Name: 分离和造血干细胞移植（造血干细胞） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 38 s
Description: 学习纯化长期重建造血干细胞并将其移植到小鼠体内的完整实验流程。该方法涵盖无菌解剖、骨髓细胞分离及流式分选技术，为血液学研究提供可靠的技术方案。

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全骨髓制备
<ol>
<li>处死四只&nbsp;B6小鼠并解剖以获取胫骨、股骨、髋骨和脊柱。</li>
<li>解剖过程中，将四肢和骨骼保存在含2%FCS（热灭活）的PBS中（可选添加2 mM EDTA——作为解剖液）。</li>
<li>在解剖液中用研钵和研杵研碎干净的骨骼。一种高效的方法是：先研碎每只小鼠的胫骨、股骨和髋骨，然后每次处理两段脊柱。</li>
<li>将每只小鼠获得的细胞混合物分别收集，并通过40μm滤膜过滤至50 ml Falcon离心管中。这样，每管包含来自一只小鼠所有腿部骨骼的细胞混合物，以及来自两段脊柱的一半混合物。此步骤中，滤膜用于分离骨碎片。</li>
<li>通常建议将腿部骨骼研磨两次，以获得白色（无骨髓残留）的骨碎片，脊柱碎片则研磨2至3次。</li>
<li>加液至各管使其重量平衡，于1200 rpm离心5分钟。</li>
<li>吸除上清液，并通过在试管架上拖动试管来松散沉淀（此步骤在每次离心后均至关重要，可最大限度减少细胞团块形成和细胞损失）。若进行谱系耗竭，则每管用1 ml PBS 2% FCS（此后不再含EDTA）重悬；否则可根据需要使用其他合适体积进行重悬。</li>
</ol>
谱系耗竭
<ol>
<li>该步骤可去除高度分化的细胞，从而获得富含干细胞和祖细胞的异质性细胞群体。若需分选造血干细胞（HSC），此步骤可显著减少需进行细胞分选的细胞数量，从而缩短分选时间，并允许从更多小鼠中分选HSC，以便在单次分选中获得更高数量的HSC。</li>
<li>若后续需进行分选，请取出50μl细胞悬液（通常从每管中取少量）作为分选对照（未染色及Sca1、c-Kit、CD48、Flk2单色对照）。</li>
<li>每管加入30ml Lin抗体混合物。谱系抗体混合物包含多种抗体，但其组成在不同实验室间略有差异&nbsp;。在Scadden实验室中，我们使用针对Gr1、Ter119、CD4、CD8、CD3和B220的生物素化抗体，其在染色中的最终稀释比例为1:700。</li>
<li>快速涡旋混匀，于4°C孵育15分钟。</li>
<li>孵育期间，将磁柱安装至磁架上，并在磁柱下方放置15ml洗脱管。使用Steriflip滤器对部分PBS进行脱气处理（可见微小气泡因真空抽吸而向PBS表面移动），并通过向每根磁柱加入3ml脱气PBS以平衡磁柱。</li>
<li>磁柱流速约为1ml/5分钟，因此约需15分钟完成磁柱的平衡，使其达到可用状态。</li>
<li>孵育结束后，加入PBS 2% FCS补满各管，于1200rpm离心5分钟。</li>
<li>吸除上清液，轻柔吹打沉淀以重悬细胞，每管加入1ml脱气PBS重悬细胞。</li>
<li>若后续需进行分选，请取出总骨髓谱系单色染色对照（15ml，从每管中取少量）。</li>
<li>每管加入30ml链霉亲和素磁珠，快速涡旋混匀，于4°C孵育15分钟。</li>
<li>孵育结束后，每管加入2ml脱气PBS。在磁柱下方放置新的收集管，将每份细胞悬液通过40μm滤器加载至磁柱上。</li>
<li>每管再加入3ml脱气PBS进行洗涤。待磁柱排空后，使用同一40μm滤器再次加载洗液。</li>
<li>流出液即为去除非谱系细胞后的细胞混合物，为富含干细胞和祖细胞的异质性细胞群体。将4个收集管中的液体合并至2个管中，于1500rpm离心5分钟。</li>
<li>吸除上清液，沉淀应呈白色或主要为白色。轻柔吹打沉淀，若后续需进行分选，则共同重悬于1ml PBS 2% FCS中；否则可根据需要重悬于适当体积的缓冲液中。</li>
</ol>
LKS 或长期造血干细胞分选
<ol>
<li>取出经谱系耗竭处理的单色染色对照样本（15ml）。这将用于评估谱系耗竭的效率。</li>
<li>待分选的细胞混合物在15ml离心管中进行染色。</li>
</ol>
加入抗体：

<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>Sca PE-Cy5.5</td>
<td>1: 100</td>
<td>10ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Kit APC</td>
<td>1:100</td>
<td>10ml</td>
</tr>
<tr>
<td>SA PE-Cy7</td>
<td>1:500</td>
<td>2ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>

要分选长期造血干细胞（long term HSC）， также&nbsp;添加：

<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td class="jove_content">CD48 FITC</td>
<td class="jove_content">1:1000</td>
<td class="jove_content">1ml</td>
</tr>
<tr>
<td class="jove_content">Flk2 PE</td>
<td class="jove_content">1:200</td>
<td class="jove_content">5ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>

此外，使用解剖后保留的总骨髓以及经谱系染色的总骨髓制备单染对照。这些染色可直接在流式管中进行。
务必在避光条件下操作！
<ol>
<li>快速涡旋混匀，置于 4°C 孵育 20 至 30 分钟，期间中途重新混匀一次。</li>
<li>为去除多余的抗体，用 PBS 2% FCS 补充至管中，于 1500 rpm 离心 5 分钟。</li>
<li>弃去上清液，重悬所有沉淀，并转移至带滤帽的新 FACS 管中。细胞通过这些滤器可能需要较长时间，之后务必加入更多 PBS 冲洗滤器，以尽量减少细胞损失。此步骤对于防止分选仪堵塞至关重要，而堵塞是每位细胞分选使用者最担心的问题。</li>
<li>将细胞送至细胞分选平台时，务必同时准备一管含有 PBS 10% HI FCS 的收集管，用于接收分选后的细胞。</li>
<li>若分选 LKS 细胞，将获得包含长期与短期重建造血干细胞（HSC）及多能祖细胞的异质性细胞群体。从 4 只小鼠中平均可获得约 300,000 个 LKS 细胞。</li>
<li>若同时使用了 CD48 和 Flk2 抗体，则可进一步分离出长期 HSC、短期 HSC 和 MPP 各自的细胞群。其中 LT-HSC 为最稀有的细胞群体，从 4 只小鼠中平均可获得约 50,000 至 60,000 个细胞。</li>
</ol>

造血干细胞（hscs）的分离与移植

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

造血干细胞（HSCs）的分离与移植

我是Christina Ceso。我在David Den的实验室担任博士后，研究造血干细胞。今天我们将分离长期重建型造血干细胞，并将其移植到小鼠体内。我们首先用酒精喷洒小鼠，以确保操作开始时处于无菌状态，同时防止毛发干扰解剖过程。解剖时使用含2%血清的磷酸盐缓冲液（PBS）。我剪开背部皮肤，并将皮肤向两侧拉开，以暴露组织。为了分离胫骨，我用镊子夹住胫骨。剪断膝盖上方的肌腱，并剪除膝盖下方的肌肉，随后切断膝关节，使胫骨不再与肢体其余部分相连，然后将其拉出以完成分离。接着，我将胫骨倒置，用剪刀将足部与胫骨分离，以获取股骨。我剪断股骨周围的肌肉，然后将股骨从髋关节脱位。为了分离髋部，我剪断小鼠尾部一侧髋骨周围的肌肉，然后将髋部从身体上拉开。为了分离脊柱，我尽可能靠近背部起始处切断尾巴，然后在脊柱两侧及下方进行剪切，尽量贴近脊柱，以避免损伤腹膜并保持肠组织不受干扰。首先使用手术刀对骨骼进行初步清理，用手术刀刮除附着在骨骼上的肌肉组织。手术刀适用于清理股骨、髋骨和脊柱。为了清理胫骨，我用镊子夹住骨骼，并用镊子尽可能去除大部分组织。使用洁净的擦拭巾进行第二轮清理，彻底将骨骼从肌肉中清理干净，我使用F型擦拭巾清洁胫骨、股骨和髋骨。骨骼清理后的外观如图所示。清理完成后，我倾向于使用带滤膜的50 mL离心管，并将骨骼转移至研钵中。我加入部分培养基，并将第一轮研磨后的骨组织进行碾碎。我用移液器吹打混合物，以尽可能释放更多的骨细胞进入溶液并减少团块。随后，我将混合物通过滤器转移至离心管中，图中显示的是经过第一轮研磨后的骨碎片形态。因此，我向骨碎片中加入更多的解剖液，并再次快速冲洗。通过滤器将悬液转移至离心管中，此时残留的骨碎片呈白色，骨髓组织已完全去除。将各离心管用含2%血清的PBS填充，以确保所有管重量相等，从而在离心时保持平衡；同时也有助于洗涤滤器，尽可能回收更多细胞。随后离心细胞混合液，离心后沉淀中含有骨髓细胞。我吸出培养基，然后在架子上来回移动试管，使沉淀物松动，减少团块的形成。当我加入培养基时，此时每支试管加入 1 ml 培养基，并进行ics，因为我在分选造血干细胞。之后，我将在此时保存总骨髓细胞的ALI输出，用于后续的单色对照实验。加入谱系抗体混合液。将样本混匀后置于4°C孵育15分钟。在此期间，开始准备用于谱系分离的层析柱。将层析柱置于磁铁上，并在层析柱下方准备收集管。同时，我使用无菌翻转滤器制备脱气 PBS，并将其连接至真空泵，使滤器顶部排出所有气泡。随后，向每根层析柱中加入 3 ml 脱气 PBS，以确保层析柱充分润湿。加入抗体孵育后，向细胞样品中添加培养基，离心以去除多余的抗体。离心后，染色的细胞位于沉淀中。吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL的PBSI缓冲液中。加入淬灭用的明胶珠，混匀细胞后于4°C孵育15分钟。孵育结束后，我在柱子下方放置新的收集管。向每管细胞

isolation-and-transplantation-of-hematopoietic-stem-cells-hscs

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离和造血干细胞移植（造血干细胞）

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本方案的目的是从预处理的非人灵长类动物骨髓中分离CD34+细胞，利用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰，并制备可用于回输至自体宿主的产品。整个方案耗时约48小时。...

非人灵长类造血干细胞与祖细胞的制备及基因修饰

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

本方案通过强制表达转录因子GATA2、GFI1B和FOS，诱导人皮肤成纤维细胞启动造血程序，从而生成造血干细胞和祖细胞。...

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本方案通过使用丰富的脂肪酸、胆固醇、较低浓度的细胞因子以及低氧条件模拟骨髓微环境，实现在体外维持静息态人造血干细胞。...

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用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

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