Name: 一个多参数的胰岛内的微流控Perifusion装置Perifusion系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习使用微流控胰岛灌流装置同时测量动态胰岛素分泌、钙离子内流及线粒体膜电位变化。该方法结合荧光显微镜成像技术，为研究胰岛细胞生理功能和糖尿病代谢机制提供了高效的研究工具。

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本工作得到了美国大学妇女协会（AAUW）国际奖学金对 Adeola Adewola 的资助、美国国立卫生研究院/国家研究资源中心（NIH/NCRR，项目编号 U42RR023245）对 Jose Oberholzer 的资助，以及芝加哥糖尿病项目的支持。

A. 三层微流控灌注装置的微加工
底部微孔主程序（150 μm 深孔）
<ol>
 <li>如有需要，使用剃刀清洁晶圆。依次用丙酮、甲醇和异丙醇（IPA）清洗。在50瓦功率下进行30秒的等离子体处理。</li>
 <li>以2000 rpm转速旋涂SU8-100。[步骤1：500 rpm，10秒，加速100 rpm/s；步骤2：2000 rpm，30秒，加速300 rpm/s]。 [注意：旋涂SU8后不得用镊子夹持晶圆]</li>
 <li>将晶圆在65 °C下预烘20分钟，然后在95 °C下烘烤50分钟。</li>
 <li>通过所需掩模版将晶圆暴露于紫外光下。对于150 μm高度的结构，曝光剂量为650 mJ/cm2。</li>
 <li>曝光后，将晶圆在65 °C下烘烤1分钟，然后在95 °C下烘烤12分钟。</li>
 <li>将晶圆在SU8显影液中显影15分钟。</li>
</ol>
微通道母版方案（500 μm 深孔）
<ol>
 <li>如有需要，使用剃刀清洁晶圆。依次用丙酮、甲醇和异丙醇（IPA）清洗。在50瓦功率下进行等离子处理30秒。</li>
 <li>以1000 rpm转速旋涂SU8-2150。[第一步：500 rpm，10秒，加速100 rpm/s；第二步：1000 rpm，30秒，加速300 rpm/s]。</li>
 <li>将晶圆在65 °C下预烘15分钟，随后在95 °C下烘烤2小时30分钟。</li>
 <li>通过所需掩模版将晶圆暴露于紫外光下。对于650 μm高度的结构，曝光剂量为685 mJ/cm2。</li>
 <li>曝光后，将晶圆在65 °C下后烘5分钟，在95 °C下后烘35分钟。</li>
 <li>在SU8显影液中显影晶圆20–30分钟。</li>
</ol>
聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液的制备
<ol>
 <li>通过充分混合10份硅弹性体与1份标准Sylgard 184试剂盒中的固化剂，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。</li>
 <li>使用真空干燥器去除混合过程中在PDMS溶液中产生的气泡。</li>
 <li>将无气泡的PDMS溶液缓慢滴加到SU8模具以及用于第三层的空培养皿上。</li>
 <li>将热板温度设定为75 °C，并在此温度下固化PDMS 2小时。</li>
 <li>使用合适尺寸的打孔器冲出入口、出口和交换孔。</li>
 <li>使用手持式等离子体设备将各层在玻璃载片（厚度0.1 mm）上键合在一起。</li>
</ol>
B. 实验装置
<ol>
 <li>通过微装置流过70%乙醇以进行灭菌，随后用去离子水冲洗以去除乙醇。再灌注50 ml含0.5% BSA的溶液，以防止胰岛素非特异性吸附到微通道壁上。</li>
 <li>通过与注射泵通信的LabView软件测试葡萄糖梯度及其他相关梯度，确保梯度稳定。</li>
 <li>将25–30个鼠胰岛在含2 mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液（KRB）中，于37 °C孵育30分钟，孵育液中加入5 μM Fura-2/AM（钙离子指示剂，Molecular Probes，CA）和2.5 μM Rhodamine 123（Rh123，线粒体膜电位指示剂，Sigma，MO）。</li>
 <li>通过入口端口，用移液器小心地将鼠胰岛装入微流控灌注装置中。</li>
 <li>使用Tygon管和Y型连接器将入口连接至注射泵，出口连接至组分收集器，从而构建微流控系统。装置置于显微镜载物台的加热板（37 °C）上，同时入口管路在加热板上加热，以维持腔室和溶液温度在37 °C。</li>
 <li>装置设置完成后，立即用含2 mM葡萄糖的KRB对鼠胰岛进行灌注10分钟，随后进行葡萄糖梯度灌注（2 mM → 25 mM），持续25分钟。</li>
 <li>使用SimplePCI软件每15秒采集并分析一次延时图像。同时，利用组分收集器每分钟收集一次灌注液，用于通过ELISA试剂盒分析胰岛素分泌情况。</li>
</ol>
代表性结果
小鼠胰岛采用2-25 mM葡萄糖线性梯度进行灌流。如图1所示，钙离子内流和胰岛素分泌在灌流约13分钟后被触发，此时葡萄糖浓度为6 mM。线粒体电势的变化如预期般更早出现，约在11分钟时即可观察到。该数据表明，利用此微流控网络来表征胰岛生理功能具有显著优势。
<img src="/files/ftp_upload/1649/1649fig1.jpg" alt="钙离子、线粒体、胰岛素水平随时间变化；用于细胞反应分析的曲线图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 图1. 胰岛细胞刺激后的生理反应。

<ol><li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
</ol>

传统的胰岛灌流系统（宏观和微观尺度）存在一些局限性，包括系统设置和设计复杂、技术要求高，以及难以在系统中创建用户自定义的化学梯度。本文所述的微流控灌流系统通过简化的结构设计和制造工艺克服了这些局限。更重要的是，该系统可与荧光成像方法相结合，成为研究胰岛生理学的独特工具。该系统在荧光信号检测中表现出高信噪比以及优异的空间-时间分辨率。当前的原型装置还能在单个芯片上容纳多个灌流单元，并提供多种类型的微环境，适用于广泛的应用场景。

<table><tbody><tr><td>60ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 荧光染料</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>罗丹明123 荧光染料</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30&quot; 硅胶管</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 x 1/8in</td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorf 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y型连接头</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16&amp;#8221; &amp;amp; 4mm</td></tr><tr><td>注射器连接头</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>雌性鲁尔接头 1/16&amp;#8221;</td></tr><tr><td>直通连接头</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16&amp;#8221;</td></tr><tr><td>弯头连接头</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16&amp;#8221;</td></tr><tr><td>哈佛注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>PMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组分收集器</td><td>Gibson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>电荷耦合器件</td><td>QImaging</td><td></td><td>Retiga-SRV, Fast 1394</td></tr></tbody></table>

一种用于微流控灌注装置的多参数胰岛灌注系统

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

一种用于评估多个胰岛动态胰岛素分泌并同时进行钙离子内流及线粒体膜电位变化荧光成像的微流控胰岛灌流装置被开发出来。该装置由三层结构组成：第一层包含一系列微尺度孔阵列（直径500 μm，深度150 μm），可在灌流条件下固定胰岛并最大化胰岛暴露的表面积；第二层包含一个圆形灌流腔室（深3 mm，直径7 mm）；第三层包含一条在注入灌流腔室前呈扇形展开的进样混合通道（宽2 mm，长19 mm，高500 μm），以优化进入灌流腔室前的混合效率。此外，文中还展示了在微流控灌流网络中生成多种葡萄糖浓度梯度（包括线性、钟形和方形梯度）的方法。

开发了一种微流控胰岛灌注装置，用于评估多个胰岛的动态胰岛素分泌，同时进行钙离子内流和线粒体膜电位变化的荧光成像。

一种用于评估多个胰岛动态胰岛素分泌及同步荧光的微流控胰岛灌流装置被开发用于……

在本演示中，我们将介绍一种基于微流控技术的眼睑灌注系统，用于同时测量胰腺类眼体在胰岛素分泌刺激物作用下胰岛素的动态分泌、钙离子内流以及线粒体膜电位的变化。该灌注系统由三层微流控装置、注射泵和胰岛素组分收集器组成。通过荧光显微镜系统对分泌刺激物诱导的钙离子内流和线粒体膜电位进行成像。大家好，我叫Ola，是芝加哥大学伊利诺伊分校移植外科系Val Holter博士实验室的一名瓦勒（Waller）。大家好，我是Don Lee，也来自十月实验室（October's Lab）。大家好，我是Tricia Hart，同样来自Al Holster博士的实验室。今天我们将向您展示一种使用线性葡萄糖梯度进行眼睑同步成像的实验方法。我们在实验室中采用该方法来研究眼器的视觉特性与功能。现在让我们开始吧。本实验所用的微流控装置由通过标准光刻技术制备的三层固化PDMS组装而成。第一层由硅胶母模制得，含有用于固定眼状结构的微流控装置孔穴，深度为150微米，直径为500微米。第二层具有高500微米、宽2毫米的通道。通道中部被扩大，以分散流体，从而在装置内部实现更充分的溶液交换。交换腔通过在该层中部打一个高3毫米、宽7毫米的孔而形成。第三层是一块较厚的PDMS平板。制备该层时，需在两侧打两个小孔，使其与通道的入口和出口对齐。当所有三层均制备完成后，在第二层上，将第一层与载玻片键合，孔朝上；然后将第二层与第一层键合，通道间隔面朝上；最后将第三层与第二层键合。一旦各层完成键合，该装置即可用于实验。使用一个装有10毫升70%乙醇并经Tai管路连接至装置入口端口的注射器，使乙醇流经装置内的微流控通道，从而对微流控装置进行灭菌。随后，使用相同的装置和流程，通入去离子水以冲洗残留的乙醇。设备灭菌后，使用特氟龙管将其放置在加热的显微镜载物台上，将含有高浓度和低浓度葡萄糖溶液的注射泵连接至Y型连接器，然后连接至微流控装置的入口。将微流控装置的出口连接至组分收集器。确保管道放置在37摄氏度的加热板上。在整个实验过程中，保持溶液处于生理温度至关重要。接下来，使用LabVIEW程序启动葡萄糖梯度，该梯度将在实验期间通过微流控网络进行灌注。该软件可调节两种葡萄糖溶液的流速。通过控制注射泵，可在此生成多种葡萄糖浓度梯度曲线，包括线性、钟形和方形的葡萄糖梯度曲线。本实验中，将采用两种葡萄糖溶液流速在0.01毫升/分钟范围内变化、混合后以0.25毫升/分钟恒定流速进入装置的条件，建立从2毫摩尔至25毫摩尔葡萄糖的线性梯度，并将其与计算所得的理论预期值进行比较。选择合适的梯度程序后，需检测梯度的稳定性。首先启动梯度系统，然后启动组分收集器，收集灌流液，每管一毫升，共收集八管。然后使用血糖仪，通过 Excel 检测各试管中葡萄糖的浓度。分析血糖仪获得的结果。接下来，将高浓度葡萄糖注射器更换为含有 0.5% BSA 溶液的注射器，用 Krebs-Ringer 缓冲液以每分钟 1 毫升的流速向装置中灌注 50 毫升。这将防止胰岛素非特异性吸附到微通道壁上，从而在用BSA灌注后测定分泌的胰岛素水平时确保准确性。用高葡萄糖溶液重新置换。将25至30个手工挑选的小鼠胰岛悬浮于含有2 mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液中，该缓冲液包含钙离子指示染料Fura-2 AM和线粒体膜电位指示染料Rhodamine 123，于37摄氏度孵育30分钟。孵育后，将装置从灌注系统断开，小心地将胰岛通过移液枪尖端经入口端口装入微流控装置中，在缓慢释放胰岛后，重新将装置连接至灌注系统，注意避免引入气泡。随后启动注射泵，开始以含有2毫摩尔葡萄糖的KRB缓冲液对胰岛进行灌注。此步骤将洗去培养基中多余的染料，设定实验过程中将使用的激发和发射滤光片组合及曝光时间。然后将组分收集器设置为以一分钟为间隔进行收集，同时使用含低葡萄糖溶液的孔。利用 Simple PCI 成像软件中的感兴趣区域（ROI）工具，定义需要成像的区域或孔。同时，圈定将在细胞洗涤10分钟后被减去的背景区域，启动葡萄糖梯度分部收集器并开始时间推移成像。30分钟后，关闭软件和高葡萄糖注射泵。继续用低葡萄糖溶液灌注，以洗去高葡萄糖的影响。10 分钟后，通过关闭注射泵来停止低葡萄糖的流动。灌注结束后，将数据导出至 Excel 进行分析。通过 ELA 小鼠眼片法可测定分泌到灌注液中的胰岛素含量。以2至25毫摩尔的葡萄糖线性梯度进行灌流，如图所示。约灌流13分钟后，对应于6毫摩尔葡萄糖浓度时，触发钙离子内流和胰岛素分泌。线粒体电位的变化出现较早，约在11分钟时，符合预期。这些数据表明，利用该微流控网络来表征小孔生理学具有优势。我们刚刚向您展示了如何使用我们的微流控灌注装置来研究小孔生理学。在进行该操作时，重要的是要确保装置中没有气泡，因为气泡可能导致小孔在实验过程中发生移动。此外，流速可调节至每分钟一毫升，而不会影响小孔。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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一个多参数的胰岛内的微流控Perifusion装置Perifusion系统

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