一种用于微流控灌注装置的多参数胰岛灌注系统

在本展示中，我们将介绍一种基于微流控的胰岛灌流系统，用于同时测量胰岛在胰岛素分泌促剂刺激下胰岛素的动态分泌、钙离子内流以及线粒体膜电位的变化。该灌流系统由三层微流控装置、注射泵和组分收集器组成。通过荧光显微镜系统对分泌促剂诱导的钙离子内流和线粒体膜电位进行成像。

大家好，我叫Ola，是伊利诺伊大学芝加哥分校移植外科系Val Holter博士实验室的一名瓦勒氏体研究者。大家好，我是Don Lee，也来自十月实验室。大家好，我是Tricia Hart，同样来自Al Holster博士的实验室。

今天我们将向您展示一种使用线性葡萄糖梯度进行眼睑同步成像的实验方法。我们在实验室中采用该方法来研究眼点的视觉及其功能。现在让我们开始吧。

本实验所用的微流控装置由通过标准光刻技术制备的三层固化PDMS组装而成。第一层由硅胶母模制得，含有用于固定小孔的微流控装置孔穴，深度为150微米，直径为500微米。第二层具有高500微米、宽2毫米的通道。

通道中部被扩大，以使流体扩散，从而在装置内部实现更充分的溶液交换。交换腔通过在该层中部打一个高3毫米、宽7毫米的孔而形成。第三层是一块较厚的PDMS平板。制备该层时，需在两侧打小孔，使其与通道的入口和出口对齐。

当所有三层均制备完成后，在第二层上，将第一层与载玻片键合，孔朝上。然后将第二层与第一层键合，通道间隔面朝上。最后，将第三层与第二层键合。

当各层完成键合后，该装置即可用于实验。使用一个装有10毫升70%乙醇的注射器，并通过Tai管路连接至装置的入口端口，使乙醇流经装置内的微流控通道，从而对微流控装置进行灭菌。随后，使用相同的装置连接，以去离子水冲洗去除乙醇。

设备灭菌后，使用特氟龙管将其放置在加热的显微镜载物台上，将含有高浓度和低浓度葡萄糖溶液的注射泵连接至Y型连接器，然后连接至微流控装置的入口。将微流控装置的出口连接至组分收集器。

确保管道放置在37摄氏度的加热板上。在整个实验过程中，保持溶液处于生理温度至关重要。接下来，使用LabVIEW程序启动葡萄糖梯度，该梯度将在实验期间通过微流控网络进行灌注。

该软件可调节两种葡萄糖溶液的流速。通过控制注射泵，可在此生成多种葡萄糖浓度梯度曲线，包括线性、钟形和方形的葡萄糖梯度曲线。本实验中，将采用两种葡萄糖溶液流速分别为0.01毫升/分钟、混合后以恒定流速0.25毫升/分钟进入装置的条件，建立从2毫摩尔至25毫摩尔葡萄糖的线性梯度，并将其与计算所得的理论值进行比较。

选择合适的梯度程序后，需检测梯度的稳定性。首先启动梯度系统，然后启动组分收集器，收集灌流液，每管一毫升，共收集八管。

然后使用血糖仪，通过 Excel 检测各试管中葡萄糖的浓度。分析血糖仪获得的结果。接下来，将高浓度葡萄糖注射器更换为含有 0.5% BSA 溶液的注射器，用 Krebs-Ringer 缓冲液以每分钟 1 毫升的流速向装置中灌注 50 毫升。

这将防止胰岛素非特异性吸附到微通道壁上，从而在用BSA灌注后测定分泌的胰岛素水平时确保准确性。用高葡萄糖溶液取代。在含有钙离子指示染料Fura-2 AM和线粒体膜电位指示染料Rhodamine 123的2毫摩尔葡萄糖Krebs-Ringer缓冲液中悬浮25至30个手工挑选的小鼠胰岛，于37摄氏度孵育30分钟。

孵育后，将装置从灌流系统断开，并小心地将胰岛加载到微流控装置中：将含有胰岛的移液枪头插入入口端口，缓慢释放胰岛。加载完成后，重新将装置连接至灌流系统，注意避免引入气泡。接着，启动注射泵，开始用含有2 mmol/L葡萄糖的KRB溶液对胰岛进行灌流。

此步骤将洗去培养基中过量的染料，设定实验过程中将使用的激发和发射滤光片组合及曝光时间。然后将组分收集器设置为以一分钟为间隔进行收集，同时使用含低葡萄糖溶液的孔。利用Simple PCI成像软件中的感兴趣区域（ROI）工具，定义需要成像的区域或孔。

同时，圈定细胞洗涤10分钟后将被减去的背景区域，启动葡萄糖梯度分部收集器并开始时间推移成像。30分钟后，关闭软件和高葡萄糖注射泵。继续用低葡萄糖溶液灌注，以洗去高葡萄糖的影响。

10分钟后，通过关闭注射泵来停止低葡萄糖溶液的流动。灌流结束后，将数据导出至Excel进行分析。通过ELA小鼠眼片法可测定灌流液中分泌的胰岛素含量。

以2至25毫摩尔的葡萄糖线性梯度进行灌流，如图所示。约灌流13分钟后，即葡萄糖浓度达到6毫摩尔时，触发钙离子内流和胰岛素分泌。线粒体电位的变化出现较早，约在11分钟时，符合预期。

这些数据表明，利用该微流控网络来表征小孔生理学具有优势。我们刚刚向您展示了如何使用我们的微流控灌注装置来研究小孔的生理特性。在进行该操作时，重要的是要确保装置中没有气泡，因为气泡可能导致小孔在实验过程中发生移动。

此外，流速可调节至每分钟一毫升，而不会影响小孔。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。