通过双光子荧光恢复漂白后测量扩散系数

多光子荧光。光漂白后恢复过程可通过荧光染料分子的自由扩散样品轻松演示。首先，将一束低强度激光射入样品，以激发激光聚焦体积内D分子产生参考水平的荧光。

接下来，通过短暂的高强度激光闪光，使焦点体积内部分染料分子发生光漂白。最后，将激光衰减至先前的低强度水平，并监测荧光信号：随着被光漂白的分子从焦点区域向外扩散，外部仍具荧光的分子会进入该区域予以替换。通过分析所得的荧光强度随时间变化的曲线，可计算出扩散系数。

大家好，我是来自罗切斯特大学生物医学工程系Edward Brown实验室的Kelly Sullivan。今天我们将向您展示如何进行多光子荧光漂白后恢复实验。在我们的实验室中，利用该技术研究体外和体内生物系统中的扩散过程。

那么，让我们开始吧。首先，设置所需的激光波长，并在光电倍增管（PMT）前方插入适当的滤光片。接下来，为了避免对 pcal 细胞造成损伤，将激光功率调节至 200 毫瓦或更低。

在 pcal 细胞上游有一个呈“四”字形排列的两面反射镜。这两面反射镜足以将激光束精确对准并通过 pcal 细胞。将 pcal 细胞偏压控制器的电压偏移设为零，调节激光通过 pcal 细胞的光路，使激光在前后窗口均居中。

使用图四中的上游反射镜将光束在前窗口居中，使用图四中的下游反射镜将光束在后窗口居中。现在将 pcal 电池晶体两端的电压设置为最大值。合适的电压值取决于波长，可在 pcal 电池使用手册中找到。

调节位于 pcal 电池上游的图四中的反射镜，直到 pcal 电池的输出功率达到最大。现在将晶体两端的电压切换为零，并调节偏置控制器上的电压偏移，以使 pcal 电池的输出功率最小化。将入射到 pcal 电池上的激光功率恢复至实验所需数值。

现在转移到显微镜下，对标准化的荧光样品进行良好的视觉聚焦。此处我们使用固定的荧光花粉颗粒。聚焦完成后，封闭显微镜，通过调节 pcal 电池晶体两端的电压，将激光功率调整至适合样品成像的适当水平。

最后，关闭光源并打开光电倍增管（PMT）。对标准化样品开始重复扫描成像，并调节 pcal 池下游的反射镜，直至获得样品的清晰图像。现在我们来看如何确定在样品内聚焦时的安全监测功率。

在本视频中，我们将使用载玻片凹槽内盛装的水溶性染料样品，并用盖玻片封片。将激光衰减至较低但足以在样品中产生荧光的合理功率。封闭显微镜，将光电倍增管（PMT）的输出信号引导至光子计数器。

关闭光源，打开光电倍增管（PMT），并在显微镜软件中开始点扫描。将光子计数器的积分时间设置为远长于预期荧光恢复时间的时间尺度，并记录足够数量的数据点。增加激光功率，再采集另一组光子计数数据。

继续增加功率，直到光子计数的增幅明显减小。根据功率增加曲线，以光子计数的对数对功率的对数作图，若斜率偏离2，则表明发生漂白。

监测过程中，选择低于此截止值的合理监测功率。接下来确定多通道定标器和脉冲发生器的输入参数。在脉冲发生器上。

在标量器上，将预激发时间设置为预期半数恢复时间的1至2倍，将漂白时间设置为预期半数恢复时间的十分之一。将时间箱宽度设置为漂白持续时间的大约一半，并设置每记录的箱数，使得所选时间箱宽度与每记录箱数的乘积大于预期的完全恢复时间。加上预漂白和漂白时间后返回脉冲发生器，并将预漂白和漂白序列的频率设置为略小于时间箱宽度与每记录箱数乘积的倒数的值。

最后，根据在选定的监测功率下测得的信号强度，在定标器上设置每次扫描的记录数。然后将监测功率调至安全水平，并将漂白功率设置为比监测漂白测试中确定的漂白阈值高出约200毫瓦。这些功率均通过施加于AL细胞晶体上的不同电压来设定，随后关闭显微镜光源。

打开光电倍增管（PMT）。在成像软件上开始点扫描，然后启动脉冲发生器和计数器。

为了分析所得的恢复曲线，标记三个重要点：漂白前荧光、漂白后立即测得的荧光以及数据集结束时的荧光。利用漂白前和漂白后立即测得的荧光值，可更准确地估算半数恢复时间。

现在，根据前面步骤中所述的规则，更新预漂白和开始宽度的持续时间值。获取一条新曲线，并继续调整参数，直到所得曲线显示出明显的漂白效果和平滑的恢复过程。通过绘制漂白深度参数的对数与激光功率对数的关系图，检查是否存在激发饱和现象。

任何偏离斜率为二的情况均表明存在激发饱和。应选择一种能够产生强烈漂白但不会引起饱和的漂白功率。最后，在确定适当参数后，继续对目标样本进行多光子荧光漂白后恢复（MP FRAP）曲线或多光子荧光恢复（MP FP）曲线的采集。

现在我们将展示原始MP荧光漂白恢复（Frap）数据的代表性结果，以及经过拟合后的归一化MP F包裹曲线。在原始MP F frap数据中，可观察到明显的漂白效果和平滑的恢复过程。为了拟合数据，我们对数据后半段的完全恢复部分进行分析。首先，将恢复信号相对于漂白前荧光平均值进行归一化处理，然后进行非线性最小二乘拟合。

关于合适的模型，两个数据集均在水溶液中的荧光素中采集，并得到扩散系数。这些结果与文献报道一致。我们刚刚向您展示了如何进行多光子荧光漂白后恢复实验。

进行此操作时，务必谨慎设置实验参数，特别是漂白时间以及漂白和监测功率，应将其控制在本方案所定义的安全范围内。感谢观看，祝您的实验顺利成功。