Name: 通过双光子荧光恢复漂白后测量扩散系数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学习使用双光子荧光恢复漂白后技术测量分子扩散系数的方法。本实验演示如何通过激光光路对准和荧光恢复曲线拟合，定量分析荧光分子在生物样品中的动态行为。

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本工作由美国国防部希望时代学者奖（编号：W81XWH-05-0396）和 Pew 生物医学科学学者奖资助，获奖者为 Edward B. Brown III。

1. 调整光学元件。
进行多光子荧光漂白恢复（MP-FRAP）实验所需的关键设备包括：锁模激光光源、普克尔斯盒（用于光束调制）、脉冲发生器、二向色镜、物镜、荧光发射滤光片、门控光电倍增管，以及数据记录系统（光子计数器和多通道定标器）。
2. 确定安全的监测功率。
<ol>
<li>将激光衰减至较低但合理的功率，以在样品中产生荧光。</li>
<li>在样品内进行聚焦。</li>
<li>设置光子计数器，使其积分时间远长于预期的荧光恢复时间。保持聚焦体积在样品中的位置固定（在我们的显微镜软件中，通过点扫描实现），记录足够数量的光子计数数据。</li>
<li>增加激光功率，并采集另一组光子计数数据。重复此过程，直至光子计数的增幅相对于功率增加显著减小。</li>
<li>绘制 log(光子计数) 对 log(功率) 的曲线图。若斜率偏离 2，则表明监测过程中发生了漂白。选择一个低于该拐点但仍能提供合理信噪比的功率作为监测功率。</li>
</ol>
3. 确定脉冲发生器和多通道定标器的输入参数。
<ol>
<li>根据文献和/或斯托克斯-爱因斯坦方程及扩散方程，估算扩散系数和恢复时间的数量级。</li>
<li>在脉冲发生器和定标器上设置必要的参数值。
<ol class="lalpha">
<li>在脉冲发生器上，设置预漂白和漂白时间。经验法则建议：预漂白时间应为预期半恢复时间的1至2倍，漂白时间应为预期半恢复时间的十分之一。</li> 
<li>在定标器上，将时间通道宽度设为漂白持续时间的大约一半，并设置每条记录的时间通道数，使得所选通道宽度与每条记录通道数的乘积大于或约等于预期的完全恢复时间加上预漂白和漂白时间的总和。</li> 
<li>返回脉冲发生器，将预漂白/漂白/监测序列的频率设置为略小于（通道宽度 × 每条记录通道数）倒数的值。*</li> 
<li>最后，根据所选监测功率下的信号强度，在定标器上设置每扫描的记录数。 
*必须确保脉冲发生器上设置的完整预漂白/漂白/监测序列周期（1/频率）大于定标器上设置的数据采集时间（通道宽度 × 每条记录通道数）。若不满足此条件，定标器的单条记录中可能出现多个漂白触发信号。</li>
</ol>
</li>
<li>将监测功率设为先前确定的合适水平。将漂白功率设为比监测漂白测试中确定的漂白阈值高约200 mW的水平。这些功率均通过在PC晶体两端施加不同电压来实现。</li>
<li>封闭显微镜系统，关闭室内光源，开启光电倍增管（PMT），在显微镜软件中开始点扫描，然后启动脉冲发生器和定标器。</li>
<li>通过绘制恢复曲线并标记三个关键点来分析所得恢复曲线：1）漂白前荧光强度，2）漂白后立即的荧光强度，3）数据集结束时的荧光强度。利用漂白前和漂白后立即的荧光值，进一步估算半恢复时间。</li>
<li>根据此半恢复时间的估算值，使用前述经验法则确定新的预漂白、漂白和通道宽度持续时间。同时，利用漂白前荧光强度和数据集结束时的荧光强度，更准确地估算达到完全恢复所需的时间。经验建议：数据采集时间应足够长，以确保数据后半段能够反映完整的恢复过程。</li>
<li>调整脉冲发生器和定标器的参数，获取新的曲线，并持续优化参数，直至曲线显示出明显的漂白效果和平滑的恢复过程。需注意，在条件允许时，漂白持续时间可且应低于经验推荐值。若漂白过浅或过深，也可相应调整漂白功率。</li>
</ol>
4. 检测激发饱和。
<ol>
<li>使用先前确定的适当监测和漂白功率，采集一系列多光子荧光漂白恢复（MP-FRAP）曲线。采用适当的数学形式和非线性最小二乘拟合算法（见下文“数据分析”），对每条恢复曲线进行分析，并将其归一化至漂白前荧光强度。记录拟合得到的漂白深度参数值。</li>
<li>继续在逐步增加的漂白功率下，连续采集并分析多组 MP-FRAP 曲线。</li>
<li>绘制漂白深度参数的对数（log）与漂白功率对数（log）之间的关系图。若所得斜率偏离2，则表明存在激发饱和现象。选择一个能够产生较强漂白效果但不引起饱和的漂白功率。</li>
</ol>
5. 继续采集 MP-FRAP 曲线。
<ol>
<li>按照上述方法继续采集曲线，确保所有参数均已正确设置。</li>
</ol>
6. 数据分析。
<ol>
<li>从荧光数据集中移除漂白前和漂白期间的数据，并调整时间数据，使 t = 0 对应漂白后立即测得的荧光值。</li>
<li>将获得的荧光恢复曲线相对于漂白前平均荧光值进行归一化处理。</li>
<li>使用适当的数学模型和非线性最小二乘拟合算法（例如 MATLAB 中的 lsqcurvefit 函数）对归一化曲线进行拟合。此处提供的模型适用于同时受扩散和对流流动影响的荧光恢复过程： <img src="/files/ftp_upload/1636/1636eq.jpg" alt="静态平衡公式图示，展示动态系统分析中的复杂求和。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程"> 其中 Fo 为漂白前平均荧光值，β 为漂白深度参数，τD 为扩散恢复的特征时间，R 为双光子聚焦体积轴向（wz）与径向（wr）宽度平方的比值，τvx = wr/vx，τvy = wr/vy，τvz = wz/vz，而 v2 = vx2 + vy2 + vz2 表示对流流动的速度。
当流动局限于成像平面时，τvz → ∞，且 1/τvx + 1/τvy 可被 1/τvr 替代。在无对流流动的情况下，分子中的两个指数项均趋近于 1，表达式大大简化，仅保留两个拟合参数 β 和 τD。
扩散系数可直接计算为 D = wr2/8τD。</li>
</ol>
7. 代表性结果。
<img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig1.jpg" alt="光子计数与时间关系图；光子发射分析；光谱测量结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. FITC-BSA 的典型漂白与恢复曲线。一条良好的恢复曲线应表现出明显的漂白效果和平滑的恢复过程，且在完全恢复时的荧光强度以数据后半段的数值为准。
<img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig2.jpg" alt="归一化荧光强度随时间变化曲线，显示指数拟合，用于荧光寿命分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. FITC-BSA（红色）的归一化恢复曲线及其对应的最小二乘拟合（黑色）。该拟合得到的扩散系数为 52.9 µm²/s，与文献报道值一致。

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li>
<li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li>
</ol>

多光子荧光漂白后恢复技术的强大之处在于其能够以三维分辨率探测厚样品。自20世纪90年代发展以来，MP-FRAP已被用于测定细胞体中的扩散系数（或类似的传输参数）， 离体 厚组织切片，以及 在体内 组织与间质。本文介绍了进行多光子荧光漂白后恢复（MP-FRAP）实验所需的设备，以及正确对准光路、设定实验参数、采集数据和分析恢复曲线的操作步骤。
选择合适的激发波长和发射滤光片应依据双光子吸收截面和发射光谱。这些信息通常包含在各种染料的技术参数中。此外，在调整激光光路时，必须确保物镜后透镜得到适当的过填充。这通常通过在光学系统中添加扩束镜来实现。可通过在轴向和径向扫描亚分辨率的固定荧光微珠，然后将荧光强度分布绘图并拟合为高斯曲线，以确定1/e2宽度，并与文献值进行比较，从而验证过填充是否恰当。
选择合适的监测和漂白功率也非常重要。用于漂白前后荧光监测的功率应足够低，以避免引起明显的漂白，但又要足够高，以获得良好的信噪比。漂白功率必须避免激发饱和。在双光子荧光漂白恢复（MP...

<table><tbody><tr><td>钛宝石激光器</td><td>Newport Corp.</td><td>Mai Tai</td><td></td></tr><tr><td>普克尔斯盒</td><td>Conoptics</td><td>350-80</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>短通二向色镜</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>670 DCSX-2P</td><td></td></tr><tr><td>光电倍增管</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>光子计数器</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 400</td><td></td></tr><tr><td>多通道定标/平均器</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 430</td><td></td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG 535</td><td></td></tr><tr><td>FITC-BSA</td><td>Invitrogen</td><td>--</td><td></td></tr></tbody></table>

通过双光子荧光漂白后恢复法测量扩散系数

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

多荧光漂白后恢复是一种显微镜技术，用于测量大分子的扩散系数（或类似的传输参数），可应用于两者in vitro和in vivo生物系统。多荧光漂白后恢复（multi-fluorescence recovery after photobleaching）实验通过使用强激光脉冲对荧光样品中特定区域进行光漂白，随后减弱激光强度，并监测来自该区域外仍具荧光的分子扩散进入以取代被漂白分子时的荧光恢复情况。我们的演示将首先调整激光光路，使其通过普克尔斯盒（Pockels Cell，激光调制器），并沿光路经过激光扫描盒和物镜，最终到达样品。为简化操作，我们将使用一种水溶性荧光染料作为样品。接下来，我们将确定适用于该样品的实验参数，包括监测功率和漂白功率、漂白持续时间、计数bin宽度（用于光子计数）以及荧光恢复时间。随后，我们将描述获取恢复曲线的步骤，该过程可通过LabVIEW软件（National Instruments，奥斯汀，德克萨斯州）实现高度自动化，从而提高实验通量。最后，通过使用最小二乘法拟合算法，将恢复数据拟合至适当的数学模型，从而确定扩散系数，此分析过程可方便地利用MATLAB软件（The Mathworks，纳蒂克，马萨诸塞州）进行编程实现。

本文将介绍利用多光子荧光漂白后恢复技术测量扩散系数的实验步骤。我们将首先沿光路对样品进行激光校准，并确定合适的实验参数，随后生成荧光恢复曲线并进行拟合分析。

多荧光漂白后恢复是一种显微镜技术，用于测量扩散系数（或类似的传输参数）……

多光子荧光。光漂白后恢复过程可通过荧光染料分子的自由扩散样品轻松演示。首先，将一束低强度激光射入样品，以激发激光聚焦体积内D分子产生参考水平的荧光信号。接下来，通过短暂的高强度激光闪光，使焦平面内部分染料分子发生光漂白。最后，将激光衰减至先前的低强度水平，并监测荧光信号：随着被光漂白的分子向外扩散，来自焦平面外的未漂白荧光分子扩散进入该区域并将其取代。通过分析所得的荧光强度随时间变化的曲线，可计算出扩散系数。大家好，我是来自罗切斯特大学生物医学工程系Edward Brown实验室的Kelly Sullivan。今天我们将向您展示如何进行多光子荧光漂白后恢复实验。在我们的实验室中，利用该技术研究体外和体内生物系统中的扩散现象。下面我们开始。首先设置所需的激光波长，并在光电倍增管（PMT）前插入合适的滤光片。接下来，为了避免对 pcal 细胞造成损伤，将激光功率调节至 200 毫瓦或更低。在 pcal 细胞上游有一个呈“四”字形排列的两面反射镜。这两面反射镜对于将激光束准直通过 pcal 细胞是必要且充分的。将 pcal 细胞偏压控制器的电压偏移设为零，调节激光通过 pcal 细胞的光路，使激光在前后窗口均居中。使用图四中的上游反射镜将光束在前窗口居中，使用图四中的下游反射镜将光束在后窗口居中。现在将 pcal 电池晶体两端的电压设置为最大值。合适的电压值取决于波长，可在 pcal 电池使用手册中找到。调节位于 pcal 电池上游的图四中的反射镜，直到 pcal 电池的输出功率达到最大。现在将晶体两端的电压切换为零，并调节偏置控制器上的电压偏移，以最小化 pcal 电池的输出功率。将入射到 pcal 电池上的激光功率恢复至实验所需值。现在转移到显微镜下，对标准化的荧光样品进行良好的视觉聚焦。此处我们使用固定的荧光花粉颗粒。聚焦完成后，封闭显微镜，通过调节pcal细胞晶体两端的电压，将激光功率调整至适合样品成像的适当水平。最后，关闭光源并打开光电倍增管（PMT）。对标准化样品开始重复扫描成像，并调节 pcal 池下游的反射镜，直至获得样品的清晰图像。现在我们来看如何确定样品内聚焦点处的安全监测功率。在本视频中，我们将使用载玻片凹槽内盛装的水溶性染料样品，并用盖玻片封片。将激光衰减至较低但足以在样品中产生荧光的合理功率。封闭显微镜，将光电倍增管（PMT）的输出信号导入光子计数器。关闭光源，打开光电倍增管（PMT），并在显微镜软件中开始点扫描。将光子计数器设置为积分时间远长于预期荧光恢复时间的尺度，并记录足够数量的数据点。增加激光功率，再采集另一组光子计数数据。继续增加功率，直到光子计数的增幅明显减小为止。相对于功率增加曲线，以光子计数的对数作为功率对数的函数。若斜率偏离2，则表明发生了漂白。监测过程中，选择低于此截止值的合理监测功率。现在确定多通道定标器和脉冲发生器的输入参数。在脉冲发生器上。在标量器上，将预激发时间设置为预期半数恢复时间的1至2倍，将淬灭时间设置为预期半数恢复时间的1/10。将时间箱宽度设置为约等于淬灭持续时间的一半，并设置每条记录的时间箱数量，使得所选时间箱宽度与每条记录时间箱数的乘积大于预期的完全恢复时间。将预激发和淬灭时间重新输入脉冲发生器，并将预激发-淬灭序列的频率设置为略小于时间箱宽度与每条记录时间箱数乘积的倒数的值。最后，根据在选定的监测功率下测得的信号强度，在定标器上设置每次扫描的记录数。然后将监测功率调至安全水平，并将漂白功率设置为比监测漂白测试中确定的漂白阈值高出约200毫瓦。这些功率均通过施加于AL细胞晶体密封上的不同电压来设定，随后关闭显微镜光源。打开光电倍增管（PMT）。在成像软件上开始点扫描，然后启动脉冲发生器和计数器。为了分析得到的恢复曲线，标记三个重要点：漂白前荧光、漂白后立即获得的荧光以及数据集结束时的荧光。利用漂白前和漂白后立即获得的荧光值，可更准确地估算半数恢复时间。现在，利用前面步骤中所述的规则，更新预漂白和开始宽度的持续时间值。获取一条新曲线，并继续调整参数，直到所得曲线显示出明显的漂白效果和平滑的恢复过程。通过绘制漂白深度参数的对数与激光功率对数的关系图，检查是否存在激发饱和现象。任何偏离斜率为2的情况均表明存在激发饱和。应选择一种能够产生强烈漂白但不会引起饱和的漂白功率。最后，在确定适当参数后，继续对目标样本进行多光子荧光漂白后恢复或多光子荧光恢复曲线（MP FRAP）的采集。现在我们将展示原始MP荧光漂白恢复（Frap）数据的代表性结果，以及经过拟合后的归一化MP F包裹曲线。拟合得到的扩散系数显示，原始MP F frap数据表现出明显的漂白效应和平滑的恢复过程。为了拟合数据，我们对数据后半段报告的完全恢复部分进行分析。首先，我们将恢复信号归一化至漂白前荧光强度的平均值，然后进行非线性最小二乘法拟合。关于合适的模型，两个数据集均在水溶液中的荧光素中采集，并得到扩散系数。这些结果与文献报道一致。我们刚刚向您展示了如何进行多光子荧光漂白后恢复实验。进行此操作时，务必谨慎设置实验参数，特别是漂白时间以及漂白和监测功率，应将其控制在本方案所定义的安全范围内。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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Biology

生物学

通过双光子荧光恢复漂白后测量扩散系数

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