一个多参数的胰岛内的微流控Perifusion装置Perifusion系统

在本次演讲中，我们将介绍一种基于微流体的眼睑灌注系统，用于同时测量胰岛素分泌物对胰岛素分泌犬的动态胰岛素分泌、钙内流和胰眼线粒体电位变化。灌注系统由三层微流控装置、注射泵和馏分收集器胰岛素组成。使用荧光显微镜设置对促分泌剂诱导的钙内流和线粒体电位进行成像。

大家好，我叫 Ola，是伊利诺伊大学芝加哥分校移植外科 Val Holter 博士实验室的一名沃勒。大家好，我是 Don Lee，同样来自 October's Lab。大家好，我是 Tricia Hart，也是来自 Dr.Al Holster 实验室的。

今天，我们将向您展示一种使用线性葡萄糖梯度进行同步眼睑成像的程序。我们在实验室中使用该程序来研究孔眼的视觉效果和功能。那么让我们开始吧。

用于该程序的微流体装置由标准光刻产生的三层固化 PDMS 组装而成。由硅胶母版生成的第一层具有微流体装置的孔，该孔将轻轻地将孔眼固定到位，深 150 微米，直径 500 微米。第二层有 500 微米高、2 毫米宽的通道。

通道的中间扩大以分散流动，以便更好地交换溶液 在设备内部，通过在层中间打一个 3 毫米高、7 毫米宽的孔来交换良好。第三层是厚厚的 PDMS 板。要准备这一层，请在两侧打小孔，使其与通道的入口和出口对齐。

在第二层，一旦生成了所有三层，第一层被粘合到载玻片上，孔朝上。然后，将第二个图层与第一个图层粘合在一起，同时保持通道间距。最后，将第三层粘合到第二层。

一旦各层被粘合，该设备就可以用于实验了。使用装满 70% 乙醇的 10 毫升注射器，并通过管道上的 Tai 连接到设备的入口，通过使乙醇流过设备通道对微流体设备进行消毒。然后使用相同的设置流程，用去离子水洗去乙醇。

设备消毒后，使用 tigon 管将其放在加热的显微镜载物台上，将含有高葡萄糖和低葡萄糖溶液的注射泵连接到 Y 型连接器。然后连接到微流体装置的入口。将微流体装置的出口连接到馏分收集器。

确保管路放在 37 摄氏度的热板上。在整个实验过程中，将溶液保持在生理温度下非常重要。接下来，使用实验室视图程序启动葡萄糖梯度，该梯度将在实验期间通过微流体网络灌注。

该软件可改变两种葡萄糖溶液的流速。通过控制注射泵，可以在此处创建各种葡萄糖梯度曲线，线性、钟形和方形葡萄糖梯度曲线。与本实验中显示的计算预期值相比，将使用 2 毫摩尔至 25 毫摩尔葡萄糖的线性梯度，两种葡萄糖溶液的变化流速为 0.01 毫升/分钟，恒定流速为每分钟 0.25 毫升溶液混合后进入装置。

选择合适的梯度曲线后，测试梯度的稳定性。首先，启动渐变系统。然后启动馏分收集器并收集灌注 8 个合一毫升的 eend orph 管。

然后使用血糖仪，使用 excel 测试每管中的葡萄糖浓度。分析从血糖仪获得的结果。接下来，以每分钟 1 毫升的速度，通过装置更换含有 0.5% BSA 溶液的注射器 PERFUSE 50 毫升。

这将防止胰岛素非特异性吸收到微通道壁，以确保以后测量 BSA 灌注后分泌的胰岛素水平时的准确性。用高葡萄糖溶液 reus 代替它。将 25 至 30 个精心挑选的小鼠孔悬浮在含有钙指示剂染料 fira 的 2 毫摩尔葡萄糖克雷布斯林格缓冲液中 2：00 AM 和线粒体电位指示剂染料 rumine 1 2 3，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育后，断开装置与灌注系统的连接，小心地将管眼装入微流控装置中，将装有胰岛的移液管尖端插入入口，加载后缓慢分配胰岛，将装置重新连接到灌注系统。小心不要引入气泡。接下来，启动注射泵，开始用含有 2 毫摩尔葡萄糖的 KRB 灌注孔眼。

此步骤将从培养基中清洗多余的染料，指定实验期间要使用的激发和发射滤光片组和曝光时间。然后将馏分收集器设置为每隔一分钟收集一次，同时将孔眼与低葡萄糖溶液一起使用。使用简单 PCI 成像软件中的感兴趣区域或 ROI 工具定义要成像的区域或孔眼。

此外，在细胞洗涤 10 分钟后，圈出将要减去的背景区域，启动葡萄糖梯度分数收集器并启动延时成像。30 分钟后，关闭软件和高葡萄糖注射泵。继续用低葡萄糖灌注以洗去高葡萄糖的影响。

10 分钟后，关闭注射泵以停止低葡萄糖的流动。灌注后，将数据导出到 excel 进行分析。分泌到 perfu 8 中的胰岛素量可以通过 ELA 小鼠孔眼来确定。

以 2 至 25 毫摩尔葡萄糖的线性梯度灌注，如图所示。钙内流和胰岛素分泌在相当于 6 毫摩尔的灌注约 13 分钟后触发。葡萄糖。线粒体电位的变化可以更早地看到，正如预期的那样，大约在 11 分钟。

该数据证明了使用这种微流体网络来表征孔眼生理学的优势。我们刚刚向您展示了如何使用我们的微流体对位融合装置进行孔眼生理学研究。执行此程序时，请务必记住确保设备中没有气泡，因为这可能会导致孔眼在实验过程中移动。

此外，流度可以调节到每分钟 1 毫升，而不会干扰孔眼。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。