Name: 为贴壁细胞培养的氧气插入的制备及操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-06T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学习制备缺氧插入装置以精确控制贴壁细胞培养中的氧气浓度，利用PDMS微流控技术实现时空氧调控。该方法适用于伤口愈合等体外生物学研究。

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该项目由伊利诺伊州公共卫生部门和美国国家科学基金会（DBI-0852416）资助。

1. 设备功能
<ol>
 <li>缺氧插件装置包含6个可嵌入标准6孔板的柱状结构。气体流入柱体，经过柱体底部的微流控网络，再从装置流出。在柱体底部形成微通道底壁的位置，设有一层厚度为100 μm的透气性PDMS膜，允许氧气在气体微通道与培养基之间扩散。因此，该装置通过建立浓度梯度，使培养基中的氧浓度趋向于设定值。</li>
 <li>与传统的缺氧培养箱及其他细胞供氧系统相比，该装置具有多项优势：1）缩短氧气扩散路径，实现更快的时间控制；2）根据柱体微通道的设计，增强氧合的空间控制能力；3）占用实验空间更小，通量更高，可提高实验效率；4）可适配常规细胞培养工具（如多孔板），无需特殊操作知识或专用设备。</li>
</ol>
2. 器件制备
<ol>
 <li>首先，使用先前加工好的Delran模具，通过PDMS复制模塑法制备柱阵列。</li>
 <li>接着，采用标准的SU-8光刻技术和PDMS复制模塑法，在每根柱子的底部加工出气体微通道。</li>
 <li>通过在硅片上精确控制PDMS的旋涂工艺来制备透气膜，以获得所需的厚度。在本示例中，我们使用厚度为100 μm的膜，其制备条件为：先以500 rpm旋涂10秒，再以900 rpm旋涂30秒。</li>
 <li>所有组件在经过手持式等离子体设备（型号BD-20，Electro-Technic Products）进行氧气等离子体处理后，键合在一起。</li>
</ol>
3. 设备设置
<ol>
 <li>将装置轻轻插入培养板中，注意避免产生气泡。插入时倾斜装置有助于将气泡从一侧排出。对于实际的基于细胞的实验，此步骤必须在无菌超净工作台内进行。一旦装置插入到位，污染风险将显著降低，因此可在非无菌环境中将组装好的装置转移至培养箱。</li>
 <li>将气源钢瓶的管路连接至装置的进气口和出气口。对于基于细胞的实验，培养箱应设有允许管路穿过的孔洞，需在将装置转移并放置入培养箱后再连接管路。注意避免对装置施加过大的压力，否则可能导致PDMS变形，进而压碎下方的细胞。</li>
 <li>在打开钢瓶顶部调节阀之前，确保精密流量调节阀处于关闭状态，以防止气体过量流入装置。启动气体流动，缓慢打开精密流量调节阀至所需流速（50–100 mL/min）。在接下来的一小时内密切观察流量数值，并根据需要进行调整，因为随着系统趋于平衡，压力降会发生变化，从而影响流速。为避免培养基中产生气泡，在以较高流速平衡15分钟后，应将流速降低至10–20 mL/min。</li>
 <li>在达到预期实验时长后，停止供气，取出培养板，并根据需要对细胞进行处理（如裂解、染色、计数等）。</li>
</ol>
4. 设备验证
<ol>
 <li>校准
 <ol>
 <li>选择荧光氧检测中的位置数量和位置 
 (FOXY) 传感器载玻片（根据验证需求而定），用于氧气测量。该载玻片含有荧光钌染料涂层，其荧光可被氧气淬灭。</li>
 <li>将载玻片直接暴露于气体罐提供的0%、10%和21%氧气环境中，平衡5分钟后采集图像。</li>
 <li>导出每个位置的平均图像强度，并绘制氧合浓度随荧光强度变化的曲线。</li>
 <li>通过将线性曲线拟合至0-10%线和10-21%线，生成校准曲线。</li>
</ol>
 </li>
 <li>异质性
 <ol>
 <li>在通道宽度范围内以设定的间隔（例如每1 mm）建立多个点。注意，根据间距的不同，图像可能会有重叠。</li>
 <li>通过该设备测量孔板表面的氧气浓度</li>
 </ol>
 </li>
 <li>平衡
 <ol>
 <li>在FOXY载玻片上选择三个点来测量氧浓度。</li>
 <li>在环境氧浓度下捕获第一张图像后，立即打开精密流量调节器，使气体开始流入装置。以适当的时间间隔采集图像，以评估氧浓度平衡所需的时间和程度（例如，每10秒一次，持续30分钟）。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. 应用
<ol>
 <li>伤口愈合
 <ol>
 <li>实验前一天，将灭菌的PDMS插入物浸泡在无血清培养基中，以减少孔内气泡的形成。</li>
 <li>在6孔板中将细胞培养至100%融合度。</li>
 <li>使用p200移液枪头在单层细胞上制造直线划痕，以模拟伤口。</li>
 <li>吸除细胞培养基，用5 mL培养基冲洗一次，再吸除。注意不要扰动细胞单层。</li>
 <li>向各孔中重新加入4 mL无血清培养基，以减少细胞增殖。</li>
 <li>将插入物放入孔中，并将每个孔连接至相应的氧浓度环境。</li>
 <li>将带有插入物的6孔板置于37°C加热载台上。</li>
 <li>以设定的时间间隔和总时长拍摄细胞的延时图像。可使用MATLAB的T_Scratch（一种伤口测量算法）分析未愈合的表面积。</li>
 </ol>
</li>
</ol>
6. 代表性结果
<ol>
 <li>装置验证 
与缺氧培养箱相比，该缺氧插入装置在氧气平衡时间和平衡程度方面均有显著改进，可在不到2分钟内稳定至0.5%氧气浓度。装置中膜与孔底之间的间隙尺寸是决定平衡效率的关键因素，较大的间隙尺寸需要更长时间才能达到稳态氧气浓度值。该装置还可在单个孔内实现对空间氧合状态的精确控制，允许形成多种氧浓度条件，甚至可在孔表面产生周期性氧浓度分布。</li>
 <li>伤口愈合 
将细胞单层暴露于10%或21%氧气环境中，并随时间分析伤口表面面积的变化。在21%氧气中划痕闭合最慢，而在10%氧气中闭合最快。图1显示了划痕在17小时内的图像变化。图5中的图表展示了实验期间两种氧浓度条件下开放伤口面积的百分比变化。</li>
</ol>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="微流控细胞培养示意图，用于氧气微通道研究的PDMS装置，包含柱状结构设计。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"></a> 
图1. 展示装置特征的示意图与结构图。该氧气插入装置通过常规光刻技术（微流控网络）、复制模塑（微流控网络与插入支架）以及定义转速的PDMS旋涂法（透气膜）制备而成。A) 氧气装置嵌入6孔板中的示意图。B) 24孔和96孔柱状阵列的示例。C) 柱状结构的横截面示意图。氧气通过入口进入装置，并流经柱底的微流控网络，随后可自由穿过柱底的透气性PDMS膜并溶解至培养基中。D) 从上方拍摄的单通道柱状结构显微镜图像，显示其多种结构特征，包含用于平衡研究的键合玻璃柱。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="随时间与位置变化的氧气浓度图；实验性气体交换，低氧条件。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"></a> 
图2. 使用氧气传感器对装置进行验证。利用平面型钌基氧气传感器测定各孔内的氧张力。所有氧气混合气体均含有平衡氮气及5% CO2，以维持培养基的缓冲环境。A) 图示说明支撑柱高度（即膜与细胞之间的氧气扩散距离）对平衡时间及效果的影响。不同高度通过固定在装置底部的切割玻璃柱实现。三种柱高的设置均使其平衡时间显著优于低氧培养箱。注意，时间轴为对数刻度。B) 图示0.2 mm间隙装置的快速氧气平衡响应时间。C) 还在微通道下方的孔内进行多点线扫描，以确保装置引入的氧气浓度具有空间均一性。图中显示在分别灌注0%、10%和21%氧气10分钟后测得的氧气浓度。D) 该装置可在5天内有效维持10%的氧气浓度。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="氧气浓度图；位置与浓度关系；实验性正弦模式分析。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"></a> 
图3. 更复杂氧气微通道设计的实验。A）双条件微通道装置在14天内产生稳定的0%和21%氧气分布。B）跨越支柱的500 μm宽互指状蜿蜒微通道形成周期性氧气分布。需注意，由于微通道对准困难，数据仅展示一次代表性试验结果。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="晶体衍射图；X射线图谱分析；晶格结构研究。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"></a> 
图4. 初始划痕后0、7和17小时的伤口闭合延时图像。实验全程细胞培养环境维持21%氧气浓度。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="伤口面积减少曲线图；10% 和 21% 浓度在 20 小时内的时间与百分比关系。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"></a> 
图 5. 划痕实验中氧浓度对伤口愈合速率的影响。

该装置采用标准的SU-8光刻、复制模塑以及定义旋转工艺制备，完全由聚二甲基硅氧烷构成。通过向装置中引入气体，在柱状微通道与培养基之间建立浓度梯度，从而驱动系统达到目标平衡氧浓度。研究表明，该装置能够有效调控孔内氧合的时间和空间分布，并相应调节细胞行为。氧合的空间模式由柱体底部的微通道定义，因此在制作光掩模时可实现多种设计。此外，将目标气体注入孔的气相部分，有望缩短平衡时间并增强缺氧程度。可通过在装置上集成微流控混合网络，利用少量储备气罐生成新型气体混合物。最后，引入培养基更换机制将消除从多孔板中取出装置的需要，避免因操作对细胞造成影响。
该设备可应用于任何需要控制氧气浓度的体外（in vitro）或离体（ex vivo）实验。由于氧气是影响绝大多数信号通路的重要生理变量，因此受益的研究领域仅受限于研究者的创造力。其中一些可受益于增强的氧气浓度时间控制的领域包括癌症转移、睡眠呼吸暂停以及心肌缺血再灌注损伤等。例如，间歇性低氧已被证实与更具侵袭性的癌症相关，相较于持续性低氧和常氧条件，其可上调多种与转移相关的基因。空间控制同样重要，因为氧浓度梯度在发育过程、肝脏分区、药物毒性以及干细胞微环境等过程中均起着关键作用。本文所介绍的设备将通过提供一种占用实验室空间更小、操作相对简便、且对细胞氧暴露条件具有更精确控制的系统，从而推动多个研究领域的发展。

<table><tbody><tr><td>PDMS-Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>平面FOXY传感器</td><td>Ocean Optics</td><td>FOXY-SGS-M</td><td>带涂层的显微镜载玻片</td></tr><tr><td>气体调节器</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>FL-1472-G</td><td></td></tr><tr><td>气体</td><td>Airgas</td><td>定制混合气</td><td>均含5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>SU-8 2150</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的MDCK生长培养基</td><td>SAFC Global</td><td>M3803</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr></tbody></table>

贴壁细胞培养用氧气插入装置的制备与操作

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

氧气是多种细胞通路的关键调节因子，但目前允许in vitro氧气调控无法满足生物医学研究的需求。低氧培养舱为标准培养容器中的氧浓度控制提供了一种简单系统，但其无法对细胞表面的氧气浓度实现精确的时间和空间控制，因而限制了其在多种生理现象研究中的应用。其他系统虽在低氧培养舱的基础上有所改进，但操作需要专业知识和专用设备，使普通研究人员难以掌握。目前已开发出一种用于多孔板的微加工插入装置，可更有效地控制氧气浓度的时间和空间分布，从而更真实地模拟生理条件下存在的各种现象in vivo. 该平台由一个嵌入标准多孔板的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）插入件组成，作为被动式微流控气体网络，其带有透气膜，旨在调节向贴壁细胞输送的氧气。该装置使用简便，可连接提供压力的气体钢瓶，将所需浓度的氧气引入平台。制造过程结合了标准的SU-8光刻、复制 molding 以及在硅片上进行的可控PDMS旋涂。装置各组件经手持式等离子体系统进行表面处理后完成键合。验证通过平面荧光氧传感器实现。平衡时间在数分钟量级，可根据装置设计实现多种多样的氧浓度分布，例如本研究中实现的周期性分布，甚至可形成模拟体内存在的氧梯度in vivo. 该装置可通过常规方法进行灭菌以用于细胞培养，且不会丧失功能。该装置适用于研究in vitro将演示伤口愈合反应。

开发并验证一种附加式平台，该平台可对6孔板中的氧气空间和时间分布实现更精确的控制。该装置可适配多种培养系统，并可用于研究氧气对伤口愈合的影响。

氧气是多种细胞通路的关键调节因子，但目前允许体外氧浓度调节的装置尚无法满足生物医学研究的需要……

低氧插入装置具有六个支柱，可嵌入六孔板的孔中。气体流经支柱底部的微流控网络，并可通过气体可渗透的PDMS膜扩散，该膜将气体通道与培养基分隔开。该装置最大限度地缩短了氧气源（即支柱底部的微流控网络）与细胞之间的扩散路径长度，从而实现更快的氧浓度平衡。该装置还能更精确地控制暴露于细胞的氧气空间分布模式，这种模式由采用标准光刻技术结合光掩模制作的微流控气体网络设计决定。大家好，我是来自伊利诺伊大学芝加哥分校生物工程系David Edington博士实验室的Sean Ard。大家好，我也是来自Edington实验室的Ellie。今天，我们将向您展示如何制备、验证并使用一种定制装置，以在六孔板中对体外细胞培养物施加不同的氧浓度。我们在实验室中已采用该方法研究氧气对伤口愈合、活性氧生成及细胞迁移的影响。现在，让我们开始吧。开始制备氧合插入装置时，按照预聚物与固化剂10:1的比例配制聚甲基硅氧烷或PDMS。根据制造商说明，将PDMS混合物加入先前加工好的Dell ran模具中，该模具的图案设计用于模拟标准六孔培养板的形状。在75摄氏度下固化过夜后，所得的复制模制柱阵列将构成氧合插入装置三个组件中的第一个组件，以用于制备氧合插入装置的第二个关键组件。通过首先在硅晶圆上旋涂 SU 8 21 50 来制备 SU 8 模板。在晶圆上应用光刻掩模，然后通过光刻掩模对 SU 8 进行紫外光曝光，从而形成具有 300 微米微通道厚度的母模。将 PDMS 倒在 SU 8 模板上，在 75 摄氏度下固化两小时，得到一个正向模具，该模具最终将形成每个柱体底部的微通道。该装置的第三个组件通过在硅片上旋涂PDMS制备而成：先以500 RPM转速旋转10秒，再以900 RPM转速旋转30秒，形成厚度为100微米的膜结构。由于PDMS具有透气性，氧气可直接透过该膜进入微通道。所有组件制备完成后，各键合表面均需进行一分钟的氧气等离子体处理。使用手持式等离子体设备，首先将六个微通道组件键合到柱阵列上，然后在每个柱上打两个孔，作为气体入口和出口。最后将膜键合至微通道底部，以促进键合并排出任何气泡。使用镊子的扁平端将经过等离子体处理的表面压合约一分钟，每次键合之间等待一小时，以确保装置完全键合，可进行校准。当完成整个装置的制备后，需要校准在实际实验中使用氧合插入装置时细胞所接收到的氧气水平。校准过程中可使用荧光氧传感器或Foxy玻片，后者含有可被氧气淬灭的荧光钌染料涂层。Foxy玻片已预先切割成适合放入六孔板底部的尺寸。应裁剪foxy载玻片，使其尽可能覆盖整个孔板表面。由于foxy载玻片厚度约为1毫米，需对装置进行调整，以维持适当的膜间距，确保充分的扩散。该距离取决于具体实验，但在大多数情况下，使用手持式等离子体设备粘合厚度为一毫米的玻璃显微镜载玻片时，应小于一毫米。将长约六毫米、宽约四毫米的载玻片条粘贴至设备底部。设备将放置在载玻片条上方的切口处。也可使用玻璃盖玻片形成0.17毫米的扩散间隙，以验证氧气消耗情况。在六孔板的孔中加入3毫升室温去离子水，用于测量氧气。将装置放入板中，并使用Metamorph软件，在Foxy传感器上选择所需位置的数量和位置。滑动以检测氧气浓度。将气枪软管连接在氧气罐和低氧插入装置之间。使用设定流速为每分钟50至100毫升的精密流量调节器，以精确控制输送气体的流量。确保精密流量调节阀已关闭。先打开气罐顶部的调节阀，再打开精密调节阀。15分钟后，将流速降低至每分钟10到20个单位之间。为避免水中产生气泡，在接下来的一个小时内需密切观察流速值，并根据需要进行调整，因为随着系统达到平衡，压力降会发生变化，从而改变流速，以采集微孔板和Foxy传感器的图像。实验使用配备荧光装置的Olympus IX71显微镜、Q Imaging公司的Tiga电荷耦合器件相机、SRV以及Metamorph图像采集软件。该显微镜配备Olympus 3 1 0 2 0滤光片组，这是一种适用于Foxy传感器的荧光滤光片，其激发波长为475纳米，发射波长为600纳米。为了测试该装置的平衡时间及氧合程度，选择荧光氧传感胶片上的三个点来测量氧浓度。在开始通入气体之前，立即拍摄胶片图像。在气体流经装置的30分钟内，每隔10秒拍摄一次图像，以检测氧分布的均匀性及氧气输送情况。在通道宽度范围内以一毫米为间隔建立多个测量点，使用MetaMorph软件测量孔表面的氧浓度。导出每个位置的平均图像强度，并将氧浓度作为荧光强度的函数进行绘图。通过将线性曲线拟合至0%至10%和10%至21%的氧浓度范围，建立荧光强度与氧浓度之间的校准曲线。对于每个测量位置，原始强度数据可从MetaMorph导出，并使用Microsoft Excel或其他统计软件进一步分析。设备校准后，可开始进行实验，例如伤口愈合实验。在实验前24小时内，将校准后的插入物于121摄氏度下高压灭菌15分钟，并在超净台中操作，以防止后续污染。将灭菌后的PDMS插入物浸泡于无血清培养基中24小时，以防止插入培养板孔时产生气泡。在六孔板中将MDCK细胞或其他贴壁细胞培养至100%汇合度，使用P200移液器枪头在单层细胞上制造直线划痕。这些划痕可模拟贴壁单层细胞中的伤口。吸出细胞培养基，注意不要破坏单层细胞，用五毫升培养基冲洗。再次吸出培养基，向孔中重新加入三毫升无血清培养基。轻轻将装置插入培养板中，注意避免产生气泡。插入装置时倾斜角度有助于将气泡从一侧排出。注意避免对装置施加过大压力，以免导致PDMS过度变形，从而压碎下方的细胞。将培养板和装置置于37摄氏度加热的显微镜载物台上，并将气源罐的管路连接至装置的进气口和出气口。培养箱应带有可供管路穿过的孔，以便接入管路。将装置放入培养箱后，按照此前所述方法启动气体流动。使用此前描述的设备和成像软件，每隔20分钟拍摄一次细胞的延时图像，持续15至18小时。可采用T型划痕伤口测量算法，在设定的实验时长结束后分析未愈合的表面积。实验结束后停止供气，取出培养板，并根据需要进行后续的细胞处理。如图所示，该低氧插入装置在不到两分钟内即可稳定至0.5%氧气浓度。装置中膜与孔底之间的间隙大小是决定平衡效率的关键因素，较大的间隙需要更长时间才能达到稳定的氧气浓度值。该装置还能对单个孔内的空间氧浓度进行高度控制，可在同一孔内形成多种氧浓度条件，甚至在孔表面产生周期性的氧浓度分布。MDCK细胞单层暴露于10%或21%的氧气环境中，随后使用MATLAB的划痕伤口追踪算法随时间分析伤口表面面积的变化。在总共17小时中的11小时后，当暴露于10%氧气时，原始伤口剩余6.87%，而在21%氧气条件下，伤口剩余64.4%。如图所示，对于这两种氧气浓度，氧浓度与伤口开放面积呈负相关。在整个实验过程中，我们已向您展示了如何制备、验证并使用缺氧插入装置进行划痕伤口愈合实验。该装置相较于其他氧合系统具有多项优势，例如更小的实验室占用空间，以及对细胞表面氧合的空间和时间控制能力显著增强。几乎所有研究氧气或其他气体（如二氧化碳）对体外细胞培养影响的实验室都可以使用该设备。进行此操作时，重要的是将灭菌后的设备和培养基浸泡过夜，尽量减少实验过程中气泡的形成。此外，在开始实验前，应让系统达到平衡状态。这是因为在系统压力达到平衡时，流速会发生变化。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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