显微镜成像人肺癌组织切片中的驻留性CD8 T淋巴细胞

此处，我们介绍一种结合了 原位 使用MHC四聚体染色结合免疫组织化学技术确定组织中抗原特异性T细胞的定位、表型及数量。该方案用于分析抗原特异性CD8 T细胞在组织中相对于其他细胞类型和结构的空间分布及表型特征。...

原位 MHC-四聚体染色及定量分析以确定组织中抗原特异性CD8 T细胞的位置、丰度和表型

本文介绍了一种用于体外定性检测抗原特异性CD8+...

通过MHC I类四聚体染色法在病毒载体疫苗接种后同时定量抗载体和抗转基因特异性CD8+ T细胞

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

学习原位四聚体染色与原位杂交联合技术（ISTH），用于同时可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的空间关系。该方法可定量分析免疫效应细胞与靶细胞的相互作用，为评估病毒感染结局提供重要工具。

一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

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