Name: 一种新型的RFP的记者，以帮助在眼成虫光盘的可视化果蝇 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 了解利用新型RFP报告基因在果蝇眼成虫盘中可视化特定细胞类型的方法。该技术有助于识别和标记发育中的眼部细胞，为神经科学和发育生物学研究提供重要工具。

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本工作由伦敦国王学院和英国皇家学会资助。

<ol>
 <li>首先，在解剖显微镜下，将一滴 PBS 滴加至 Sylgard 培养皿中。</li>
 <li>接着用解剖铲从试剂瓶或瓶子中取出数条游走期三龄幼虫，并将其放入 PBS 中。</li>
 <li>开始解剖时，若为右手操作者，请用左手镊子夹住幼虫身体后三分之二处，再用另一把镊子夹住前端深色的口钩。</li>
 <li>现在将两把镊子缓慢向相反方向拉动，使幼虫身体分离。口器部分应连同眼/脑复合体一起从身体其余部分分离出来。</li>
 <li>若需对眼原基进行免疫荧光染色，此时应将组织置于冰上，在 4% 多聚甲醛/PBS 溶液中固定 30–45 分钟。随后用 PBST 洗涤四次，并用适当的抗体进行染色。</li>
 <li>最简便的方法是直接在载玻片上进行眼原基的解剖。在载玻片上滴加一滴 PBS，用镊子夹住口器部分，将眼原基转移至 PBS 液滴中。</li>
 <li>由于成虫盘组织呈半透明状，初时难以辨认眼原基。为便于识别，可使用具备荧光功能的解剖显微镜。利用眼-RFP 报告基因品系，可在球形视叶上方清晰观察到呈红色荧光的眼原基组织（图 1）。</li>
 <li>若使用光纤冷光源，应将光线以倾斜角度照射至载玻片，以增强原基的对比度。眼/触角原基在后端通过视柄与视叶相连，在前端则通过触角原基发出的 stalk 与口器相连。</li>
 <li>解剖眼原基时，用一把镊子夹住口器部分，另一把镊子将眼原基从幼虫脑组织中分离。随后将眼原基与口器部分分开。最后将口器部分从载玻片上移除，以免其阻碍盖玻片平整贴合。</li>
 <li>完成所有眼原基的解剖后，轻轻倾斜载玻片，吸去多余的 PBS。然后滴加一滴 Vectashield 封片剂，并轻柔地盖上盖玻片。</li>
 <li>此时样品已准备好，可使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像（图 2）。</li>
</ol>
代表性结果
正确解剖后，眼/触角成虫盘应平展地贴附在载玻片上，无任何脑组织等多余组织。眼成虫盘的背侧和腹侧极部呈弯曲状，容易发生折叠，但可通过共聚焦显微镜采集Z轴系列图像，并在投影时剔除这些区域来避免。尽管成虫盘为单层上皮结构，但由于细胞核位置存在差异，仍需通过Z轴系列投影以获得成虫盘的整体图像。图2展示了在共聚焦显微镜下拍摄的一个典型眼-RFP标记眼/触角成虫盘的投影图像。我们通常使用20倍或40倍物镜，以1 μm的层厚对成虫盘进行逐层扫描。眼-RFP报告基因定位于细胞核，因此图2中所示的模式代表了表达RFP的细胞的细胞核分布情况。
<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="嗅觉叶的荧光显微图像；红色荧光突出显示神经组织。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 来自眼-RFP三龄黑腹果蝇幼虫的眼/脑复合体的初步解剖。 可见被轮廓标出的眼/触角成虫盘附着在口器（MP）上，并覆盖在脑的视叶（OL）上方。该图像使用荧光解剖显微镜拍摄，以显示眼成虫盘中的RFP表达。前方朝左。比例尺：300 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="果蝇眼原基盘的荧光显微图像；鬼笔环肽标记肌动蛋白（绿色），RFP标记蛋白质（红色）" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 眼-RFP报告基因在眼原基盘中的表达。 从眼-RFP幼虫中解剖获得的三龄幼虫眼原基盘（ED）/触角原基盘（AD），显示RFP表达（红色）。该原基盘经鬼笔环肽染色（绿色），标记顶面细胞表面，可见形态发生沟（箭头所示）。RFP在形态发生沟周围的前体细胞、光感受器细胞1、6、7以及晶状体细胞中表达。前方朝左。比例尺：25 μm。

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

黑腹果蝇（Drosophila）眼成虫盘的解剖操作较为简单，但需要一定时间掌握。关键步骤在于识别眼成虫盘，并将其从幼虫脑组织上完整分离。使用本文所述的eye-RFP品系可更方便地识别眼成虫盘。可能的实验改进包括去除触角成虫盘或周边上皮膜，或保留视叶与眼成虫盘相连，以便观察光感受器神经元轴突进入脑部的结构。
眼特异性RFP品系是通过从pointed P2基因的第二内含子中克隆一段新颖的眼特异性增强子元件2，将其插入pRed H-Stinger增强子-报告载体3，并利用该载体构建转基因果蝇而获得的。该眼特异性RFP报告基因在特定的一类光感受器细胞（PRs）以及晶状细胞中表达（图2）。因此，该品系可用于检测目的基因是否在这些细胞类型中表达。眼特异性RFP品系可根据请求获取。
发育中的黑腹果蝇（Drosophila）眼睛是研究控制光感受器神经发生基因和分子通路的有力模型1。本文所述的方法和报告系统可用于进一步加深...

一种新型rfp报告系统有助于可视化果蝇复眼原基盘 果蝇

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

TheDrosophila眼睛是研究神经发生、信号转导和神经退行性病变等领域的一个强大模型系统。利用该系统所取得的许多发现，都得益于发育过程中眼成虫盘中感光细胞分化所具有的时空特性。要使用该系统，研究人员首先需要学会识别并解剖眼成虫盘。本文描述了一种新型的RFP报告基因，可用于辅助识别眼成虫盘以及可视化发育眼中特定的细胞类型。我们详细阐述了从三龄幼虫中解剖眼成虫盘的方法，并说明了eye-RFP报告基因如何辅助这一解剖过程。该eye-RFP报告基因仅在眼部表达，可通过荧光显微镜在活体组织或固定后的样本中直接观察，无需信号放大。我们还展示了该报告基因可用于识别眼成虫盘内的特定细胞类型。本实验方案及eye-RFP报告基因的使用将有助于研究人员利用该Drosophila眼睛用于解决具有根本重要性的生物学问题。

我们描述了一种新型的红色荧光蛋白（RFP）报告基因，该报告基因特异性地在黑腹果蝇（Drosophila）眼部表达。本文详细介绍了眼成虫盘的解剖方法，以及如何利用该报告基因辅助解剖并鉴定发育过程中眼部的特定细胞类型。

一种新型RFP报告系统有助于可视化果蝇复眼原基盘 果蝇

果蝇眼睛是研究神经发生、信号转导和神经退行性病变等领域的强大模型系统。许多相关发现……

新型转基因IRFP报告基因果蝇品系可在I型成虫盘的特定细胞中表达红色荧光蛋白（RFP）。该转基因品系有助于鉴定、解剖和标记发育过程中眼睛中的特定细胞类型。为解剖眼成虫盘，需使用解剖铲从培养瓶壁上取出三龄游走期幼虫。然后将幼虫放入载玻片凹槽培养皿中的一滴 PBS 内。使用镊子将带有眼原基的口器部分从幼虫其余部分上分离，再将眼原基转移至载玻片上，从中分离出口器部分和脑组织。大家好，我是来自伦敦国王学院沃尔夫森衰老相关疾病中心 Joseph Bateman 实验室的 Amna Cole。今天我们将向您展示一种从黑腹果蝇中分离成虫盘眼组织的实验方法。我们实验室利用该方法研究参与神经发生的基因。现在让我们开始吧。开始解剖眼成虫盘时，将一滴 PBS 滴加到涂有 Syl Guard 的培养皿中。在解剖显微镜下，Syl Guard 涂层有助于保护镊子在解剖过程中不被损坏。接着，使用刮铲取一条游走期三龄幼虫，并将其放入 PBS 液滴中。双手各持一把镊子，用其中一把镊子夹住幼虫身体后端约三分之二处。然后用另一把镊子夹住幼虫前端深色的口器部分。用镊子轻轻将幼虫从中间分开，使镊子相互远离。口器部分应连同附着的眼脑复合体一起与身体其余部分分离。接着，在载玻片上滴加一滴PBS，用镊子夹住口器部分，将组织转移到PBS液滴中。现在切换至解剖显微镜的荧光模式，由于只有眼成虫盘表达RFP，因此可被清晰识别为覆盖在球形视叶上的红色荧光组织，以增强成虫盘的对比度。将光纤冷光源以倾斜角度照射至载玻片。眼成虫盘在后部通过视柄与视叶相连，而在前部则通过来自触角成虫盘的柄状结构与口器部分相连。解剖眼成虫盘时，用一对镊子夹住组织，用另一对镊子将眼成虫盘从幼虫脑部分离。下一步，将眼成虫盘与口器部分分离。一旦口器部分与眼成虫盘分离，即从载玻片上移除。此时，眼成虫盘应平铺在载玻片上，并且应清除包括脑组织在内的所有多余组织。继续解剖其余的成虫盘。当所有眼成虫盘解剖完毕后，轻轻倾斜载玻片，并用一小块纸巾吸去多余的PBS。现在加入一滴封片剂，然后轻轻将盖玻片覆盖在上面。样品盘即可用于落射荧光显微镜或共聚焦显微镜成像。如果成像将在稍后进行，请将载玻片置于4°C条件下保存。RFP 将保持可见至少一年。在成像 Z 系列图像时，应使用 20 倍或 40 倍物镜，在共聚焦显微镜或 Zeiss aome 显微镜上以 1 µm 间距采集图像，然后可利用显微镜软件生成投影图像。对表达 IRFP 的果蝇的成虫盘进行解剖并用 Phin 染色，随后在 zes aome 显微镜上使用 20 倍物镜以 1 µm 间距进行成像。眼盘中表达 RFP 的细胞以红色显示。通过foid染色可观察到形态发生沟，呈绿色。眼盘的背腹极呈弯曲状，并倾向于折叠。这些区域可以从最终的投影图像中省略。尽管眼盘为单层上皮组织，但由于细胞核位置存在差异，需要通过Z系列投影才能获得眼盘的整体图像。由于IRFP报告基因定位于细胞核，此处观察到的模式代表了RFP在细胞核中的表达。我们刚刚向您展示了如何从小鼠果蝇中解剖阴道眼盘的实验操作步骤。使用此操作步骤时，最好使用一对精细的镊子，同时建议避免饮用咖啡。感谢您的观看，祝您所有实验顺利成功。

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一种新型的RFP的记者，以帮助在眼成虫光盘的可视化果蝇</em

本文介绍了一种利用活体显微分析结合GFP标记的胶质细胞，研究胶质细胞迁移进入发育中黑腹果蝇（Drosophila）眼部的实验方案。...

活体成像观察果蝇复眼原基盘中胶质细胞的迁移

本文介绍了一种用于制备成年Drosophila（果蝇）眼睛以进行半薄切片和光学显微镜分析的标准方法。该方案可用于眼缺陷的宏观形态学分析，或通过文中所述的相应调整，用于确定特定眼细胞类型中基因的遗传需求（例如光感受器细胞的克隆分析），也可用于电镜分析。...

成年个体的制备 黑腹果蝇 用于薄切片与显微分析的眼组织

来源： Hellerman, M. B., 等 活体成像 果蝇 蛹期复眼 视频实验杂志 (2015)该视频展示了一种用于研究黑腹果蝇（Drosophila...

活体成像的 果蝇 使用荧光显微镜观察蛹眼

番茄/GFP-FLP/FRT 方法涉及在活体中可视化嵌合感光细胞...

用于活体成像镶嵌成年果蝇的番茄/GFP-FLP/FRT 方法 黑腹果蝇 感光细胞

黑腹果蝇Drosophila melanogaster幼虫盘的解剖与免疫染色

本方案介绍了一种高效成像活体样本的方法 果蝇...

活体成像 果蝇 蛹期复眼

该技术的目的是使研究人员能够对任意年龄的黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila 蛹眼成虫盘的解剖与制片

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

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长期活体成像 果蝇 眼盘

配体暴露的时间可能影响其发育后果。本文展示了如何对果蝇（Drosophila）翅盘细胞释放一种名为Dpp的骨形态发生蛋白（BMP）的过程进行成像。...

成像 Dpp 的释放过程 果蝇 翅盘

本文介绍了一种高效且节省试剂的成虫盘解剖与抗体染色方案，便于对少量成虫盘进行操作和处理。...

果蝇（Drosophila melanogaster）眼部-触角及翅成虫盘的小规模解剖与抗体染色

了解利用新型RFP报告基因在果蝇眼成虫盘中可视化特定细胞类型的方法。该技术有助于识别和标记发育中的眼部细胞，为神经科学和发育生物学研究提供重要工具。

一种新型RFP报告系统有助于可视化果蝇复眼原基盘果蝇

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