Name: 分离纯化果蝇外周神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学习使用磁珠分选技术从果蝇幼虫中分离纯化外周神经元的方法。该技术结合酶解和机械解离步骤，可获得高纯度神经元群体，适用于RNA分析和基因表达谱研究等下游应用。

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感谢 Yuh-Nung Jan 博士和 Wes Grueber 博士提供本研究中使用的果蝇品系。作者感谢 Thomas F. 和 Kate Miller Jeffress 纪念信托基金对本研究的支持（D.N.C.），以及乔治梅森大学教务长办公室（E.P.R.I.）的支持。

磁珠分选的一般说明 果蝇 外周神经元（完成本方案所需的总时间：2.5–3 小时）
必须始终遵守标准的实验室操作规程，以维持清洁且无RNA酶的环境，防止RNA降解。
当解剖 Drosophila 幼虫表皮并将其置于细胞解离缓冲液中时，外周神经元是最后从表皮上脱落的细胞之一。我们利用这一特性设计了本实验方案，旨在分离多树突神经元之前，先去除表皮上大多数非特异性细胞（如肌肉和脂肪细胞）。
经过练习，整个实验方案可在约2.5小时内成功完成。抗体包被磁珠的制备必须在实验开始前完成。
1. 准备磁珠以结合细胞：
此步骤必须在实验开始前完成。制备好的珠子可保存在4°C，直至需要时使用。
<ol>
 <li>用 PBS 清洗 100 μl Dynabeads M-280 Streptavidin 包被的磁珠三次：每次加入 500 μl 新鲜 PBS 重悬磁珠，并在强磁场中沉淀磁珠。</li>
 <li>最后将磁珠直接重悬于 100 μl 未稀释的生物素化大鼠抗小鼠 CD8a 抗体中（抗体浓度为 100 μg/ml）。</li>
 <li>将混合物置于冰上孵育 1 小时，期间偶尔轻轻涡旋以防止沉淀。[1 μl Dynabeads M-280 可结合 0.05–0.10 μg 生物素化抗体]。</li>
 <li>按步骤 1.1 所述方法清洗磁珠-抗体复合物三次，以去除未结合的抗体。此时磁珠已包被抗体，可直接使用。将磁珠-抗体复合物储存于 100 μl 1× PBS 中，4°C 保存至使用前。</li>
</ol>
2. 选择与清洗幼虫：（10-15 分钟）
 <ol>
 <li>选取30-50只年龄相匹配的三龄幼虫，放入含有1-1.2 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的1.6 ml微量离心管中。（3-5分钟）</li>
 <li>盖紧管盖，以最大转速涡旋震荡三次，每次1秒。</li>
 <li>使用火焰抛光的巴斯德移液管彻底弃去上清液。重复洗涤（2.1）和涡旋（2.2）步骤3-4次，直至上清液中无可见的食物颗粒和残渣。</li>
 <li>用1 ml 70%乙醇短暂洗涤一次，弃去上清液。</li>
 <li>用1 ml去离子水（ddH2O）洗涤幼虫两次，每次均弃去上清液。</li>
 <li>用1 ml RNase-AWAY再次短暂洗涤一次，弃去上清液。</li>
 <li>用1 ml去离子水（ddH2O）洗涤幼虫三次，以确保完全去除RNase-AWAY。</li>
</ol>
3. 解剖：（10-12 分钟）
<ol>
 <li>将10-12条幼虫放置在涂有Sylgard的35 mm培养皿中央，使它们彼此略微分开。[关键步骤：丢弃任何看起来未处于适当发育阶段的幼虫]</li>
 <li>使用一对精细解剖剪刀剪开所有幼虫的前端。</li>
 <li>使用一对钝头Dumont 5号镊子将幼虫内外翻转。将一把镊子插入幼虫表皮内，一直伸至后端。夹紧镊子尖端以夹住表皮的后端（图1a）（可尝试将表皮压在Sylgard表面以使其更易操作）。用第二把镊子将幼虫表皮向内推，使其完全翻转。[关键步骤：在进行细胞分离实验前，建议先练习此方法数次。应尽量使幼虫完全翻转，以确保所有软组织均暴露于溶液中，便于后续解离。]</li>
 <li>解剖完3-4条幼虫后，立即将其转移至装有新鲜冰上预冷PBS的1.6 ml微量离心管中（将管子置于冰上）。</li>
 <li>重复步骤3.1至3.4，直至收集到所需数量的幼虫（本方案中为30-40条）。[关键步骤：预计在解剖和解离过程中会有10-20%的损失，请据此合理规划幼虫数量。]</li>
 </ol>
4. 去除松散附着的非特异性细胞：（2-3 分钟）
 [此步骤有助于清除松散附着的非特异性组织，如脂肪体和中枢神经系统组织。]
<ol>
<li>取含有倒置幼虫表皮的1.6 ml微量离心管，弃去上清液，加入约700–800 μl新鲜的预冷PBS。</li>
<li>以最大速度脉冲式涡旋振荡微量离心管5次（每次3秒）。</li>
<li>弃去上清液，加入约700–800 μl新鲜的预冷PBS。</li>
<li>重复步骤4.2和4.3共三次。</li>
<li>将幼虫表皮重悬于400 μl新鲜的预冷PBS中。</li>
</ol>
5. 将组织解离为单细胞悬液：（18–20 分钟）
[关键步骤：过度解离可能导致细胞表面标志物丢失，从而造成细胞得率低和细胞活力差。幼虫组织可通过机械解离（超声、研磨）、酶解解离（胰蛋白酶、胶原酶等）或两者结合的方式进行解离。由于这些幼虫组织较难解离，我们发现联合使用机械和酶解方法效果最佳。]
<ol>
 <li>向悬浮于 400 μl PBS 中的幼虫表皮中加入 1.5 μl 的 1X Liberase Blendzyme 3（28 Wünsch 单位/瓶）。</li>
 <li>在最大转速下涡旋振荡溶液 2–3 次，每次 1 秒（此操作应使松散附着在表皮上的细胞进入溶液中）。</li>
 <li>在室温（22–25°C）下孵育溶液 5 分钟。[关键步骤：孵育时间显著影响最终的细胞分选效率。推荐的孵育时间应足以使组织松散。切勿超过 15 分钟。]</li>
 <li>以最大转速对离心管进行脉冲式涡旋振荡，每次持续 2 秒，共 20–30 次。此操作应使肌肉及其他组织释放到溶液中。在每一步操作后，用荧光体视显微镜检查溶液中的少量样本。（随着经验积累，应能通过直接在荧光体视显微镜下观察微量离心管来判断解离程度）</li>
 <li>用新鲜的冰预冷 PBS 清洗幼虫表皮 2–3 次，最后将其重悬于 500 μl 含 1% BSA 的新鲜冰预冷 PBS 中。</li>
 <li>为防止幼虫表皮粘附于 2 ml Kontes 组织研磨器的玻璃表面及大间隙研杵上，先用含 1% BSA 的 PBS 溶液对组织研磨器和研杵进行预包被，短暂冲洗后弃去 BSA 溶液。随后，使用火焰抛光的巴斯德移液管，将第 5.5 步中的表皮转移至经 BSA 包被的组织研磨器中。[关键步骤：将组织研磨器/研杵置于冰上数分钟进行预冷却，以防止细胞损伤或裂解。]</li>
 <li>以缓慢而稳定的手法进行 Dounce 匀浆，避免产生泡沫（约 20–30 次）。[关键步骤：必须缓慢且稳定地进行 Dounce 匀浆，否则可能导致细胞裂解。]</li>
 <li>为评估细胞解离程度，用洁净的 Kimwipe 纸巾擦拭组织研磨器外壁，并在荧光体视显微镜下观察。神经元应已从表皮上脱离，并可在溶液中观察到。若此操作困难，可另取少量溶液用移液器吸出，在荧光体视显微镜下观察。细胞充分解离的良好标志是幼虫表皮上无神经元残留。然而，若仍观察到神经元附着于表皮，或存在未完全解离的细胞团块，应继续进行 Dounce 匀浆，直至获得单细胞悬液。</li>
 <li>先用火焰抛光且尖端直径缩小至标准尖端约 50% 的巴斯德移液管将溶液吹打 5 次，再用尖端直径缩小至约 25% 的火焰抛光巴斯德移液管吹打 10 次。[关键步骤：剧烈吹打可能损伤细胞。应在各步骤之间监测细胞状态，并相应调整操作。]</li>
 <li>将溶液通过 30 μm 细胞滤器过滤，并将滤过的细胞收集至 1.6 ml 微量离心管中。所得溶液应为单细胞悬液，现已可用于磁性细胞分选。</li>
</ol>
6. 磁珠细胞分选：（45 - 75 分钟，取决于抗体孵育时间）
<ol>
<li>向500 μl细胞悬液（步骤5.10）中加入15 μl抗体包被的磁珠。剩余的偶联抗体磁珠可保存至后续细胞分离时使用。</li>
<li>将细胞与抗体包被的磁珠在冰上孵育30–60分钟，期间偶尔手动混匀。[关键步骤： 在较高温度或更长时间下孵育可能导致抗体非特异性结合。]</li>
<li>将微量离心管置于强磁场中2分钟。所有被正向选择的细胞及未结合的磁珠将移至管壁一侧。</li>
<li>缓慢用移液器吸出上清液，注意不要扰动管壁上的细胞沉淀。</li>
<li>用新鲜的预冷PBS洗涤细胞3–4次，以去除任何残留的非特异性细胞。</li>
<li>将细胞重悬于30 μl新鲜的预冷PBS中。</li>
<li>为估算细胞纯度和得率，取5 μl细胞悬液滴加至血细胞计数板的抛光表面，在荧光体视显微镜下计数所有可见的荧光细胞。同时检查非荧光细胞的数量及任何杂质迹象。通常样本中荧光细胞的比例会非常高。</li>
</ol>
7. 从磁珠分选细胞中分离RNA：（60 – 75分钟）
<ol>
 <li>计数后，将细胞置于磁场中离心形成沉淀，弃去上清液，并加入20 μl PicoPure™ RNA分离试剂盒（Molecular Devices）中的提取缓冲液。根据细胞数量，可能需要加入更大体积的提取缓冲液。</li>
 <li>以最大速度涡旋振荡管子，使细胞沉淀与提取缓冲液充分混匀。</li>
 <li>将管子在42°C孵育30分钟。</li>
 <li>为确保在RNA柱纯化前去除磁珠（参见步骤7.5），将管子短暂离心（2,000 ×g，2分钟），使磁珠沉淀。然后将管子置于强磁场中以固定沉淀，将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
 <li>按照PicoPure RNA提取试剂盒制造商的说明进行RNA提取和柱纯化。DNA酶处理为可选步骤，可根据分析需求在RNA纯化过程中直接在柱上进行。最后，用少量洗脱缓冲液（11–30 μl）洗脱结合的总RNA，并于-80°C保存直至使用。如需评估总RNA质量，可取1 μl样品在Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies, Inc.）上进行检测。</li>
</ol>
代表性结果：
采用磁珠分选法分离 Drosophila 多极化感觉神经元（da神经元）（图1）。从这些分离的da神经元中提取的RNA（图2a）质量优良，经安捷伦2100生物分析仪（Agilent Technologies, Inc.）检测，可见清晰的5.8S、18S和28S核糖体RNA峰（图2b）。以30-40只三龄幼虫为起始材料，使用ppk-GAL4驱动子平均可分离得到300-500个IV类da神经元，而使用泛da神经元特异性驱动子GAL421-7则可分离得到1500-2000个da神经元（包括I、II、III和IV类）。为评估所分离细胞的神经元特异性富集程度，我们采用定量反转录PCR（qRT-PCR）检测了两个神经元特异性基因标记物（elav和futsch）的表达。分析结果显示，与流程通过组（flow through）相比，这两个标记基因均呈现显著的倍数富集，表明按照本实验方案可实现da神经元的高度特异性富集（图3）。最后，利用从泛da神经元和IV类da神经元中分离得到的RNA，在安捷伦Drosophila melanogaster全基因组寡核苷酸微阵列（4 x 44K）上进行了转录表达谱分析（图4）。该分析不仅鉴定出多个先前已被证实参与da神经元树突形态发生的调控因子，还发现了一系列此前未被表征的分子及潜在的信号转导通路，这些分子可能在da神经元发育过程中发挥重要的功能作用。目前，针对这些尚未明确功能的分子在da神经元发育、特别是树突形态发生中潜在作用的研究正在进行中。
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" alt="DNA提取过程示意图，展示细胞内容物分离的逐步方法及结果。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图1： Drosophila da神经元的磁珠分选示意图。 (a) 取携带da神经元特异性GAL4,UAS-mCD8-GFP报告转基因且年龄匹配的三龄幼虫，将其幼虫表皮内外翻转后解剖，以暴露外周神经系统（PNS）并置于解离缓冲液中，随后保存在冰上预冷的PBS中。 (b) 通过向含有幼虫表皮的溶液中加入Liberase Blendzyme 3进行酶解消化。 (c) 进一步通过涡旋振荡、吹打和Dounce匀浆相结合的方式对幼虫组织进行解离，以去除非特异性标记的组织，如脂肪体、肠道和中枢神经系统（CNS）。 (d,e) 使用30 μm细胞滤网对细胞进行过滤。所得溶液包含上皮细胞、肌肉细胞和神经元等多种细胞类型的单细胞悬液。 (f) 向细胞悬液中加入包被有抗小鼠CD8a抗体的Dynabeads M-280磁珠，并在冰上孵育30–60分钟。 (g) 磁珠与表达小鼠CD8标签GFP融合蛋白的da神经元结合。 (h,i) 将溶液置于强磁场中，分离带有磁珠的细胞。弃去上清液，并对细胞洗涤三次，以去除任何残留的非特异性细胞，最终获得(j) 高度纯化的da神经元群体。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" alt="衍射图样与XRD图谱示意图，显示材料表征中的峰分析结果。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图2: (a) 通过细胞解离和磁珠分选获得的GFP荧光标记的IV类da神经元阳性筛选代表性图像。结果显示，所获得的神经元群体中IV类da神经元高度富集，几乎不含或仅有极少的污染细胞杂质。(b) 使用安捷伦2100生物分析仪（Agilent Technologies, Inc.）对磁珠分选后的da神经元提取的总RNA进行电泳分析，图中显示了高质量的总RNA，表现为5.8S、18S和28S rRNA条带清晰可见。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">点击此处</a>查看图2的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" alt="神经元标志物倍数富集的柱状图，Elav 与 Futsch 比较，数据分析。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图 3：对分离的 da 神经元（GAL421-7,UAS-mCD8-GFP）及流穿组分中神经元标志物基因表达进行 qRT–PCR 分析，实验重复三次。通过 qRT–PCR 检测两种神经元特异性标志基因（elav 和 futsch）的表达水平。分析所得数据以内源性对照（rp49）归一化，并采用 ΔΔCτ 法6计算相对于流穿组分的相对表达水平。与流穿组分相比，分离的 da 神经元群体中 elav 和 futsch 均显著富集。
<img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" alt="绿色矩阵码图案、数字数据流、密码学分析、数据可视化图示。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图4： 典型的IV类da神经元特异性Cy3标记的微阵列图像文件。图中显示的是安捷伦（Agilent）黑腹果蝇全基因组寡核苷酸微阵列（4 x 44K），该阵列与通过磁珠分选纯化的IV类da神经元中提取的Cy3标记总RNA进行杂交。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">点击此处</a>查看图4的放大版本。

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

本方案经过优化，可用于分离和纯化紧密附着于黑腹果蝇三龄幼虫表皮内表面的外周神经元，采用磁珠细胞分选策略。尽管我们已使用该方案特异性分离黑腹果蝇的da神经元，但通过调整若干参数并使用标记特定细胞类型的特异性GAL4,UAS-mCD8-GFP报告转基因品系，该方案也可适用于分离在幼虫或蛹期发育阶段中附着于表皮的其他细胞类型（例如上皮细胞、肌肉细胞、其他外周神经元）。此外，该方案可应用于功能缺失和功能获得的研究策略中，将目标基因克隆至UAS-mCD8-GFP转基因载体，并与GAL4转基因品系组合，从而在特定细胞类型中实现基因特异性的功能缺失（例如UAS-RNAi）或功能获得。例如，在研究转录因子时，可借助该方法鉴定在特定细胞类型中发生功能缺失或功能获得表达后可能上调或下调的靶基因。通过本方案从纯化的目标细胞类型中提取总RNA，并利用该RNA进行微阵列表达谱分析，即可鉴定出差异表达的基因，这些基因可能作为转录调控的下游靶点，在介导细胞内表型变化过程中发挥重要作用。
为了成功进行细胞分选，必须仔细关注上述方案中强调的关...

<table><tbody><tr><td>10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td>稀释至1X工作液</td></tr><tr><td>10X Liberase Blendzyme 3</td><td>罗氏集团</td><td>11814176001</td><td>稀释至1X工作液（28 W&amp;#252;nsch 单位/瓶</td></tr><tr><td>RNase-AWAY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的大鼠抗小鼠 CD8a 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0815</td><td>100 &amp;#x03BC;g/ml 储存液浓度</td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白），第五组分</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11018-017</td><td>在 PBS 中配制 1% BSA 溶液</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td>1 &amp;#x03BC;l 可结合 0.05–0.10 &amp;#x03BC;生物素化抗体的克数</td></tr><tr><td>PicoPure RNA 提取试剂盒</td><td>Molecular Devices</td><td>KIT0204</td><td>遵循制造商说明&amp;rsquo;s 指令</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title&quot;&gt;仪器设备&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;李&gt;(10) 钕铁硼磁铁块（K &amp;amp; J Magnetics, Inc.，货号 #B444B），或 alternatively DynaMag&amp;#8482;-2（Invitrogen，货号 #123-21D）可使用。 &lt;/li&gt; &lt;李&gt;Kontes 玻璃组织研磨器，2 ml 工作容量，配大间隙研杵（货号 #885300-0002）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;细胞滤器，例如 MACS 预分离滤器（Miltenyi Biotec，货号 #130-041-407）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;35 mm Sylgard 包被的培养皿（Dow Corning Corporation，货号 #3097358-1004）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;解剖工具：两把Dumont 5号镊子（Fine Science Tools，货号 #11251-20）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;Vannas弹簧显微解剖剪（Fine Science Tools，货号 #15000-08）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;移液器（P-1000、P-100、P-10）及一次性吸头&lt;/li&gt; &lt;李&gt;使用标准血细胞计数板对细胞进行计数并评估纯度&lt;/li&gt; &lt;李&gt;巴斯德移液管，尖端经火焰抛光，分别为标准直径、标准直径缩小至约50%以及标准直径缩小至约25%，用于吹打重悬细胞&lt;/li&gt; &lt;李&gt;台式微型离心机（1–16,000 × g）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;涡旋混合&lt;/li&gt; &lt;李&gt;荧光体视显微镜（本方案中使用的是 Leica MZ16FA）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

分离与纯化 果蝇 通过磁珠分选分离外周神经元

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

TheDrosophila周围神经系统（PNS）是研究神经元发育和树突形态发生复杂过程在功能和分子水平上的有力模型。为了辅助这些分析，我们开发了一种分离PNS神经元亚类的策略，这类神经元被称为树突分支（da）神经元，已被广泛用于研究树突形态发生1,2这些神经元极难分离为纯细胞群体，部分原因在于其数量极为稀少，且位于坚韧的几丁质幼虫表皮下方，难以触及。我们新开发的方法克服了这些挑战，基于使用抗体包被的磁珠进行快速且特异性的细胞富集。在磁珠分选研究中，我们采用了表达小鼠CD8标记的GFP融合蛋白的同龄三龄幼虫，UAS-mCD8-GFP)3在 IV 类树突状分支（da）神经元特异性调控下pickpocket (ppk)-GAL4driver4或用于控制 pan-da 神经元特异性 GAL421-7driver5. 尽管本实验方案已针对分离附着于幼虫角质层内壁的外周神经系统细胞进行了优化，但通过调整若干参数，该方案也可用于分离在幼虫或蛹期发育阶段附着于角质层的多种不同类型细胞（例如上皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等），或根据GAL4特异性驱动表达模式，从幼虫器官中分离其他类型的细胞。采用此方法提取的RNA质量较高，可直接用于后续基因组学分析，例如微阵列基因表达谱研究。该方法为开展分离细胞的相关研究提供了一种强大的新工具Drosophila树突分支（da）神经元，从而为树突形态发生的分子机制提供了新的见解。

在本视频文章中，我们介绍了一种利用快速磁珠辅助细胞分选策略分离和纯化Drosophila外周神经元的方法。从分离细胞中获得的RNA可直接用于包括微阵列分析在内的下游应用。

果蝇外周神经系统（PNS）是研究神经元发育和树突复杂过程的有力模型……

使用携带神经元特异性 CD8-GFP 融合报告基因的黑腹果蝇幼虫来分离多巴胺能神经元。通过将幼虫表皮外翻的方式进行解剖，以暴露外周神经系统。将外翻后的幼虫进行酶解消化，随后通过涡旋震荡、吹打和沉降进行机械性解离。随后通过过滤细胞获得单细胞悬液，其中主要含有上皮细胞、肌肉细胞和神经元。将抗体包被的磁珠加入细胞悬液中，磁珠会结合表达CD8标记的GFP融合蛋白的神经元。最后，将溶液置于强磁场中，分离出被磁珠包被的神经元，从而获得高度纯化的神经元群体。大家好，我是来自乔治梅森大学克拉索高级研究所分子与微生物学系的 Dan Cox。大家好，我是 Dan Cox 博士实验室的 Ish AER。今天我们将向您展示一种通过磁珠分选法分离和纯化 DLO 外周神经元的操作流程。我们在实验室中采用此方法研究调控特定类别及右侧形态发生的分子机制。现在开始操作。首先，选取30至50只年龄匹配的三龄幼虫，放入含有1至1.2毫升1×PBS的1.6毫升微量离心管中。关闭管盖，以最大转速涡旋振荡三次，每次一秒钟。使用火焰抛光过的移液管，彻底弃去上清液。加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），重复洗涤和涡旋步骤三次，直至上清液中明显无任何食物颗粒和碎片为止。用一毫升70%乙醇简短重复洗涤一次。然后用一毫升双蒸水洗涤幼虫两次。最后，用一毫升RNase Away溶液再洗涤一次，并用一毫升双蒸水洗涤三次，以彻底去除RNA酶。幼虫现在已准备好进行解剖。将10至12条幼虫放置在涂有硅胶的35毫米培养皿中央。使它们彼此略微分开，并弃去发育阶段不合适的幼虫。接着，使用一对精细解剖剪，在钝头杜蒙镊的辅助下剪开幼虫的前端。第五步，使用镊子。将幼虫翻转成内向外的状态。首先将一把镊子插入幼虫表皮内，一直伸到后端。用镊子尖夹住角质层后端将其捏住。将角质层压在硅胶板表面有助于固定。用第二把镊子将幼虫角质层翻转内侧朝外。确保幼虫完全翻转，使所有软组织均暴露于溶液中，以利于细胞的充分解离。在进行细胞解离前，先练习数次该操作。解剖完三至四只幼虫后，立即将其转移至预冷的微量离心管中的冰上 PBS 溶液中。重复操作直至收集到所需的30至40只幼虫，然后进行非特异性细胞的去除。请注意，由于所有幼虫均已解剖，预计在解剖和结合过程中会有10%至20%的损失。清除松散附着的非特异性组织，如脂肪体和中枢神经系统细胞。用 700 至 800 微升新鲜的预冷 PBS 替换含有倒置幼虫表皮的离心管中的溶液。最后，短暂涡旋振荡，以最高速度每次脉冲 3 秒，共进行 5 次。然后弃去上清液，并加入约 700 至 800 微升新鲜的预冷 PBS。重复此步骤三次，最后将幼虫表皮重悬于 400 微升新鲜的预冷 PBS 中。在分离细胞以获取树突状突起（da）幼虫神经元之前，先使用冷PBS。采用酶解和机械解离相结合的方法。注意避免过度解离，以免导致细胞表面标志物丢失，从而引起细胞得率低和细胞活力下降。向悬浮于 400 µL PBS 中的幼虫表皮加入 1.5 µL 1× liase zyme three（每瓶 28 个单位），开始解离。将溶液在最大转速下涡旋振荡 2 至 3 次，每次 1 秒，以使松散附着在表皮上的细胞进入溶液。然后在室温下孵育溶液5分钟。由于孵育时间对最终的细胞分选效率影响较大，因此在孵育脉冲结束时不得超过15分钟。将离心管涡旋振荡20至30次，每次全速脉冲2秒。此操作应使肌肉及其他非特异性组织释放到溶液中。定期在荧光立体显微镜下检查样本，以确定周围神经是否仍附着于角质层。通过荧光体视显微镜直接观察微量溶液样品，以评估解离程度。在解离过程的每一步均需重复此操作，在外周神经元开始从表皮解离进入溶液前停止涡旋震荡。用预冷的新鲜 PBS 缓冲液分两到三次、每次一毫升对幼虫表皮进行短暂洗涤。最后，重悬。将细胞重悬于500微升含有1% BSA的新鲜预冷PBS中，以继续进行细胞的机械解离。预先使用2毫升 Kontes 组织研磨器以及大间隙研杵，并用含1% BSA的PBS溶液润洗。短暂冲洗后，弃去BSA溶液。这可以防止幼虫表皮粘附在玻璃表面。随后将组织研磨器和研杵置于冰上数分钟，进行预冷，以防止细胞损伤或裂解。然后使用火焰抛光的移液管将表皮转移至组织研磨器中。现在用缓慢而稳定的动作向下研磨组织，避免产生泡沫，大约进行20到30次。务必缓慢而稳定地研磨，否则细胞可能会破裂。为评估细胞解离程度，用干净的Kimwipe纸巾擦拭组织研磨器的管壁，并在荧光体视显微镜下观察。神经元应已从表皮脱离，并可见于溶液中。细胞解离良好的标志是幼虫表皮上无神经元残留。然而，如果仍观察到神经元附着在角质层上，或在完全解离的细胞中观察到细胞团块，需进一步继续解离，直至细胞达到单细胞悬液状态。使用火焰抛光过的移液管进行机械解离，将移液管尖端直径缩小至标准管尖直径的约50%，先缓慢吹打溶液5次，随后再吹打10次。将尖端直径缩小至标准直径的大约25%。注意用力过猛可能会损伤细胞。在各步骤之间监测细胞状态，并相应调整操作步骤。最后，将溶液通过30微米的细胞滤器过滤，并将滤过的细胞收集至1.6毫升微量离心管中。所得溶液应为单细胞悬液，现已可进行磁珠分选。磁珠表面包被有抗CD8抗体。按照随附的书面实验方案进行制备，多巴胺能神经元表达一种由抗体靶向的CD8-GFP融合蛋白。开始细胞分选时，向500微升细胞悬液中加入15微升抗体包被的磁珠。将细胞与抗体包被的磁珠在冰上孵育30至60分钟，期间偶尔用手轻轻混匀；在较高温度或更长时间下孵育可能导致抗体非特异性结合。接下来，将微型大管置于强磁场中两分钟。所有被正向筛选的细胞以及未结合的磁珠将黏附在管壁一侧，缓慢吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，用预冷的新鲜PBS洗涤细胞三到四次。此步骤可去除任何残留的非特异性结合细胞。最后，将细胞重悬于30 µL预冷的新鲜PBS中，以评估细胞的纯度和得率。取5 µL细胞悬液滴加到血细胞计数板的抛光表面，在荧光体视显微镜下计数所有可见的荧光细胞。同时检查非荧光细胞的数量以及是否存在任何杂质迹象。通常，样品中荧光标记的细胞将得到高度富集。最后，使用pico pure RNA提取试剂盒从结合在磁珠上的细胞中分离RNA。将提取缓冲液加入分选后的细胞中，但在进行柱纯化步骤之前，需先用磁铁去除磁珠。取1 µL提取的RNA，在Agilent Bioanalyzer 2100上检测总RNA的质量。从分离的DA神经元中纯化的RNA质量极佳，这通过Agilent 2100 Bioanalyzer分析时出现清晰的5.8S和28S核糖体RNA峰得以证实。从第30至第43小时的三龄幼虫开始，使用PPK-Gal4驱动子可平均分离出300至500个四类DA神经元，而使用泛神经元特异性Gal4驱动子则可分离出1500至2000个包括一类、二类、三类和四类的DA神经元。利用泛神经元特异性Gal4驱动子进行定量RT-PCR检测神经元特异性标志物L11 fch，结果显示二者均显著富集，表明本研究所示方案相较于流穿对照能高度特异性地富集DA神经元。最后，从泛神经元及四类DA神经元中分离的RNA被用于在Agilent黑腹果蝇全基因组寡核苷酸微阵列上进行转录表达谱分析，鉴定出许多参与DA神经元形态发生的因子。我们已向您展示了如何通过磁珠分选法从三龄幼虫发育阶段分离并纯化黑腹果蝇的外周神经元。进行此操作时，关键在于平衡酶解与机械解离步骤。过度的酶解可能导致CD8细胞表面抗原表位降解，从而引起细胞分选效率降低或失败。在整个操作过程中，还必须保持无RNA酶的环境，以确保所分离神经元中纯化RNA的完整性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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分离纯化果蝇</em磁性微球的排序>外周神经元

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激光捕获显微切割 果蝇 外周神经元

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通过磁激活细胞分选法从新鲜灌注的成年小鼠脑组织中分离下丘脑小胶质细胞

学习使用磁珠分选技术从果蝇幼虫中分离纯化外周神经元的方法。该技术结合酶解和机械解离步骤，可获得高纯度神经元群体，适用于RNA分析和基因表达谱研究等下游应用。

分离与纯化果蝇通过磁珠分选分离外周神经元

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