Name: 单从小鼠锥感光细胞吸录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: 学习使用吸光电极技术从小鼠视网膜分离的锥感光细胞进行单细胞记录的方法。该技术可精确测量闪光诱发的光反应，为研究哺乳动物视觉处理和视网膜疾病提供可靠的电生理学手段。

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由“防盲研究”职业发展奖、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目EY 019312、以及“防盲研究”提供的无限制资助和EY 02687（华盛顿大学眼科与视觉科学系）支持。

制备电极
<ol>
 <li>使用微电极拉制仪制备记录电极，并在显微镜下用加热丝对电极进行抛光。用于小鼠视锥细胞单细胞吸吮记录时，电极尖端的内径约为 6-7 μm。</li>
 <li>制备参比电极。称取 1% 琼脂溶于蒸馏水中，在热水浴中熔化琼脂溶液。用注射器将 1% 琼脂溶液灌入玻璃毛细管（L = 100 mm，外径/内径 = 1/0.75 mm）。在室温下静置固化 10 分钟。</li>
 <li>使用金刚石刀将毛细管切成两半。</li>
 <li>将参比电极浸泡在参比溶液中，于 4 °C 下至少浸泡 24 小时。</li>
</ol>
实验设置
<ol start="5">
 <li>将小鼠置于黑色笼子中过夜进行暗适应。</li>
 <li>配制100 mL参考溶液和1 L灌流溶液（见下文），并过滤溶液。</li>
 <li>将0.1% BSA和10 mM葡萄糖溶解于20 mL参考溶液中。</li>
 <li>使用光度计校准光学刺激器的光强。</li>
 <li>将记录室安装在倒置显微镜的载物台上。</li>
 <li>用95% O2/5% CO2气体饱和灌流溶液，并将其置于40 °C水浴中以增加CO2的溶解度。溶液从瓶中流经陶瓷电阻加热器，升温至36–38 °C后进入记录室。加热器应尽可能靠近记录室，理想位置为显微镜载物台上。</li>
 <li>调节流量调节器，使流速约为1–1.5 mL/min。</li>
 <li>用参考溶液填充记录电极，将电极插入电极夹持器中，确保电极内无气泡。将夹持器安装在放大器的前置级上。将夹持器连接至吸力装置，该装置通过一段部分充满石蜡油的管路连接至电极夹持器的侧端口，管路另一端连接一个小型石蜡油储液池，可通过嘴部施加压力。</li>
 <li>将参考电极连接至前置级的另一极。将热电偶（TC）固定在参考电极上，确保电极尖端与热电偶尖端尽可能靠近，以便温度读数能最接近细胞位置。</li>
 <li>打开红外照明以观察电极。通过连接至显示器的红外相机观察电极，使用微操纵器将电极图像居中对准显示器视野中心。</li>
 <li>调整参考电极尖端位置，使其靠近记录电极尖端（距离2–4 mm）。</li>
 <li>调节加热器的直流电压，使溶液温度维持在约36–38 °C。</li>
 <li>运行封接测试，检查记录电极的电阻，正常值约为900 kΩ。</li>
</ol>
分离小鼠视网膜
<ol start="18">
 <li>在微弱红光下，使用 CO2 和颈椎脱位法处死已暗适应的小鼠。用加热的金属灼烧笔尖端轻微烧灼巩膜最背侧点，以标记眼球。使用剪刀摘除眼球。所有后续操作均在红外光下进行。</li>
 <li>在具有红外照明和图像转换器的显微镜下将眼球沿中线切开。</li>
 <li>移除角膜和晶状体。尽可能多地去除玻璃体。</li>
 <li>为记录 M-视锥细胞反应，根据灼烧标记，用剃刀刀片切除眼杯的腹侧部分4。</li>
 <li>将视网膜从色素上皮层剥离。</li>
 <li>展平视网膜并将其置于含有 1–2 mL 参考溶液的培养皿底部。</li>
 <li>用剃刀刀片将视网膜切成小而薄的片状，并将制备物置于充满纯氧的避光盒中孵育。</li>
</ol>
记录
<ol start="25">
 <li>暂时关闭加热器。将灌流液切换至旁路管路，以防止记录室干燥。</li>
 <li>使用一片Kimwipe纸巾吸除记录室中大部分溶液。用玻璃移液管将视网膜悬液转移至记录室中。</li>
 <li>等待约2分钟，直至视网膜切片沉降稳定。恢复灌流液流速，并重新开启加热器。</li>
 <li>打开红外照明以观察样本。在记录室中寻找一片外段朝上的视网膜组织（见示例图）。通过负压轻柔地将内段吸入电极中。在此配置下，应有多个细胞核和内段被吸入电极。记录细胞对强闪光的光反应，以检测电极中是否包含视锥细胞内段，并根据反应的动力学特征和幅度判断细胞是否健康。</li>
 <li>降低矿物油储液池的位置，使电极尖端受到轻微负压，以帮助固定内段在电极中的位置。</li>
 <li>找到状态良好的细胞后，记录从弱到强不同强度测试闪光的反应。测试闪光由经过校准的光学刺激器5提供。闪光强度和波长分别由一组中性密度滤光片和窄带干涉滤光片控制。测试闪光持续时间（20 ms）由计算机控制的快门调节。</li>
</ol>
溶液
<ol>
 <li>小鼠灌流液：112.5 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、10 mM HEPES（pH 7.4）、20 mM NaHCO3、3 mM Na琥珀酸盐、0.5 mM Na谷氨酸盐、0.02 mM EDTA 和 10 mM 葡萄糖。</li>
 <li>小鼠记录电极液：140 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、3 mM HEPES（pH 7.4）、0.02 mM EDTA。</li>
</ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

感光细胞的单细胞吸吮记录技术是在三十年前开发的。该技术使我们能够在不穿透细胞膜的情况下，记录由光刺激引起的跨膜电流变化。由于细胞间黏附性较高，从小鼠视网膜中分离出健康的单个视杆细胞和视锥细胞比从两栖类视网膜中分离更为困难，且由于视锥细胞比例较低（仅占3%）且体积较小，难以单独识别。内段记录（IS-in）方法通过记录多个感光细胞内段的电流克服了这一难题，其中可能包含视锥细胞。在野生型小鼠中，记录到的反应应为视杆细胞和视锥细胞反应的叠加。通过施加稳定的背景光可抑制视杆细胞的反应。在本视频中，我们使用了Tα-/-型视网膜，该视网膜中的视杆细胞因缺乏G蛋白转导素的α亚基6而无法对光刺激产生反应，因此所记录的光反应完全来自视锥细胞。

从小鼠视锥光感受器进行单细胞吸吮记录

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

视网膜中的视杆细胞和视锥细胞负责光信号的检测。在暗环境中，外段的环核苷酸门控（CNG）通道处于开放状态，允许阳离子持续内流穿过细胞膜，从而使细胞去极化。光照会触发 CNG 通道关闭，阻断阳离子内向电流，从而导致细胞超极化。基于光感受器的这种电位特性，20 世纪 70 年代开发出一种吸吮记录法，与经典的膜片钳技术不同，该方法无需穿入细胞膜即可进行记录。1. 将外段吸入充满细胞外液的紧密贴合玻璃移液管中，可在曝光测试闪光时记录单个细胞的电流变化。然而，这种成熟的“外段吸入（OS-in）”吸吮记录法不适用于小鼠视锥细胞的记录，原因是小鼠视网膜中视锥细胞比例较低（3%），且难以识别视锥细胞的外段。最近，已开发出一种“内段吸入（IS-in）”记录构型，可将感光细胞的内段/核区吸入记录移液管中。2,3. 在本视频中，我们将展示如何使用单细胞吸液电极记录单个小鼠视锥细胞的光反应。

我们将展示如何使用吸管电极记录单个小鼠视锥细胞的闪光反应。

视网膜中的视杆细胞和视锥细胞负责光信号的检测。在暗处，外段中的环核苷酸门控（CNG）通道……

本视频演示了小鼠视网膜的解剖以及随后对视锥细胞进行单细胞吸管记录的获取。将已安乐死且经暗适应的小鼠眼球在暗红光下于背部进行烧灼处理并去核。随后将眼球切成半侧扇形。沿着眼球赤道部，移除角膜和眼球的腹侧部分。将背侧视网膜从色素上皮层分离，并用剃刀片切成小而薄的组织片。随后将视网膜切片置于适配显微镜载物台的记录室中。多个感光细胞的细胞体被吸入记录电极中。当一个视锥感光细胞被吸入电极时，明亮的测试闪光会诱导产生幅度超过四皮安的光电反应。你好，我是来自圣路易斯华盛顿大学眼科与视觉研究中心Mir Kops博士实验室的Jin。今天我们将向您展示一种记录单个Moscon光感受器光反应的实验方法。我们在实验室中采用该方法研究哺乳动物视锥细胞的适应特性，视锥细胞是介导我们昼间视觉的光感受器。现在让我们开始吧。记录前一天，将实验环境置于暗室中。将小鼠放入避光的笼子中过夜以适应环境。在复式显微镜下，使用微量移液器拉制仪从硼硅酸盐玻璃管中制备记录电极。使用加热丝进行抛光。将每个电极的尖端打磨光滑，并将其开口缩小至所需直径。对于小鼠视锥细胞单细胞吸吮记录，电极尖端的内径应约为六到七微米。在蒸馏水中配制1%的琼脂溶液。将溶液置于沸水中使琼脂融化。琼脂完全融化后，转移至注射器中，并用该溶液填充玻璃移液管。制备参比电极时，将其在室温下静置10分钟，使其凝固。琼脂凝固后，使用金刚石刀将每根移液管切成两半，制成两个参比电极。将参比电极放入装有参比溶液的闪烁瓶中，并在4摄氏度下浸泡至少24小时，以使溶液充分渗透琼脂凝胶。参比电极自制备之日起最多可使用三个月。实验结束后，使用过的电极应予以丢弃。记录系统由倒置显微镜组成，显微镜安装在空气悬浮台上，以减少振动噪声，并置于法拉第笼内以降低电磁噪声。使用电动显微操作器来定位记录电极。光学刺激器由钨丝灯、计算机控制的快门和光学滤光片组成，用于调控光波长和光强度。采用膜片钳放大器检测单个光感受器细胞的膜电流。在整个记录过程中，组织将持续灌流。将一升配制好的灌流缓冲液置于靠近记录系统的40摄氏度水浴中。然后使用管路将灌流缓冲液连接至95%氧气和5%二氧化碳的混合气体，使其持续冒泡。使用光度计测量来自光学刺激器的未衰减光功率，将光度计的探测器放置在显微镜载物台上，位置与待测样本所处平面一致。随后，将读数给出的微瓦值转换为每平方微米每秒的光子数，以估算每次测试的光子数量，并考虑中性密度滤光片对光的衰减作用。测量完未衰减的光功率后，将光度计从载物台上取下，并将用于实验的记录室安装到倒置显微镜的载物台上。使用管路将灌流溶液瓶通过调节阀连接至记录室，并将管路穿过加热电阻进行布线。确保加热电阻器紧接在记录室之前放置。然后将旁路管从调节阀连接到记录室。通过打开并调节流量调节阀，使流速达到每分钟1至1.5毫升，开始灌注。灌流液依靠重力从记录室流出并流入收集瓶中。使用带有钝头针头的注射器将参考液注入电极 holder 中。用微填充注射器针头用参考液填充并冲洗记录电极，确保电极内无气泡。将参比电极插入电极架中，并连接到放大器头部的参考极。使用橡胶环将热电偶固定在参比电极上。确保电极和热电偶尖端尽可能靠近，以保证温度读数尽可能接近细胞位置。然后将记录电极插入电极夹持器中，并将夹持器安装到放大器的头部支架上。使用管路将一小 reservoir 的石蜡油连接到电极夹持器的侧端口。通过连接至储液器的管路用嘴轻轻抽吸，即可将细胞吸入电极内。使用计算机软件，打开光学刺激器的一个快门。为了在显微镜载物台上观察测试闪光的光束区域，将显微镜聚焦至记录室的底部。使用显微操作器，将电极移至测试闪光光束区域的中心。将参考电极置于记录电极尖端附近。调节加热器电压，使记录室中溶液的温度保持在约 36 至 38 摄氏度。进行封接测试时，通过测量预设电流幅度下的电压来计算电阻，以检查记录电极的阻值，正常情况下约为 900 千欧姆。密封性测试可用于检测记录电极或参考电极中是否存在气泡，或记录电极尖端尺寸是否不合适。该测试由采集程序 ClampX 软件控制。电阻读数将显示在计算机屏幕上。如果电阻过低（小于 500 千欧），则电极尖端可能过大，需要更换新的电极。如果电阻高于一毫欧，则电极内可能存在气泡，或其尖端过窄，此时需要冲洗或更换电极。记录装置准备就绪后，在微弱红光下制备视网膜切片用于实验：取一只经安乐死处理且已暗适应的小鼠，使用加热过的解剖针尖端在其每只眼球背侧最顶端位置烧灼巩膜，然后用剪刀进行眼球核化处理。使用钝头镊子将眼球转移至配备红外照明和红外图像转换器的解剖显微镜下。所有后续解剖操作均在红外光下进行。然后使用显微剪刀沿眼球赤道切开，但烧灼点处除外。使用尖头镊子取出晶状体。然后以烧灼头为参照，尽可能去除玻璃体。用剃刀片切除视杯的腹侧部分。然后去除角膜。接着用镊子将背侧视网膜从色素上皮层剥离。随后将视网膜感光细胞受体面朝上置于新的培养皿底部，培养皿中加入一到两毫升含0.1% BSA的10毫摩尔葡萄糖参考溶液，并用刀片轻轻按压视网膜使其展平。将视网膜切成小块薄片。然后将制备好的组织置于一个持续饱和纯氧的轻型盒子中孵育，再将视网膜片放入记录室。暂时关闭加热器。将灌注流切换至旁路管路。然后使用无尘纸将腔室中的大部分溶液吸干。打开红外照明。从培养箱中取出视网膜悬液，将切片转移至记录室。使用宽口移液管，让切片静置两分钟。待视网膜切片沉降后，重新打开直接灌流系统和加热装置。找到一块视网膜，其感光细胞的外段向外突出。使用口吸法将记录电极的尖端定位在视网膜外核层上方。轻柔地将多个感光细胞的胞体吸入电极内，使细胞进入电极中。给予一个持续20毫秒、波长为500纳米的测试闪光。光感受器中因光照引起电流变化的部分代表测试闪光的反应。健康的视锥细胞将产生4至7皮安（pA）的最大反应幅度。当使用未衰减的测试闪光刺激时。一旦找到良好的细胞，用手轻轻降低矿物油储液槽，对电极尖端施加轻微的负压，以帮助将细胞内段固定在电极内。如果细胞有反应，则记录其对一系列强度从阈值到饱和的测试闪光所产生的反应。利用该技术，我们可以通过吸管电极从小鼠视网膜切片中获得视锥细胞的光反应。图中显示了来自同一细胞的多次记录叠加结果。通过强度逐渐增加的测试闪光刺激单个视锥细胞，诱导出光反应：从微弱光强（产生约1皮安的阈值反应）到强光光强（产生约5.5皮安的饱和反应）。随着闪光强度的增加，光反应的幅度也随之增大，直至达到饱和。闪光在时间零点给予。我们将向您演示如何使用吸管电极记录单个蚊子感光细胞的光反应。进行此操作时，重要的是要记住获取视网膜的视盘部分，将视网膜切成薄片，保持电极清洁无气泡，并尽量减少机械和电磁噪声。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利。

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