用于组织工程与细胞培养的电纺纤维聚合物支架

本视频展示了静电纺丝聚合物技术，这是一种广泛用于组织工程和细胞培养的方法，可制备出模拟天然细胞外基质结构和尺寸尺度的纤维支架。在此，我们对一种具有光反应活性的透明质酸进行静电纺丝，该透明质酸可在光照条件下发生交联，并进一步介绍其他加工应用，例如光刻图案化，该过程可形成通道和支架结构以及多尺度孔隙，以增强细胞浸润和组织分布。此外，我们采用多聚合物支架成型技术，可在同一纤维膜中同时静电纺丝两种不同的聚合物，从而调控支架的力学性能和降解特性，并定制孔隙结构以促进细胞浸润。

大家好，我是来自宾夕法尼亚大学生物工程系Jason Burdick实验室的Jamie Kovi。大家好，我是同样来自Burdick实验室的Harini Swin。今天我们将向您展示一种用于组织工程的静电纺丝纤维支架制备方法。

我们还将介绍光刻图案化和多聚合物支架成型的附加加工能力。在实验室中，我们利用这些方法研究人源骨髓间充质细胞（HMSE）在透明质酸支架中的相互作用和浸润行为。此外，我们还结合多种其他聚合物采用这些技术，研究纤维增强组织，如半月板和心肌组织。

那么我们开始吧。用去离子水配制0.5%（质量分数）的光引发剂溶液，将Irgacure 2959或I 2959在37摄氏度下溶解数天。

如果电纺丝需要光敏性聚合物，则使用I 2 9 5 9。为制备电纺丝溶液，将以下成分在去离子水中混合至终浓度：2%（重量）甲基化透明质酸（MEHA）、3%（重量）聚环氧乙烷（PEO）和0.05%（重量）I 2 9 5 9，涡旋混匀5分钟，并在37°C下孵育过夜。待溶液完全溶解后，将其转移至注射器中，并在末端连接一根18号、6英寸长的钝头针头。

接下来，使用注射泵并设置为以每小时1.2毫升的速率推出液体。将注射泵的针头插入注射泵中。将高压电源的接地导线连接到收集装置上。

在此操作中，我们将使用以约10米/秒速度旋转的芯轴。为收集取向纤维，将正极导线连接至针头，并调整针头或收集装置，使两者之间保持15厘米的距离。启动注射泵，当观察到液体出现在针尖时，打开电源并将电压设定为22千伏。

将纤维收集到支架上，直至达到所需厚度。收集时间取决于所需的厚度以及所用的电纺溶液体积。对于光刻图案化，我们使用电纺16小时制备的纤维膜。

收集完成后，将支架从收集装置上取下，并在真空条件下储存过夜，以彻底去除溶剂。使用剪刀从支架膜上裁剪出5毫米×5毫米的样品。将每个支架置于覆盖有铝箔的载玻片上，以准备进行交联，并将光掩模直接放置在支架上方，再用干净的载玻片覆盖，并用长尾夹夹住两端固定。

使用氮气室对支架进行吹扫，以防止因接触氧气而导致交联反应被抑制。将支架装置置于氮气室内，用带准直适配器的365纳米波长光（约10毫瓦/平方厘米）照射5分钟。取出每根支架，放入12孔组织培养板中。

向每个孔中加入2毫升去离子水。轻轻拍打培养板，以防止水产生EVA畸变，并将培养板置于37摄氏度环境中24小时。每8小时更换一次水，在清洗间隔期间使用真空移液器从孔中吸去去离子水。

在加热板上配制5%（质量分数）的PEO溶于90%乙醇的溶液。在操作前，于50摄氏度下以700转/分钟的速度搅拌至少两小时。搅拌后，加入DPI，使其终浓度为10微克/毫升。

将PEO和DPI溶液转移至一支3毫升注射器中，并用铝箔包裹以避光。接着，制备第二节中所述的静电纺丝溶液，并加入甲氧基乙基生物碳摩尔棒domine B，使其终浓度为25 µM，用微量移液器加入3毫升注射器中，再用铝箔包裹以避光。

使用透明胶带小心地将 22 毫米 × 22 毫米的甲基化玻璃盖玻片边缘固定在芯轴表面，使盖玻片贴合芯轴的周长。取一段 5 毫米长的硅胶管，一端连接带有鲁尔锁扣的注射器之一，另一端连接针头，将注射器插入注射泵，并将针头穿过风扇上的孔。

扩口器用于调节心轴长度，以确保在最终支架中两种聚合物均匀分布。确保装有MEHA的注射器针尖位于心轴中心位置。将针尖定位在距离心轴15厘米处，并将扩口器设置在距针尖6厘米的位置。

将注射泵程序设置为每小时输送1.2毫升，并将电源设定为22千伏。以完全相同的方式安装含有PEO的注射器，但将针尖置于距芯轴10厘米处，并将电源设定为15千伏。随后，关闭灯光，启动芯轴和注射泵。

当两根针头尖端均可见液体时，取下注射器上的铝箔。收集完成后，同时打开电源并插上风扇。小心关闭电源和心轴，并拔掉风扇的插头。

使用剃刀去除盖玻片和胶带。可在配备有用于观察rumine和dpi荧光滤光片的荧光显微镜下观察纤维。将每个带有附着电纺聚合物的盖玻片放入六孔板的独立孔中。

将支架置于 2 毫升 PBS 中，在培养板中孵育过夜，以确保完全去除溶剂和污染物。24 小时后，用真空泵吸去 PBS，将支架置于超净台内的杀菌紫外灯下照射 30 分钟。为进行灭菌，按标准细胞培养操作制备所需细胞密度的浓缩细胞悬液。

例如，对于 22 × 22 毫米的盖玻片，使用 100 毫升细胞悬液。放入培养箱中孵育一小时。向每个样品中加入适量的细胞培养基。

将支架重新放回培养箱中。使用Invitrogen公司提供的市售活死细胞染色试剂盒对细胞进行染色，以便利用配备trissy和fitzy滤光片的荧光显微镜观察细胞和纤维。在接地的平板上收集的支架会产生随机分布的纤维，而在旋转芯轴上收集的支架则形成取向排列的纤维结构。

在支架的光交联过程中，使用扫描电子显微镜观察时可生成取向排列的纤维。我们将光掩模置于支架与光源之间，此时支架已浸入去离子水中且含有未反应的甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）。未被光照到的区域中的聚环氧乙烷（PEO）被去除，通过荧光染料可明显观察到大孔结构的形成。同时进行甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）和聚环氧乙烷（PEO）的静电纺丝，可得到一种复合支架，其中含有由各自聚合物组成的 distinct 纤维群体。

人肥大细胞（HMCs）似乎与纤维表现出良好的相互作用。它们不仅通过绿色染色可见其存活状态，而且似乎还定向排列，沿着红色纤维的方向整齐排列。我们刚刚向您展示了如何通过电纺丝技术制备用于组织工程的纤维支架。

我们还引入了其他功能，例如光刻图案化和多聚合物静电纺丝。在进行此操作时，重要的是要记住，在尝试任何进一步的实验之前，应优化每种聚合物的静电纺丝参数，以形成均匀的纤维。就这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。