用于富集循环有核细胞的自动化微流控血液裂解方案

为了从血液中富集循环有核细胞。首先用一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）对微流控装置进行预处理，以去除气泡，随后通过注射泵将去离子水和含2%多聚甲醛的两倍磷酸盐缓冲液（XPBS）依次通入装置，之后再加载血液样本。血液随后流经微流控装置，样品处理后的收集步骤包括离心及上清液的去除。

最后，通过流式细胞术分析样品以生成流式图。大家好，我是来自伍尔大学生物工程系微尺度生物技术实验室的William White。今天我们将向您展示一种通过微流控技术裂解全血来富集循环有核细胞的实验方法。

我们在实验室中采用此方法研究多种疾病过程中的炎症，以确保富集白细胞及其他循环中的有核细胞，同时避免细胞丢失或活化。现在开始操作。首先，将外径略大于入口和出口通道孔径的接入管紧密插入进样口和出样口的孔中。

然后，为了提供宏观到微观的接口，在每个入口的管路上连接一个30号规格的注射器针头。接下来，用1毫升注射器吸取1毫升XPBS，确保排除所有气泡。将注射器连接到入口一，用手轻轻推动注射器，直到XPBS从入口二流出。

然后立即用办公用长尾夹夹紧入口二。继续推动注射器，直至一种XPBS溶液到达微流控装置的出口端口。一旦溶液从出口流出，即用另一个长尾夹夹紧出口管路。

继续推动1毫升注射器，直至XPBS从入口3流出，并用第三个办公用长尾夹夹住入口3端口。此时，微流控装置已完全预灌注。使用大型哈佛注射泵开始校准注射泵，将直径参数设置为22.5毫米，流速设置为600微升/分钟。

对于小型哈佛注射泵，将直径参数设置为 4.61 毫米，流速设置为 20 微升每分钟。接着，将一支 30 毫升注射器插入 50 毫升锥形管中，直接从中抽取去离子水以充满注射器。

请记得标记注射器，另取一支30毫升注射器，吸入2%多聚甲醛的XPBS溶液。再次直接从锥形管中吸取溶液，并标记注射器。现在，将装有水的注射器连接至入口二，将装有2%多聚甲醛XPBS溶液的注射器连接至入口三，同时确保管路或微流控装置中无气泡残留。

然后将连接着三个注射器的入口二、入口三以及出口管路上的夹子取下。接着将两个大注射器安装到大型哈佛注射泵上，并将1毫升注射器放置在小型哈佛注射泵上。将出口管路放入一个50毫升锥形废液收集管中。

现在启动固定30毫升注射器的大号哈佛注射泵，并运行一分钟。检查装置和管路中是否存在气泡或泄漏。然后启动小型哈佛注射泵，同样运行额外一分钟。

检查是否存在气泡和泄漏。两分钟后停止泵运行。由于微流控装置现已准备好用于血液样本，待分析的血液样本按照随附的书面实验方案所述进行采集，并在采集后一小时内使用。

采集血液时，第一管血液应弃去，以避免假阳性结果。将1毫升注射器从小型哈佛注射泵上取下，然后用1毫升注射器吸取1 XPBS，充满注射器针头。为避免引入气泡，需用1毫升注射器吸取50微升1 XPBS，确保不混入任何气泡。

然后用0.5毫升血液填充注射器。填充时保持注射器垂直，以避免PBS与血液混合。接下来，将装有血液的注射器重新连接至入口一。

擦去多余的液体，并将注射器垂直安装在小型哈佛注射泵上。注意不要将血液推入管路进入设备。将出口管路从废液管上取下，放入置于冰桶中的干净50毫升离心管内。

首先启动大号哈佛注射泵的运行开关，运行一分钟。然后打开小号哈佛注射泵的开关。样品将从出口管路开始流入50毫升离心管中收集。

让1毫升注射器中的血样完全通过装置，大约需要20分钟。然后停止两个泵。运行完成后，在室温下以350 × g离心收集的样本5分钟，关闭刹车。

用移液枪吸取上清液时，将枪头置于白色沉淀的对侧。尽可能吸除上清液，尤其是红细胞碎片，注意不要扰动白色沉淀。用移液枪将样本重悬于1毫升流式缓冲液中，该缓冲液由含1% BSA和2%多聚甲醛的1×PBS组成。

上下颠倒，将样品转移至一个 1.5 毫升离心管中，在 4 × g 条件下于室温离心 5 分钟。小心移除上清液，操作方式与前次离心步骤相同。最后，加入 1 毫升流式缓冲液，涡旋振荡以重悬样品，随后通过流式细胞术分析样品。

现在我们将展示一些代表性结果，这些结果是以传真图（fax plots）的形式呈现的，样本为通过微流控装置富集后并使用流式细胞术分析的血液样本。通过传真图可以观察到红细胞裂解富集的重要性，其中红细胞形成云状信号。而采用微流控富集方案所获得的散点图则清晰明了，能够明确分辨出循环中含有的有核细胞群体。

红色区域代表淋巴细胞，绿色代表单核细胞，蓝色代表粒细胞，紫色区域尚未被明确表征。若在实验步骤中未能去除红细胞碎片，则在传真图中可见青色区域出现成簇的信号事件。细胞群体可在不同的传真图中分别进行可视化。

使用CD3和CD4维持的淋巴细胞。使用CD14维持的单核细胞，以及使用CD66P维持的粒细胞。我们刚刚向您展示了如何使用微流控溶血装置设置并运行血液样本。在进行此操作时，重要的是要记住立即运行血液样本，避免PBS在进入装置前与血液混合，并防止气泡进入装置的通道中。

以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。