从土壤和沉积物中提取高分子量基因组DNA

您好，我是来自不列颠哥伦比亚大学微生物学与免疫学系Stephen Harlem实验室的San Lee。今天我们将向您展示一种从森林土壤中提取高分子量基因组DNA的实验方法，该方法同样适用于多种类型的土壤和沉积物。我们利用提取的高分子量基因组DNA构建森林土壤微生物群落的宏基因组文库。

有了这些文库，我们便可以研究在不同土壤层次中分布的微生物群落的多样性和代谢潜力。那么，让我们开始吧。本实验方案首先进行细胞裂解。

第一步是通过加入β-巯基乙醇至终浓度为0.5%，完成变性缓冲液的配制。为获得最佳效果，建议每次使用前新鲜配制变性溶液；或者使用不超过一周、且在4°C条件下保存的缓冲液。下一步需要液氮容器、高压灭菌器，以及预冷的研钵、研杵和刮勺。

将两克冷冻土壤样品放入预冷的研钵中。加入一毫升变性溶液，然后加入液氮，完全覆盖土壤。

使用预冷的研钵研磨样品，直至土壤颗粒呈粉末状且均匀，样品开始融化。然后加入更多液氮，并重复研磨步骤。使用预冷的刮勺完成细胞裂解步骤。

将研磨后的样品转移至50毫升离心管中。将样品置于冰上，立即进行DNA提取步骤，或在-80摄氏度下保存。在开始DNA提取前，为配制提取缓冲液，需加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和SDS。

检查CTAB是否结晶，如果已结晶，需在60摄氏度下溶解后再进行后续操作。然后将其加入溶液中，使终浓度为1%。接着加入20% SDS溶液，使终浓度为2%。形成的乳白色悬浮液是正常现象。

加入 SDS 后，将配制好的提取缓冲液在 60 摄氏度下保存 10 至 15 分钟，以保持其均匀状态。待提取缓冲液充分溶解并混合均匀后，向土壤样品中加入 9 毫升提取缓冲液，低速涡旋振荡短暂混合。将样品与提取缓冲液在 65 摄氏度的杂交炉中孵育 40 分钟。

孵育期间，每隔10分钟轻轻倒置离心管，或以转子最低转速持续旋转离心管。孵育过程中，溶液可能在孵育后略显黏稠。下一步是使用氯仿-异戊醇从裂解混合物的有机物质中纯化DNA。

首先在生物安全柜中，将样品在约10至14摄氏度下以1800 G离心10分钟，然后用移液枪头沿离心管管壁小心滑动，收集含有DNA的上清液，注意避开顶部的米色层和底部的有机相层。将上清液转移至预冷的50毫升离心管中，该离心管内已加入20毫升氯仿-异戊醇（chloroform ISL alcohol）或IAA。接下来，对同一样品重复提取过程再进行两次。同时，将DNA提取物和氯仿-IAA在生物安全柜中的冰上放置保存。

进行第二次DNA提取时，返回含有土壤沉淀物和残留提取缓冲液的离心管，再加入5毫升提取缓冲液。用1毫升枪头轻轻搅拌混匀，并短暂涡旋振荡，使沉淀重新悬浮，操作同前。此次在65摄氏度孵育10分钟。

然后在4°C下以1800 ×g离心10分钟。在通风橱中，将上清液转移至含有氯仿、异戊醇或氯仿-异戊醇混合液以及前次提取所得上清液的离心管中。重复整个提取过程一次，以从土壤样品中尽可能提取更多的DNA。

当您对土壤样品完成总共三次提取后，将装有收集的上清液和氯仿的试管轻轻放在旋转平台上，以1.25 RRP m转速缓慢振荡10分钟。此混合步骤完成后，将试管在10至14摄氏度条件下以1800 G离心20分钟。离心后，小心地将水相转移至新的超速离心管中，保留1至2毫升上清液（SNAT），以避免扰动水相与有机相之间的界面。接下来，为沉淀DNA，加入0.6毫升异丙醇。

每毫升收集的上清液中，轻轻倒置离心管数次以混匀。此时，您可能已能观察到DNA沉淀形成细长的丝状物。随后，将DNA与异丙醇在室温下孵育30分钟。

孵育结束后，通过离心收集DNA。将离心管放入离心机时，标记其中一个管角，以便后续确定DNA沉淀的位置。在20至25°C下，以16,000 ×g离心20分钟。离心完成后，通过倾倒或真空抽吸去除异丙醇。注意避免丢失DNA沉淀，其大小因提取效率和土壤样品中的生物量而异，可能从几乎不可见到直径9毫米不等。将DNA沉淀在室温下干燥5至20分钟。注意不要过度干燥，待沉淀干燥后即可。

将DNA重悬于200至400微升的TE中，轻轻弹动混匀。将DNA溶液转移至1.5毫升离心管中。

将 DNA 在 4 摄氏度下保存过夜。为了使 DNA 完全溶解，在从土壤样品中提取 DNA 后，后续检测样品浓度和 DNA 完整性的步骤均为标准操作流程，这些步骤在 Hallam 实验室的另一份 JoVE 方案中有详细描述。使用您选择的方法测定 DNA 浓度。

还可通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测高分子量DNA的完整性，取10至20微升DNA样品进行电泳分析。根据后续应用的不同，DNA的中位大小应达到36千碱基对或更大。随后可直接进行后续的氯化铯梯度离心步骤，或者在超速离心前将DNA样品于-20摄氏度或-80摄氏度保存。

下一步是使用氯化铯梯度离心法进一步纯化 DNA，去除杂质。在完成氯化铯梯度离心和浓缩步骤后，使用 AmCon 和 MicroCon 离心过滤装置对 DNA 进行进一步纯化。氯化铯梯度离心是获得高质量 DNA 的关键步骤，其详细操作已在 Hallam 实验室的另一项 JoVE 方案中有详细描述。完成氯化铯梯度离心和浓缩步骤后，采用您选择的方法检测 DNA 浓度。

接下来，通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）再次检测高分子量DNA的完整性，取少量DNA样品进行电泳分析。从两克强制土壤中分离得到的基因组DNA总量在10至180微克之间，如氯化铯超速离心前后电泳结果所示。所分离DNA的大小通常在40至60千碱基对之间，此处展示的是氯化铯超速离心前后基因组DNA样品的电泳图谱。

此步骤可提高DNA纯度，使260与280的比值从之前的1.3至1.6提升至之后的1.8至1.9。此外，在230纳米处的吸收峰（表明存在腐殖酸污染）在离心后显著降低。我们刚刚向您展示了如何从土壤微生物群落中分离高分子量的基因组DNA。

进行此操作时，重要的是要严格按照说明精确配制提取缓冲液和变性缓冲液。在异丙醇沉淀后，小心不要触及你的DNA沉淀物。当你通过氯化物梯度离心回收DNA条带时。

不要忘记用TE缓冲液冲洗注射器，以最大限度地回收DNA。最后，在所有建议的步骤中检测所提取DNA的浓度和质量。以上就是全部操作。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。