Name: 电子显微镜对胚胎的制备果蝇胚胎心管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习透射电子显微镜技术制备果蝇胚胎样本，用于观察心管腔和基底膜的超微结构。该方法可清晰显示细胞膜、细胞连接等细节，为心脏形态发生研究提供可靠的实验方案。

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我们关于心脏管形成的研究工作得到了美国国家科学基金会资助（奖项编号 0744165）的支持，授予 S.G.K.。

<ol>
<li>在20 ml玻璃闪烁瓶中，新鲜配制2 ml固定液，其中含12.5%戊二醛的50 mM卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）。加入8 ml正庚烷并剧烈振荡，静置使两相分层。移除上层含饱和戊二醛的正庚烷相，转移至洁净的闪烁瓶中备用，此即为固定液。</li>
<li>使用胚胎收集室（一种带有可拆卸网状插件的小篮子）收集0–20小时的胚胎。将胚胎浸入50%次氯酸钠溶液中2–3分钟以去除外层绒毛膜，直至胚胎浮至溶液表面。用ddH₂O充分冲洗，并用纸巾吸干胚胎。</li>
<li>用镊子夹取覆盖有去膜胚胎的网状插件，将其放入固定液中，使胚胎从网中脱落。在4°C条件下，于旋转混合仪（Nutator）上固定胚胎1.5小时。</li>
<li>准备一个底部贴有双面胶带的培养皿。用巴斯德移液管将胚胎从固定液中取出，并转移至培养皿的胶带表面。转移时保留极少量固定液，以防止固定液中的正庚烷溶解胶带粘合剂。轻摇培养皿使胚胎形成单层。将培养皿置于通风橱中，直至正庚烷完全挥发。加入足量含0.1% Tween20的PBS覆盖胚胎。在解剖显微镜下，用钝头钨针手动去除16期晚期胚胎的卵黄膜。用巴斯德移液管回收胚胎至1.5 ml微量离心管中。第5–7步均在此微量离心管中进行。</li>
<li>用0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）冲洗胚胎，然后在含1%四氧化锇的0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）中室温后固定1小时。再用0.1 M卡考基酸盐缓冲液（pH 7.4）冲洗胚胎。</li>
<li>采用梯度乙醇和丙酮对胚胎进行脱水处理：先用50%乙醇脱水10分钟，再用70%乙醇脱水10分钟；随后用90%丙酮脱水10分钟，再用100%丙酮脱水两次，每次10分钟。</li>
<li>去除丙酮后，开始渗透处理：向胚胎中加入1:1的Epon-Spurr树脂与丙酮混合液。使用Pelco Biowave Pro微波仪在真空条件下处理3分钟。微波处理结束后继续施加真空压力5分钟。将1:1树脂-丙酮混合液更换为100% Epon-Spurr树脂，并再次在真空条件下进行微波处理。最后更换一次100% Epon-Spurr树脂，再次在真空条件下微波处理。</li>
<li>用巴斯德移液管将胚胎从微量离心管转移至硅胶包埋模具中。将胚胎排列成一行，使胚胎后端与模具的锥形边缘对齐。在70°C烘箱中过夜烘烤。</li>
<li>取出样品，准备切片。</li>
<li>使用金刚石组织切片刀（Diamond Histo Knife）和Richert Ultracut E切片机开始切取1 μm厚的切片。注意记录首次切到胚胎切面的位置。从此位置起，继续向样品内部切进100 μm。用环状工具取下一小片切片，置于载玻片上。在加热板上短暂加热切片。滴加一滴亚甲蓝对切片染色。在光学显微镜下识别心脏管腔。</li>
<li>使用金刚石超薄切片刀（45°角）和Richert Ultracut E切片机切取90 nm厚的超薄切片。将多层切片捞取至铜网上。</li>
<li>将铜网在含3%醋酸铀酰的50%乙醇饱和溶液中染色10分钟，随后用双蒸水冲洗三次。然后将铜网置于含有NaOH颗粒的染色室中，在无CO2环境下用铅柠檬酸染色液（0.04 g溶于10 ml双蒸水和100 ml 10 M NaOH）染色2.5分钟。染色后再次用双蒸水冲洗三次。</li>
<li>使用JEOL 1200EX透射电子显微镜在80 kV条件下观察切片，并用AMT数字相机拍摄图像。</li>
</ol>

<ol><li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , (2000).</li>
<li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun%2FE-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li>
</ol>

Drosophila 胚胎心脏管的形态发生已成为研究胚胎发育过程中细胞黏附和细胞形态变化的一个重要模型系统。研究这一结构面临的一个挑战是，在整体胚胎标本中难以观察心脏管的管腔。本视频展示的技术改编自先前描述的方法1-2，已被证明能够高效且可靠地分析大量基因型在心脏管及管腔形成中的表型3。

用于胚胎电子显微镜观察的样本制备 黑腹果蝇 胚胎心脏管

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

形态发生Drosophila胚胎心脏管已成为研究胚胎发育过程中细胞迁移、细胞间黏附以及细胞形态变化的一个重要模型系统。研究这一结构面临的一个挑战是，由于心脏管及其管腔相对于整个胚胎而言尺寸较小，因此在整体标本中难以观察到心脏管的管腔以及对心脏管形成至关重要的膜结构特征。透射电子显微镜的使用可实现对这些结构的更高倍数观察，并可通过横切面分析胚胎，从而清晰地揭示管腔的大小和形状。在本视频中，我们将详细介绍晚期胚胎进行可靠固定、包埋和切片的操作流程Drosophila为了观察心管管腔以及细胞间连接和基底膜等重要的细胞结构，对胚胎进行处理。

我们描述了一种用于晚期Drosophila胚胎的固定、包埋、切片及成像方法，以进行胚胎心脏管的透射电子显微镜观察。该技术可实现对心脏管腔以及衬于管腔内壁的基底膜的可视化观察。

果蝇胚胎心脏管的形态发生已成为研究细胞迁移、细胞间黏附和细胞……的一个重要模型系统

本视频介绍了如何对果蝇胚胎软骨进行透射电子显微镜（TEM）观察。心脏已成为研究细胞迁移、细胞间黏附以及细胞形态变化的宝贵模型系统。该技术可实现对心脏管腔形态的可视化观察，同时还能观察细胞膜、细胞间连接和基底膜等超微结构组分。开始此操作前，需配制适用于果蝇胚胎透射电子显微镜观察的固定液。随后，将0至20小时收集的带膜胚胎放入固定液中。固定完成后，将胚胎从固定液中取出，并在附着于双面胶带的同时进行修块处理。在含有缓冲液的培养皿中，去离子的胚胎漂浮于缓冲液内，并用移液器回收。随后胚胎进行后固定，并经历脱水梯度处理。一旦被树脂浸透，便将其转移至包埋模具中进行排列。用金刚石刀切割所得组织块。将切片捞取至铜网上，染色后进行观察。大家好，我是来自新泽西州罗伯特·伍德·约翰逊医学院医学与牙医学院病理科和实验室医学系 Sunita Kramer 实验室的 Nadine Lop。我是Raj Patel，来自PON病理学部门的电子显微镜师。今天我们将向您展示一种用于透射电子显微镜观察的斑马鱼胚胎制备与成像方法。我们在实验室中采用此方法研究果蝇心脏形态发生。那么，让我们开始吧。开始。在处理果蝇胚胎之前，需新鲜配制用于胚胎固定的庚烷透化法固定液。在通风橱中，用移液器将2毫升新配制的含12.5%戊二醛的Cate缓冲液加入玻璃闪烁瓶中，再加入8毫升ADA庚烷，剧烈振荡混匀。然后等待一分钟，使两相分离。上层相含有被戊二醛饱和的 ADA 庚烷，即固定液。用移液器将上层相转移至一个洁净的小瓶中，并放置一旁备用。为收集 0 至 20 小时的胚胎，使用一个胚胎收集室，该装置是一个带有可拆卸网状插入件的小篮子。首先，取下含有胚胎的葡萄汁培养板，并移除所有死亡的果蝇。然后，使用水和画笔将胚胎从葡萄汁培养板上轻轻刷下，并用装有水的方瓶将胚胎转移至胚胎收集室中。用蒸馏水冲洗胚胎，去除葡萄汁平板上残留的过量酵母。将胚胎浸入50%的漂白剂溶液中2至3分钟，或直至胚胎浮至液面，以去除外层的卵壳膜。用蒸馏水彻底冲洗，并将胚胎转移至纸巾上。用镊子夹取筛网插入物，此时其表面应已附着包被的胚胎。将插入物放入固定液中，使胚胎从筛网上脱落。在4°C条件下，于旋转摇床上孵育胚胎一个半小时进行固定。孵育结束后，将胚胎转移至铺有双面胶的培养皿中，尽量减少固定液的带入。轻轻晃动培养皿，使胚胎分散成单层，随后放入化学通风橱中，让庚烷自然挥发。待胚胎完全干燥后，用含有0.1%吐温的缓冲液覆盖胚胎。在解剖显微镜下，使用钝头钨针处理16期晚期胚胎。已固定好的胚胎会漂浮起来，可用巴斯德移液管回收，并转移至1.5毫升微量离心管中。用0.1摩尔的磷酸缓冲液冲洗胚胎，然后在室温下用1%四氧化锇后固定1小时。孵育结束后，用Cate缓冲液冲洗胚胎。再次使用梯度浓度的乙醇和丙酮对胚胎进行脱水。先用50%乙醇处理10分钟，接着用70%乙醇处理10分钟，然后用90%丙酮脱水10分钟，最后分步转入100%丙酮，每步10分钟。去除丙酮。通过加入一份喷雾树脂与一份丙酮的混合液，开始渗透过程。确保样品处于真空压力下，并微波处理三分钟。在额外保持真空压力五分钟。将树脂-丙酮混合液更换为100%树脂，并在真空条件下再次进行微波处理。更换树脂并在加压条件下进行微波处理。最后一次，共进行三次渗透步骤。将胚胎从微量离心管转移至硅胶包埋模具中。将胚胎排列成一行，使胚胎的后端与模具的锥形边缘对齐。将培根置于70摄氏度烘箱中过夜。然后取出所得组织块进行切片。使用切片机将胚胎切成一微米厚的切片。当切片至组织块并已暴露到胚胎时，使用接种环将单个切片转移至载玻片上，以在观察前判断是否已达到观察心脏的合适深度。将切片短暂置于加热板上加热，然后进行亚甲蓝染色：先在载玻片上滴加一滴染液，再短暂加热。再次用去离子水冲洗，并在显微镜下以所需的切片深度观察切片。为满足空间限制，应能在光学显微镜下辨认出心腔结构。重新修块，使横切面中最多包含五个显示胚胎心脏的胚胎。使用切片机切割90纳米厚的切片。将多个切片捞取至铜网上。用3%乙酸铅染色10分钟，然后用蒸馏水冲洗三次。现在将载网置于含有氢氧化钠颗粒的染色 chamber 中，用柠檬酸铅染色两分半钟，以创造无二氧化碳的环境。染色结束后，用蒸馏水冲洗三次。在80千伏电压下使用电子显微镜观察切片，并用CCD相机拍照记录。为了确定切片深度和发育阶段是否操作得当，应能明显观察到背侧中线两侧的心原基之间已形成成熟的心腔。为判断细胞膜是否完整，需检查心腔内是否存在细胞外基质，并观察 Christie 结构和线粒体的存在情况。以上我们已向您展示了如何分析果蝇胚胎心脏的超微结构。进行该操作时。务必记住要正确地对果蝇胚胎进行分期，并准确测量树脂的各组分且充分混匀。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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电子显微镜对胚胎的制备果蝇胚胎心管

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