主动脉环含量
November 24th, 2009
血管生成，从预先存在的血管的血管的萌芽，是与自然和病理过程中。在这里，我们展示了一个主动脉环实验允许的血管生成potentiators和抑制剂可直接添加到文化的主动脉环。发芽和neovessel产物，可以通过检查为期6-12天的主动脉环确定。
主动脉环测定的总体目标是提供一个灵活的实验系统，其中血管从 3D 基质内的整块小鼠主动脉中发芽。这是通过首先从小鼠身上解剖胸主动脉，然后仔细清洁其周围组织的任何残留来实现的。将干净的主动脉或主动脉环切片放入 48 孔板的各个孔中，每个孔都装有模制成圆顶的基底基质提取物或 BME。
额外的一滴 BME 将戒指包裹在 3D 结构中。基质可以包含任何选择的实验试剂。孵育数天后，可以观察到血管从主动脉环中发芽，并且可以评估测试化合物的血管生成潜力。
嗨，我是来自以色列贝舍瓦 Negative 大学临床生物化学系 E Lewis 博士实验室的 Karen Bein。今天，我们将向您展示小鼠主动脉环测定的程序。我们在实验室中使用该程序来研究各种材料对血管形成的影响。
那么让我们开始吧。要开始此过程，请让基底基质提取物或 BME 在冰上或 4 摄氏度下解冻。解冻后，继续保持 BME 低温以防止其再次凝固。
在实验当天，通过标准氯胺酮和甲苯噻嗪注射对 6 至 7 周龄的小鼠实施安乐死，通过颈部动脉快速出血，然后颈椎脱位。通过在无菌层流罩中用 70% 乙醇擦拭动物来开始该程序。接下来，在解剖镜下工作时，使用无菌镊子和解剖剪刀对皮肤进行垂直切口并打开腹膜壁。
应做切口以露出胸骨上部，胸腔也被切开并去除隔膜。继续小心地将所有器官推到一边，完全暴露位于脊柱旁边的胸主动脉，主动脉暴露，在主动脉和脊柱之间插入细无菌镊子。张开镊子，逐渐将主动脉从床上提起，将胸段与主动脉的其余部分分开。
现在主动脉已经分离，用锋利的剪刀将其从小鼠的末端开始剪掉，末端靠近肾血管，结束于心脏附近。将切除的胸主动脉放入装有冷无菌 PBS 的培养皿中。现在主动脉已被移除，可以使用两个无菌镊子并在双筒望远镜下工作来准备主动脉环。
清洁胸主动脉周围的脂肪组织。确保不要损坏主动脉，只握住主动脉的边缘。主动脉应反复浸入含有 PBS 的培养皿中，以防止脱水，直到最终清洁。
现在胸主动脉已经干净了，使用手术刀片并在双筒望远镜下工作，将主动脉均匀地切成一毫米的环。使用放置在切割表面下方的尺子作为指导，确保使用新刀片并不时更换以保持锋利度。不使用主动脉的末端 切开每个环后，用镊子非常轻柔地将其转移到含有冷 PBS 的新培养皿中。
将所有环放入同一个含 PBS 的板中，以确保测定是随机的。由于主动脉的每一段都有不同的血管生成潜力，因此请将环保持在冰上。接下来，使用预冷移液器吸头准备检测板。
向 48 孔板中的每个孔中加入一滴 150 μL 冷 BME，液滴在运动中凝固成圆顶。BME 允许物质运输、细胞趋化性，最重要的是，细胞分化和迁移导致新血管形成 周边孔充满 PBS 为避免 BME 脱水，让 BME 液滴在 37 摄氏度下凝固 20 至 30 分钟。一旦 BME 凝固，用镊子小心地从培养皿中取出主动脉环以防止损坏，应将环转移到镊子尖端之间形成的脂质液滴内由于液体表面张力，在每个圆顶的顶部中心放置一个主动脉环，并在每个环顶部以 37 摄氏度孵育 10 分钟， 再加入 150 μL BME 并孵育 20 至 30 分钟。
在 37 摄氏度时，环现在被包裹在 BME 和测定中。可以将材料添加到板中以开始测定。Pres 补充剂先前制备的人内皮无血清培养基，其中含有实验材料或内皮细胞生长补充剂作为阴性对照的阳性对照。
单独使用培养基。向每个孔中加入 500 μL pres 补充剂培养基，并在 37 摄氏度下孵育 6 至 12 天。在此孵育期间，在显微镜下检查板，寻找从主动脉发芽的血管以及由进一步分支血管识别的高级成熟血管。
应在标准相差立体镜下第 6 天和第 12 天之间从环组织向内延伸，对环进行三维照片拍摄。此外，在第 6 天到第 12 天之间的不同日子收集上清液，并在 4 度下储存以备在一天内使用，或 Eloqua 并在零下 20 度或零下 80 度下储存以备将来使用。上清液可以通过各种技术进行分析，例如用于 vgf 的 Eliza 或用于一氧化氮水平的油脂测定。
这些图像是在将环放入孔中并与培养物孵育 12 天后收集的，培养基见图像顶行或用作血管发芽阳性对照的心电图。在底部面板中。每张图像是 12 个环中 4 个环的代表性快照，通常用于每种条件的测定。
每个单独孔中每个主动脉环的角都是黑色的。以这种方式拍摄时，暴露在心电图下的主动脉环表现出血管生长，箭头指向已形成的众多血管中的几条。每个血管的特征是内皮细胞链，偶尔有分支表明它们已经成熟。
在培养物中未观察到发芽的容器。上图中的中等孔，我们刚刚向您展示了在执行此程序时如何进行主动脉酸胆检测。重要的是要记住准确工作并了解他们的条件。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概览
本文介绍了一种主动脉环试验，旨在通过在受控环境中让小鼠主动脉芽生血管来研究血管生成。该试验使得可以直接添加血管生成化合物来评估其对新生血管生长的影响，持续数天。
关键研究组成部分
科学领域
- 血管生成
- 血管生物学
- 实验性试验
背景
- 血管生成对生理和病理过程都至关重要。
- 主动脉环试验提供了研究血管形成的模型。
- 理解血管生成可以带来对各种疾病的洞察。
- 该试验允许在3D基质中测试不同的化合物。
研究目的
- 开发一个用于研究血管生成的灵活系统。
- 评估血管生成促进剂和抑制剂的效果。
- 观察体外主动脉环中的血管芽生。
所用方法
- 从小鼠中解剖胸主动脉。
- 准备主动脉环并放置在3D基质中。
- 用实验试剂孵化主动脉环。
- 在6-12天内观察新生血管的生长。
主要结果
- 从主动脉环中成功芽生血管。
- 评估各种化合物的血管生成潜力。
- 展示了该试验对不同实验条件的灵活性。
- 对血管生成机制的洞察。
结论
- 主动脉环试验是研究血管生成的宝贵工具。
- 它允许在受控环境中直接测试血管生成因子。
- 研究结果可以对了解血管发育和相关疾病做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
The aortic ring assay provides a physiologically relevant organotypic model for evaluating angiogenic and anti-angiogenic compounds in early discovery. By enabling direct compound testing in a 3D matrix with quantifiable neovessel outgrowth, it supports mechanistic de-risking of vascular targets and pathway validation. This assay bridges in vitro endothelial screens and in vivo models, improving predictive confidence in lead identification for cardiovascular, oncology, and ischemic disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing compound effects on sprouting from intact aortic tissue.
- Operational Value: Enables functional validation of angiogenic targets using a native vascular explant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with measurable effects on vessel formation in a disease-relevant context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for dose-response screening of angiogenic modulators.
- Operational Value: Standardizes readouts through phase-contrast imaging and supernatant collection for biomarker analysis.
- Scalability Value: Supports 6-replicate testing per condition to address biological variability and ensure assay robustness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through use of murine aorta, reflecting in vivo-like angiogenic responses.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of neovessel outgrowth.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by identifying compounds with consistent pro- or anti-angiogenic activity across replicates.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a functional readout that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking compound treatment to phenotypic changes in vessel sprouting and maturation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized BME embedding and randomized ring placement to minimize positional bias.
- Analytics: Generates quantitative outputs via image analysis of sprout length/branching and ELISA-based measurement of angiogenic factors in supernatants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling angiogenic responses in a tissue-contextual system.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening diverse compound libraries across therapeutic areas involving vascular pathology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by observing direct effects on neovessel formation from native tissue.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized ring preparation, BME doming, and replicate testing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic validation of vascular activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on angiogenic efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and tissue handling under sterile conditions.
- Dependent on consistent BME quality and proper gelation at 37°C for dome formation.
- Necessitates standardized imaging protocols and blinded analysis to minimize observer variability.
- Involves optimization of compound dosing and incubation times based on solubility and stability in aqueous medium.
- Limited by biological variability between aortic segments, necessitating replicate testing for statistical confidence.
