贴壁细胞培养用氧气插入装置的制备与操作

低氧插入装置具有六个支柱，可嵌入六孔板的孔中。气体流经支柱底部的微流控网络，并可通过气体可渗透的PDMS膜扩散，该膜将气体通道与培养基分隔开。该装置最大限度地缩短了氧气源（即支柱底部的微流控网络）与细胞之间的扩散路径长度，从而实现更快的氧气浓度平衡。

该装置还能更精确地控制暴露于细胞的氧气空间分布模式，这种模式由采用标准光刻技术结合光掩模制作的微流控气体网络设计决定。大家好，我是来自伊利诺伊大学芝加哥分校生物工程系David Edington博士实验室的Sean Ard。大家好，我也是来自Edington实验室的Ellie。

今天我们将向您展示如何制备、验证并使用一种定制装置，以在六孔板中对体外细胞培养物施加不同的氧浓度。我们在实验室中已采用该方法研究氧气对伤口愈合、活性氧生成及细胞迁移的影响。现在就开始吧。

开始制备氧合插入装置时，按预聚物与固化剂10:1的比例配制聚甲基硅氧烷（Polymethyl Siloxane）或PDMS。根据制造商说明，将PDMS混合物加入先前加工好的Dellran模具中，该模具的图案设计用于模拟标准六孔培养板的形状。在75摄氏度下固化过夜后，所得的复制模制柱阵列将构成氧合插入装置的三个组件中的第一个部分，以用于制备该氧合插入装置的第二个关键组件。

通过首先在硅晶圆上旋涂 SU 8 21 50 来制备 SU 8 母模。将光刻掩膜应用于晶圆，SU 8 经光刻掩膜接受紫外光曝光，从而形成具有 300 微米微通道厚度的母模。将 PDMS 倒在 SU 8 母模上，在 75 摄氏度下固化两小时，得到一个正模，该正模最终将形成每个柱体底部的微通道。

该装置的第三个组件通过在硅片上以500转/分钟的转速旋涂PDMS 10秒，随后以900转/分钟的转速旋涂30秒制备而成，形成厚度为100微米的膜结构脑组织。由于PDMS具有透气性，氧气可直接透过该膜进入微通道。所有组件制备完成后，每个需键合的表面均需进行一分钟的氧气等离子体处理。

使用手持式等离子体设备，首先将六个微通道组件键合到柱阵列上，然后在每个柱上打两个孔，作为气体入口和出口。最后将膜键合至微通道底部，以促进键合并排出任何气泡。使用镊子的钝端将经过等离子体处理的表面压合约一分钟，每次键合后等待一小时，以确保装置完全键合，可进行校准。

当完成整个装置的制备后，需要校准在实际实验中使用氧合插入装置时细胞所接收到的氧气水平。校准过程中可使用荧光氧传感器或Foxy胶片，后者含有可被氧气淬灭的荧光钌染料涂层。Foxy胶片已预先切割成适合放入六孔板底部的尺寸。

应裁剪毛玻璃片，使其尽可能覆盖整个孔板表面。由于毛玻璃片厚度约为一毫米，需对装置进行调整，以保持理想的间距，确保膜的充分扩散。

该距离取决于具体实验，但在大多数情况下，使用手持式等离子体设备时，应低于一毫米，以切割一毫米厚的玻璃显微镜载玻片。将长约六毫米、宽约四毫米的载玻片支柱粘贴至设备底部。设备将放置在载玻片切割后形成的支柱上方。

也可使用玻璃盖玻片形成0.17毫米的扩散间隙，以验证氧气消耗情况。在六孔板的孔中加入3毫升室温去离子水，用于测量氧气。将装置放入孔板中，使用Metamorph软件，在Foxy传感器上选择所需检测位置的数量和位置。

滑动以检测氧气浓度。将气枪软管连接在氧气罐和低氧插入装置之间。使用设定流速为每分钟50至100毫升的精密流量调节器，以精确控制输送气体的流量。

确保精密流量调节阀已关闭。先打开储罐顶部的调节阀，然后打开精密调节阀。15 分钟后，将流速降低至每分钟 10 到 20 之间。

为避免水中产生气泡，在接下来的一个小时内需密切观察流速值，并根据需要进行调整，因为随着系统达到平衡，压力降会发生变化，从而改变流速，以采集微孔板和Foxy传感器的图像。实验使用配备荧光装置的Olympus IX71显微镜、Q Imaging公司的Tiga电荷耦合器件相机、SRV以及Metamorph图像采集软件。该显微镜配备Olympus 3 1 0 2 0滤光片，这是一种与Foxy兼容的荧光滤光片，激发波长为475纳米，发射波长为600纳米。

为了测试该装置的平衡时间及氧合程度，选择荧光氧传感胶片上的三个点来测量氧浓度。在开始通入气体之前，立即拍摄一张胶片图像。在气体流经装置的30分钟内，每隔10秒拍摄一次图像，以检测氧分布的均匀性及氧气输送情况。

在通道宽度范围内以1毫米为间隔建立多个测量点，使用Metamorph软件测量孔表面的氧浓度。导出每个位置的平均图像强度，并绘制氧浓度随荧光强度变化的曲线。通过将线性曲线拟合至0%至10%和10%至21%的氧浓度范围，建立荧光强度与氧浓度之间的校准曲线。对于每个测量位置，原始强度数据可从Metamorph导出，并使用Microsoft Excel或其他统计软件进行进一步分析。

设备校准后，可开始进行实验，例如伤口愈合检测。在实验前24小时内，将已校准的插入件于121摄氏度高压灭菌15分钟，并在层流培养罩中操作，以防止后续污染。将灭菌后的PDMS插入件浸泡于无血清培养基中24小时，以减少插入培养板孔时产生气泡。将MDCK细胞或其他贴壁细胞在六孔板中培养至100%汇合度，使用200 µL移液器吸头在单层细胞上制造直线划痕。这些划痕可模拟贴壁单层细胞中的伤口。

吸去细胞培养基，注意不要破坏单层细胞，用五毫升培养基冲洗。再次吸去液体，并向孔中重新加入三毫升无血清培养基。将装置轻轻插入板中，注意避免产生气泡。

插入装置时倾斜操作有助于从一侧排出气泡。注意避免对装置施加过大压力，以免导致PDMS过度变形而压伤下方的细胞。将培养板和装置置于37摄氏度加热的显微镜载物台上，并将气源罐的管路连接至装置的进气口和出气口。

培养箱应带有可供管路穿过的孔，以便接入管路。将装置放入培养箱后，按照此前所述方法启动气体流动。使用此前描述的设备和成像软件，每20分钟拍摄一次细胞的延时图像，持续15至18小时。可采用划痕伤口测量算法，在设定的实验时长结束后分析未愈合的表面积。实验结束后停止供气，取出培养板，根据需要进行后续细胞处理。如图所示，低氧插入装置在不到两分钟内即可稳定至0.5%氧气浓度。

装置的膜与孔底之间的间隙大小是决定平衡效率的关键因素，较大的间隙需要更长时间才能达到稳定的氧气浓度值。该装置还能对单个孔内的空间氧合实现高度控制，允许形成多种氧浓度条件，甚至可在孔表面产生周期性的氧浓度分布。MDCK细胞单层暴露于10%或21%的氧气环境中，随后使用MATLAB的划痕伤口追踪算法随时间分析伤口的表面积变化。

在总共17小时中的11小时后，当暴露于10%氧气时，原始伤口面积剩余6.87%，而在21%氧气条件下，伤口面积剩余64.4%。如图所示，两种氧气浓度下，氧气浓度与伤口开放面积均呈负相关。在整个实验过程中，我们已向您展示了如何制备、验证并使用低氧插入装置进行划痕伤口愈合实验。该装置相较于其他氧合系统具有多项优势，例如更小的实验室占用空间，以及对细胞表面氧合的空间和时间分布实现更精确的控制。

任何研究氧气或其他气体（如二氧化碳）对体外细胞培养影响的实验室几乎都可以使用该设备。进行此操作时，重要的是将灭菌后的设备和培养基在使用前过夜浸泡，并尽量减少实验过程中气泡的形成。此外，在开始实验前，应让系统达到平衡状态。

这是因为在系统压力达到平衡时，流速会发生变化。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。