Name: 可视化的RNA中的本地化爪蟾卵母细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习利用荧光标记和共聚焦显微镜技术在非洲爪蟾卵母细胞中可视化RNA转运的方法。该技术可实时追踪RNA亚细胞定位动态，为研究RNA运输机制与基因表达调控提供可靠手段。

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我们关于RNA定位的研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（R01GM071049）对KLM的资助。

第1部分：荧光标记mRNA的转录。
<ol>
 <li>将含有RNA定位元件或其他相关序列的质粒DNA线性化，并重悬于 1 μg/μl 使用经DEPC处理的H2O. DNA 模板必须含有上游的 T7、SP6 或 T3 RNA 聚合酶启动子位点，以启动转录。</li>
 <li>向无菌的 1.5 mL 离心管中加入以下试剂：
 <table>
 <tbody>
 <tr><td>a. 10X Tx 缓冲液（见 M&amp;M)</td><td>2 μl</td></tr>
 <tr><td>b. 20倍浓度帽/核苷三磷酸混合液（参见M&amp;M)</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP（Invitrogen）</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>d. UTP，[α-32P](1 μCi/μl（Perkin Elmer）</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>e. DEPC-H2O</td><td>11 μl</td></tr>
 <tr><td>f. 0.2 M DTT</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>g. RNasin（Promega）</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>线性模板DNA</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>i. RNA聚合酶（Promega）</td><td>1 μl</td></tr>
 </tbody>
 </table>
 </li> 
 <li>轻柔混匀试剂，并短暂离心（微型离心机中离心10秒）。</li>
 <li>孵育2-4小时，温度为 37° C用铝箔覆盖试管，以防止荧光染料发生光漂白。</li>
 <li>添加 1 μl 1 mg/ml 无RNase的DNase（Promega），用于降解模板DNA。</li>
 <li>37 °C孵育15分钟 37° C.</li>
 <li>添加 79 μl 20 mM EDTA（pH 8.0）终止反应。</li>
 <li>移除 1 μl 转移到另一支已标记为“input”的离心管中并保存。</li>
 <li>通过1 ml G50柱离心反应物（参见材料） &amp; 方法），可保留未掺入的核苷酸，同时去除全长 mRNA。</li>
 <li>通过乙醇沉淀法浓缩RNA：
 <ol class="lalpha">
 <li>添加 250 μl 100% 乙醇 10 μl 7M CH3COONH4, 1 μl 载体RNA（酵母tRNA， 10 μg/μl）或 1 μl 糖原（20 mg/ml）</li>
 <li>充分混匀后，在 -80° C 用于 &gt;30 分钟，或置于干冰中 15 分钟。 </li>
 <li>在微量离心机中以最大速度离心15分钟，倾去上清液。</li>
 <li>用……洗涤 150 μl 75% 乙醇</li>
 <li>在微量离心机中以最大速度离心3分钟，弃去上清液。</li>
 <li>干燥沉淀物 37° C 3 分钟，确保所有乙醇完全挥发。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>重悬于 11 μl DEPC-H2O 并移除 1 μl 转移到另一支标记为“incorporated”的离心管中。</li>
 <li>确定掺入率，并将RNA稀释至50 nM（参见材料） &amp; 计算方法）。 </li>
 <li>RNA 应在 5 μl 分装成单次使用量，以避免冻融循环，并可在 -20 °C 下保存数周80° C.</li>
</ol>
第2部分：显微注射的准备工作。
<ol>
 <li>RNA 制备： 解冻一份 RNA 样品（50 nM），在 70°C 下变性 3–5 分钟。在室温下使用微型离心机以最大转速离心 10 分钟，以去除任何不溶物，并将样品置于冰上保存。</li>
 <li>卵母细胞制备：
 <ol class="lalpha">
 <li>从 Xenopus laevis 雌性个体（Nasco）中手术取出卵巢。</li>
 <li>将 Xenopus laevis 卵巢组织剪碎后放入含有 25 ml 胶原酶溶液的 50 ml 锥形管中（见材料与方法）。</li>
 <li>在 18°C 下轻轻振荡 15 分钟，或直至卵母细胞明显从卵巢组织中分离。由于不同批次胶原酶活性存在差异，消化时间可能有所不同，应通过肉眼观察密切监测，以确保充分去滤泡。</li>
 <li>让卵母细胞在管中自然沉降，吸除上清液，并用 MBSH 缓冲液洗涤卵母细胞（见材料与方法）。</li>
 <li>重复洗涤两次，共洗涤三次。该卵母细胞分离方案与 Cohen 等人（2009）所述方法类似。</li>
 <li>在体视显微镜下，于 MBSH 缓冲液中手动挑选 III 期/IV 期卵母细胞（Dumont, 1972）。III 期卵母细胞完全不透明且呈白色，而 IV 期卵母细胞略大，表面有色素斑点。略微透明的卵母细胞发育过早，而完全着色或色素呈极性分布的卵母细胞则过于成熟。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>注射针制备： 将玻璃毛细管拉制并打磨成外径约 0.05 mm 的注射针。（我们使用 Drummond Scientific 3.5 英寸毛细管（货号 # 3-000-203-G/X）、Sutter Instrument Co. 的微量移液器拉制仪和 WPI Inc. 的磨针仪。）</li>
</ol>
第3部分：显微注射
<ol>
 <li>使用DEPC-H2O校准针头，确保每次注射量为2 nl。我们使用气体驱动的显微注射仪（见材料与方法）对针头进行前部加样，并利用千分尺校准液滴大小。</li>
 <li>将RNA装入针头中。</li>
 <li>将分选好的卵母细胞放入含有MBSH缓冲液的注射皿中。我们通常在铺有一层黑色泡沫橡胶的培养皿中进行显微注射，浅色的卵母细胞在白色背景下清晰可见。</li>
 <li>小心地向每个卵母细胞注射2 nl、50 nM的RNA。</li>
 <li>排出残留RNA，用DEPC-H2O冲洗针头，然后加载下一个待注射的RNA样品。</li>
</ol>
第4部分：卵母细胞培养
<ol>
 <li>将卵母细胞置于无菌24孔板（Sigma Aldrich）的一个孔中。每个孔最多可培养一千个卵母细胞。</li>
 <li>吸除缓冲液，每孔加入400 μl Oocyte Culture Medium（OCM；见材料与方法）。将培养板放入密闭的塑料容器中，并在容器内放置湿润的纸巾以维持培养期间的湿润环境。</li>
 <li>在18°C下孵育卵母细胞，孵育时间范围为8至48小时。</li>
</ol>
第5部分：卵母细胞的固定、脱水与保存
<ol>
 <li>挑出任何已死亡的卵母细胞，并将存活的卵母细胞置于玻璃小瓶中。我们常规观察 &gt;90% 存活率 </li>
 <li>将卵母细胞置于 MEMFA 固定液中（参见材料） &amp; 方法）并在岩石上孵育20分钟。用铝箔覆盖以避光保护卵母细胞。</li>
 <li>用等体积的 MBSH 缓冲液去除固定剂，洗涤卵母细胞。重复此洗涤步骤一次，共洗涤两次。</li>
 <li>将卵母细胞洗涤至无水甲醇中：
 <ol class="lalpha">
 <li>移除一半体积，用甲醇补足。</li>
 <li>重复步骤“a”两次。</li>
 <li>移除所有溶液，更换为甲醇。</li>
 <li>重复甲醇洗涤。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>卵母细胞可在 -20° C 直到准备成像时为止。</li>
</ol>
第6部分：通过共聚焦显微镜成像RNA定位
<ol>
 <li>成像前，向玻璃底FluoroDish（WPI Inc.）中加入Murray透明介质（2:1的苯甲酸苄酯-苯甲醇），以覆盖成像表面。</li>
 <li>小心将卵母细胞从甲醇转移至FluoroDish中，尽量减少所带入的甲醇体积。</li>
 <li>在倒置共聚焦显微镜上进行成像（我们已成功使用Zeiss LSM510和Leica TCS SP2）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="显示红细胞膜结构变异和荧光强度的显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：通过显微注射荧光标记转录本实现亚细胞RNA定位的可视化。A. 显微注射后，用Alexa Fluor 546标记的RNA最初局限于细胞核内。B. 培养8小时后，可见荧光标记的对照RNA均匀分布于卵母细胞的细胞质中。C. 然而，含有可招募转运机制序列的荧光标记RNA可见正在向卵母细胞的植物极（下方）进行亚细胞定位。比例尺 = 50 μm。

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

使用实验动物的实验均依照布朗大学制定的指南和规定进行。

本文介绍了一种用于可视化mRNA定位的实验方案 非洲爪蟾 卵母细胞。该方法使用荧光标记的RNA转录本，相较于以往使用的地高辛标记转录本具有更高的信噪比，且比基于原位杂交的方法更简便、快速（Mowry and Melton, 1992; Gautreau et al., 1997）。利用该方法，我们可设计RNA序列突变并快速检测其影响。 体内 功能。此外，通过使用其他Alexa-UTP荧光染料，可在同一个卵母细胞中同时观察多种RNA分子。我们发现，在 非洲爪蟾 卵母细胞中，Alexa Fluor 546-14-UTP 的效果优于 Alexa Fluor 488-5-UTP，原因是 488 nm 波长范围内存在自发荧光；然而，仍可实现两种 RNA 的双色成像（Gagnon and Mowry, 2009）。此外，该技术可与免疫染色方案联合使用，以检测蛋白质的共定位，因为已有多种兼容的荧光二抗可供选择（Yoon and Mowry, 2006, Messitt et al., 2008）。最后，通过过表达显性负性因子或小分子干扰破坏 RNA 定位过程，可与该检测方法结合，用于观察 mRNA...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;10X Tx 缓冲液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;60 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;400 mM Tris-HCl (pH 7.5)&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;20 mM 亚精胺-HCl&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;20x 帽/NTP 混合液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;10 mM CTP&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;10 mM ATP&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;9 mM UTP&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;2 mM GTP&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;20 mM G(ppp)G 帽类似物（New England Biolabs）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;G-50 柱&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;水化5 g Sephadex G-50凝胶珠（Sigma Aldrich）于100 ml去离子H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 使用DEPC处理30分钟，然后高压灭菌。不完全配制的储存液在室温下保存。使用前，加入以下无RNase的溶液：&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;0.5 ml 0.2 M EDTA&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;1 ml 1 M Tris pH 8.0&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;0.5 ml 20% SDS&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;将完整的G-50溶液在4℃保存 &amp;deg; C.&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;从一个3 ml注射器（BD Biosciences）中取出并丢弃活塞，将注射器筒体放入一个15 ml锥形管（Corning）中。用少量玻璃棉堵塞注射器底部（堵塞物大小约为硬币的一半）。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;轻轻涡旋G-50溶液以重悬珠子。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;向空柱中加入2 ml G-50溶液。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;以 1,000 x 旋转 1 分钟 &lt;em&gt;g&lt;/em&gt; 在台式离心机中。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;加入200 &amp;mu;l DEPC 处理的去离子水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;向每列加入 O。离心。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;重复洗涤两次，共洗涤三次。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;将注射器筒移至新的15 ml离心管中。&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;胶原酶溶液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;75 mg 胶原酶来自 &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt; （Sigma Aldrich）&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;25 ml 0.1 M KPO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;+（pH 7.4）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;MBSH缓冲液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;88 mM NaCl&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;1 mM KCl&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;2.4 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;0.82 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; X 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;0.33 mM Ca(NO₃)₂&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;0.41 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;10 mM HEPES（pH 7.6）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;卵母细胞培养基&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;50% L15培养基&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;15 mM HEPES（pH 7.6）&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;1 mg/ml 胰岛素&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;100 mg/ml 庆大霉素&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;50 U/ml 制霉菌素&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;50 U/ml 青霉素&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;50 mg/ml 链霉素&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;MEMFA溶液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;0.1 M MOPS（pH 7.4）&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;2 mM EGTA&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;3.7% 甲醛&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;计算RNA产量&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;测定每分钟计数（CPM） &quot;输入&quot; 和 &quot;整合&quot; 使用标准的闪烁计数器对样品进行检测。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;掺入 = (&quot;整合&quot;) / (10 × &quot;输入&quot;)&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;典型的掺入值范围在 ~0.03 至 0.10 之间。&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;不同聚合酶的最大理论产量：T7、T3、SP6 - 2.64 &amp;mu;g&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;反应产率 &amp;mu;g = （聚合酶的最大产量）×（整合率）&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;将RNA稀释至50 nM = (&amp;mu;g RNA) / 320 / (RNA 长度，单位为碱基) / (5×10&lt;sup&gt;-8&lt;/sup&gt;)&lt;/li&gt; &lt;li 类=&quot;无&quot;&gt;反应通常产生约 50-100 &amp;mu;50 nM 的 RNA 量。&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

在 xenopus 卵母细胞中可视化 rna 定位

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA定位是建立细胞极性的一种保守机制。Vg1 mRNA定位于卵母细胞的植物极。 非洲爪蟾 卵母细胞，并在空间上限制Vg1蛋白的基因表达。通过这种方式对Vg1分布进行严格调控，是胚胎发育过程中正确形成胚层所必需的。Vg1 mRNA的3'非翻译区（3' UTR）中的RNA序列元件，即Vg1定位元件（Vg1 localization element, VLE），足以且必需介导其运输。为研究Vg1 mRNA的识别与运输机制 体内我们开发了一种成像技术，可通过简单的可视化读出，实现对转录因子介导的转运机制的深入分析。 
为了观察RNA的定位，我们合成了荧光标记的VLE RNA，并将该转录本显微注射到单个卵母细胞中。注射后，将卵母细胞进行培养，以允许注入的RNA发生转运，随后固定并脱水，再通过共聚焦显微镜成像。mRNA定位模式的可视化可作为监测RNA运输全过程的读出指标，同时可用于鉴定转录本内部顺式作用元件以及结合VLE的反式作用因子在指导RNA运输中的功能（Lewis等，2008；Messitt等，2008）。我们已将该技术进一步拓展，用于与其他RNA和蛋白质的共定位分析（Gagnon和Mowry，2009；Messitt等，2008），并结合运动蛋白和细胞骨架的干扰实验（Messitt等，2008），以探究mRNA定位背后的分子机制。

可视化 体内 RNA 运输通过将荧光标记的 RNA 转录本显微注射到 非洲爪蟾 卵母细胞，随后进行共聚焦显微镜观察。

在 Xenopus 卵母细胞中可视化 RNA 定位

RNA定位是建立细胞极性的一种保守机制。Vg1 mRNA定位于非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞的植物极，并发挥……作用。

在此过程中，将带有荧光标记的RNA转录本注射到XUS细胞中，并监测其定位。首先，使用荧光核苷酸对RNA进行标记。在体外转录反应中，将RNA加载至显微注射装置中。将卵母细胞放置于注射培养皿上，并进行精确的显微注射。最后，培养卵母细胞以使RNA定位发生，随后在共聚焦显微镜下进行成像观察。大家好，我是来自布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系 Kimberly Mallory 博士实验室的 James Gagnan。今天我们将向您展示一种在爪蟾卵母细胞中可视化亚细胞 RNA 定位的方法。我们实验室利用该方法研究脊椎动物早期发育过程中 RNA 定位所需的 RNA 结构和蛋白质因子。那么我们开始吧。首先，按照随附的书面实验方案所述，对mRNA进行转录，并使用放射性标记和荧光标记进行标记。加入DS以降解模板DNA，然后通过添加EDTA终止反应。通过G 50柱离心去除未掺入的核苷酸及其他小分子。然后通过乙醇沉淀浓缩RNA，洗涤并重新悬浮。通过闪烁计数测定浓度后，将RNA稀释至50纳摩尔，并分装为5微升的等份，于-80摄氏度保存。准备进行显微注射时，取出标记好的RNA，于70摄氏度变性5分钟。然后在室温下以最大速度在微量离心机中离心10分钟，以去除颗粒物，并置于冰上保存。接下来，将非洲爪蟾卵巢组织剪成小块，放入含有25毫升浓度为3毫克/毫升的50毫升锥形管中。在pH 7.4的0.1摩尔磷酸钾缓冲液中使用胶原酶。由于批次间差异，需在18摄氏度下轻轻振荡。胶原酶处理时间可能有所不同，应通过肉眼观察仔细监测。为确保充分去卵泡，持续震荡15分钟，或直至卵母细胞明显从卵巢组织分离。静置，使卵母细胞沉降至锥形管底部。吸除溶液，更换为MBSH缓冲液。重复此步骤，共洗涤三次，包括本次在内总计三次洗涤。接下来，在标准光学显微镜下手动分选第三至第四期的CYTES和MBSH缓冲液。第三期的cytes完全不透明但呈白色，而第四期的cytes略大，且带有色素斑点。细胞若略显透明，则说明其过于年轻；而完全着色或色素分布极化的细胞则过于老化。最后，使用3.5英寸的毛细管拉制并修整针尖，制备显微注射用针头，使其外径约为0.05毫米。现在，mRNA、卵母细胞和注射针头均已准备就绪，可进行显微注射操作。首先使用去离子水校准针头，使每次注射输送两个纳米。使用气体控制的显微注射器装载针头，并在显微镜下用千分尺校准液滴大小。校准完成后，将待注射的RNA前装载入针头中。接下来，将分选好的卵母细胞置于含有MBSH缓冲液的注射皿中，该皿底部含有一层黑色泡沫橡胶。在黑色背景下，白色细胞清晰可见。然后，将每个卵母细胞小心地注入两微升浓度为50纳摩尔的RNA。确保每个卵母细胞仅注射一次，并在注射完成后定期检查针头是否堵塞。推出剩余的RNA，用去离子水冲洗针头，并加载下一份RNA用于注射。注射完成后，将注射过的细胞转移至无菌24孔板中的一个孔内，最多可转移一千个细胞。每个孔中的细胞可进行培养。吸去缓冲液，每孔加入400 µL细胞培养基。然后将培养板放入带有湿纸巾的塑料容器中，以维持培养期间的湿润环境，在18 °C下孵育卵母细胞，孵育时间根据实验需求选择8至48小时之间的时间点。注射后的卵母细胞在完成孵育后即可进行显微镜观察前的制样准备。挑出任何已死亡的卵母细胞，并将存活的卵母细胞放入玻璃小瓶中。通常可观察到超过90%的卵母细胞存活率。用M-E-M-F-A固定液替换缓冲液，并轻轻振荡卵母细胞20分钟。固定完成后，避免卵母细胞在光照下暴露。通过移除固定液并加入等体积的MBSH缓冲液来洗涤卵母细胞。重复此洗涤步骤一次，共洗涤两次。接下来，将卵母细胞洗涤至无水甲醇中。首先，移除一半体积的液体，并替换为甲醇。重复此步骤两次。完成这些洗涤步骤后，移除所有溶液，并用甲醇替代。再重复进行一次甲醇洗涤。固定并脱水的卵母细胞可在负20摄氏度下保存，直至准备成像时使用。成像前，向 WPI 玻底荧光培养皿中加入 Marie 透明介质，使其覆盖成像表面。小心将卵母细胞从甲醇转移至荧光培养皿中，尽量减少带入的甲醇体积，在倒置共聚焦显微镜下对卵母细胞进行成像，蔡司 LSM 510 和 Aica TCS SP 均可获得良好结果。接下来展示微注射后亚细胞 RNA 定位的一些代表性图像：经过 8 小时培养后，可在细胞核中观察到荧光标记的对照 RNA。RNA 可见均匀分布在卵母细胞的细胞质中。然而，含有能够招募运输机制序列的荧光标记 RNA 可见正在向卵母细胞的植物极进行亚细胞定位。我们刚刚向您展示了如何将荧光标记的 RNA 微注射到 zap 细胞中，并通过共聚焦显微镜观察 RNA 的定位情况。进行此操作时，重要的是使用去RNase处理的溶液，以避免RNA污染培养物，使用含抗生素的OCM培养细胞，并尽可能避免阳光直射细胞，以防止光漂白。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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