可视化的RNA中的本地化爪蟾卵母细胞
January 14th, 2010
可视化在体内 RNA的运输是通过微量注射荧光标记的RNA转录成爪蟾卵母细胞，共聚焦显微镜。
在此过程中，荧光标记的 RNA。将转录本注射到 XUS Cytes 中并监测其定位。首先，用荧光核苷酸标记 RNA。
在体外转录反应中，然后将 RNA 加载到显微注射装置中。将卵母细胞放在注射皿上并小心地进行显微注射。最后，培养卵母细胞以允许在共聚焦显微镜上成像之前进行 RNA 定位。
大家好，我是来自布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系 Kimberly Mallory 博士实验室的 James Gagnan。今天，我们将向您展示一种在 Xap 卵母细胞中可视化亚细胞 RNA 定位的程序。我们在实验室中使用该程序来研究早期脊椎动物发育过程中 RNA 定位所需的 RNA 结构和蛋白质因子。
那么让我们开始吧。要开始此过程，请转录 mRNA，其放射性和荧光标记均如随附的书面方案中所述。添加 DS 以降解模板 DNA，然后通过添加 EDTA 终止反应。
通过 G 50 色谱柱旋转去除未掺入的核苷酸和其他小分子。然后通过乙醇沉淀浓缩 RNA，洗涤并重悬。通过闪烁计数确定浓度后，将 RNA 稀释至 50 纳摩尔，并在零下 80 摄氏度下储存在 5 微升等分试样中。
准备进行显微注射时，将标记 RNA 的 Eloqua 在 70 摄氏度下变性 5 分钟。然后在室温下在微量离心机中以最大速度旋转 10 分钟，以去除颗粒并保持在冰上。接下来，将 xap 后卵巢的细胞修剪块分离成一个 50 毫升的锥形两个，每毫升含有 25 毫升 3 毫克。
胶原酶溶于 pH 值为 7.4 的 0.1 摩尔磷酸钾缓冲液中。由于批次间的变化，请在 18 摄氏度下轻轻摇晃。胶原酶治疗时间可能会有所不同，应通过目视检查仔细监测。
为确保落叶继续摇晃 15 分钟或直到卵母细胞与卵巢明显分离，让卵母细胞沉降到锥形管的底部。取出溶液并替换为 MBSH 缓冲液。重复此作，再洗涤两次，总共洗涤 3 次。
接下来，在标准光学显微镜下手动分选第三至第四阶段的 CYTES 和 MBSH 缓冲液。第三阶段的细胞是完全不透明的，但为白色。而第四阶段的细胞略大并带有色素斑点。
略微透明的细胞太年轻，完全着色或表现出极化色素分布的细胞太老。最后，使用 3.5 英寸的毛细管拉动和斜切准备用于显微注射的针头，以制作外径约为 0.05 毫米的针头。现在 mRNA 卵母细胞和针头已准备就绪，请继续进行显微注射。
首先用 desy 水校准针头，每次注射提供 2 纳米。前面。使用气控微量注射器装入针头，并在校准后使用千分尺校准液滴大小，将要注射的 RNA 前置装入针头。接下来，将分选的卵母细胞放在注射皿上在 MBSH 缓冲液中，培养皿包含一层黑色泡沫橡胶。
白色细胞在黑色背景下非常突出。然后小心地向每个卵母细胞注射 2 升 50 纳摩尔的 RNA。确保每个卵母细胞只注射一次，并在注射完成后定期检查针头是否堵塞。
排出剩余的 RNA，用 desy 水冲洗针头，然后加载下一个 RNA 进行注射。注射后，将注射的细胞转移到无菌 24 孔板的孔中，最多 1000 孔。CYTES 可以按孔培养。
去除缓冲液，用每孔 400 μL 的细胞培养基替换。然后将培养板放入带有湿纸巾的塑料容器中，以在培养过程中保持潮湿环境，在 18 摄氏度下孵育卵母细胞，所需孵育期后 8 至 48 小时不等。注射的卵母细胞孵育后，可以准备卵母细胞进行显微镜检查。
分拣出所有死亡的卵母细胞，并将存活的卵母细胞放入玻璃瓶中。常规观察大于 90% 的卵母细胞的存活率。用 M-E-M-F-A 固定剂更换缓冲液，并摇动细胞 20 分钟。
固定期完成后，在固定期间保护卵母细胞免受阳光照射。通过去除固定剂并用等体积的 MBSH 缓冲液替换来洗涤卵母细胞。再次重复此洗涤，总共洗涤两次。
接下来，将卵母细胞洗涤到无水甲醇中。首先，取出一半的体积并用甲醇替换。再重复两次。
洗涤后，除去所有溶液并用甲醇替换。再重复一次甲醇洗涤。固定和脱水的卵母细胞可以储存在零下 20 摄氏度，直到准备好成像。
成像前，将 Marie 的透明介质添加到玻璃底 WPI 荧光皿中以覆盖成像表面。小心地将卵母细胞从甲醇转移到荧光皿中，尽量减少甲醇转移的体积，在倒置共聚焦显微镜上对卵母细胞进行成像，蔡司 LSM 5 10 和 aica TCSs P 均给出良好的结果。现在，我们将展示一些亚细胞 RNA 定位的代表性图像，显微注射后立即在细胞核中可以看到荧光 RNA，在荧光标记的对照培养 8 小时后。
可以看到 RNA 均匀分布在卵母细胞的细胞质中。然而，在亚细胞定位到卵母细胞的植物极的过程中，可以看到含有募集运输机制的序列的荧光标记的 RNA。我们刚刚向您展示了如何将荧光标记的 RNA 显微注射到 zap 细胞中，并通过共聚焦显微镜观察 RNA 定位。
执行此程序时，请务必使用 deci 处理的溶液，以避免 RNA 污染培养物、含有抗生素的 OCM 中的细胞，并尽可能保护细胞免受阳光照射以避免光漂白。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文描述了使用荧光标记的RNA转录本注射到非洲爪蟾卵母细胞中，对体内RNA运输的可视化。RNA的定位通过共聚焦显微镜进行监测。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- RNA生物学
背景
- RNA运输对于各种细胞过程至关重要。
- 非洲爪蟾卵母细胞作为研究RNA动力学的模型系统。
- 荧光标记允许实时可视化RNA。
- 共聚焦显微镜提供高分辨率成像能力。
研究目的
- 可视化活细胞中的RNA运输。
- 理解RNA定位的机制。
- 利用可靠的方法研究卵母细胞中的RNA动力学。
使用的方法
- 使用核苷酸对RNA转录本进行荧光标记。
- 将RNA微注射到非洲爪蟾卵母细胞中。
- 培养卵母细胞以允许RNA定位。
- 使用共聚焦显微镜进行成像以监测RNA运输。
主要结果
- 成功可视化卵母细胞中的RNA运输。
- 展示荧光标记的有效性。
- 对RNA定位模式的见解。
- 验证共聚焦显微镜作为RNA研究工具。
结论
- 该方法提供了一种研究RNA动力学的强大方法。
- 研究结果有助于理解RNA运输机制。
- 未来的研究可以在这种方法的基础上进行进一步的洞察。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualization of RNA localization in Xenopus oocytes enables direct interrogation of RNA transport mechanisms, supporting early discovery and target validation in cell polarity and developmental biology. This imaging-based approach provides predictive confidence for functional studies of cis- and trans-acting elements, informing risk-adjusted decisions in preclinical model development. The method's quantitative and reproducible outputs facilitate portfolio triage and mechanistic de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of RNA localization to clarify transport pathways and molecular determinants.
- Supports functional validation of sequence elements and protein factors involved in RNA trafficking.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing specific versus nonspecific localization events.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of RNA-protein interactions relevant to cell polarity.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated imaging assay for quantifying RNA localization patterns in live cells.
- Supports standardization and reproducibility through controlled microinjection and imaging protocols.
- Enables scalability for screening the effects of candidate molecules or genetic perturbations on RNA transport.
- Delivers quantitative readouts suitable for comparative analysis across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling RNA localization defects implicated in developmental disorders.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling mechanistic studies in a vertebrate model.
- Supports risk-adjusted advancement by linking molecular mechanisms to phenotypic outcomes in oocytes.
- Offers predictive value for translational biomarker identification based on RNA localization dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic validation, and quantitative analysis of RNA localization in a model system.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct visualization of RNA transport.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for evaluating the impact of molecular interventions on RNA localization.
- Analytics: Delivers quantitative imaging outputs for robust statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant phenotypes in early vertebrate development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse RNA localization events and regulatory factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA localization studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of imaging-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA-targeted programs based on validated mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, confocal imaging, and RNA handling.
- Demands access to fluorescence labeling reagents and high-resolution microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection and imaging protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different RNA species or model systems based on sequence and transport machinery.
- Practical limitations include RNA stability, photo-bleaching, and throughput constraints inherent to manual microinjection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:30
Introduction
1:03
Preparing for Microinjection
3:14
Microinjection and Oocyte Culture
4:35
Fixation, Dehydration, and Storage of Oocytes
5:35
Imaging RNA Localization by Confocal Microscopy
5:59
RNA Localization in Xenopus Oocytes: Representative Results
6:28
Conclusion
