Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

在此过程中，荧光标记的 RNA。将转录本注射到 XUS Cytes 中并监测其定位。首先，用荧光核苷酸标记 RNA。

在体外转录反应中，然后将 RNA 加载到显微注射装置中。将卵母细胞放在注射皿上并小心地进行显微注射。最后，培养卵母细胞以允许在共聚焦显微镜上成像之前进行 RNA 定位。

大家好，我是来自布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系 Kimberly Mallory 博士实验室的 James Gagnan。今天，我们将向您展示一种在 Xap 卵母细胞中可视化亚细胞 RNA 定位的程序。我们在实验室中使用该程序来研究早期脊椎动物发育过程中 RNA 定位所需的 RNA 结构和蛋白质因子。

那么让我们开始吧。要开始此过程，请转录 mRNA，其放射性和荧光标记均如随附的书面方案中所述。添加 DS 以降解模板 DNA，然后通过添加 EDTA 终止反应。

通过 G 50 色谱柱旋转去除未掺入的核苷酸和其他小分子。然后通过乙醇沉淀浓缩 RNA，洗涤并重悬。通过闪烁计数确定浓度后，将 RNA 稀释至 50 纳摩尔，并在零下 80 摄氏度下储存在 5 微升等分试样中。

准备进行显微注射时，将标记 RNA 的 Eloqua 在 70 摄氏度下变性 5 分钟。然后在室温下在微量离心机中以最大速度旋转 10 分钟，以去除颗粒并保持在冰上。接下来，将 xap 后卵巢的细胞修剪块分离成一个 50 毫升的锥形两个，每毫升含有 25 毫升 3 毫克。

胶原酶溶于 pH 值为 7.4 的 0.1 摩尔磷酸钾缓冲液中。由于批次间的变化，请在 18 摄氏度下轻轻摇晃。胶原酶治疗时间可能会有所不同，应通过目视检查仔细监测。

为确保落叶继续摇晃 15 分钟或直到卵母细胞与卵巢明显分离，让卵母细胞沉降到锥形管的底部。取出溶液并替换为 MBSH 缓冲液。重复此作，再洗涤两次，总共洗涤 3 次。

接下来，在标准光学显微镜下手动分选第三至第四阶段的 CYTES 和 MBSH 缓冲液。第三阶段的细胞是完全不透明的，但为白色。而第四阶段的细胞略大并带有色素斑点。

略微透明的细胞太年轻，完全着色或表现出极化色素分布的细胞太老。最后，使用 3.5 英寸的毛细管拉动和斜切准备用于显微注射的针头，以制作外径约为 0.05 毫米的针头。现在 mRNA 卵母细胞和针头已准备就绪，请继续进行显微注射。

首先用 desy 水校准针头，每次注射提供 2 纳米。前面。使用气控微量注射器装入针头，并在校准后使用千分尺校准液滴大小，将要注射的 RNA 前置装入针头。接下来，将分选的卵母细胞放在注射皿上在 MBSH 缓冲液中，培养皿包含一层黑色泡沫橡胶。

白色细胞在黑色背景下非常突出。然后小心地向每个卵母细胞注射 2 升 50 纳摩尔的 RNA。确保每个卵母细胞只注射一次，并在注射完成后定期检查针头是否堵塞。

排出剩余的 RNA，用 desy 水冲洗针头，然后加载下一个 RNA 进行注射。注射后，将注射的细胞转移到无菌 24 孔板的孔中，最多 1000 孔。CYTES 可以按孔培养。

去除缓冲液，用每孔 400 μL 的细胞培养基替换。然后将培养板放入带有湿纸巾的塑料容器中，以在培养过程中保持潮湿环境，在 18 摄氏度下孵育卵母细胞，所需孵育期后 8 至 48 小时不等。注射的卵母细胞孵育后，可以准备卵母细胞进行显微镜检查。

分拣出所有死亡的卵母细胞，并将存活的卵母细胞放入玻璃瓶中。常规观察大于 90% 的卵母细胞的存活率。用 M-E-M-F-A 固定剂更换缓冲液，并摇动细胞 20 分钟。

固定期完成后，在固定期间保护卵母细胞免受阳光照射。通过去除固定剂并用等体积的 MBSH 缓冲液替换来洗涤卵母细胞。再次重复此洗涤，总共洗涤两次。

接下来，将卵母细胞洗涤到无水甲醇中。首先，取出一半的体积并用甲醇替换。再重复两次。

洗涤后，除去所有溶液并用甲醇替换。再重复一次甲醇洗涤。固定和脱水的卵母细胞可以储存在零下 20 摄氏度，直到准备好成像。

成像前，将 Marie 的透明介质添加到玻璃底 WPI 荧光皿中以覆盖成像表面。小心地将卵母细胞从甲醇转移到荧光皿中，尽量减少甲醇转移的体积，在倒置共聚焦显微镜上对卵母细胞进行成像，蔡司 LSM 5 10 和 aica TCSs P 均给出良好的结果。现在，我们将展示一些亚细胞 RNA 定位的代表性图像，显微注射后立即在细胞核中可以看到荧光 RNA，在荧光标记的对照培养 8 小时后。

可以看到 RNA 均匀分布在卵母细胞的细胞质中。然而，在亚细胞定位到卵母细胞的植物极的过程中，可以看到含有募集运输机制的序列的荧光标记的 RNA。我们刚刚向您展示了如何将荧光标记的 RNA 显微注射到 zap 细胞中，并通过共聚焦显微镜观察 RNA 定位。

执行此程序时，请务必使用 deci 处理的溶液，以避免 RNA 污染培养物、含有抗生素的 OCM 中的细胞，并尽可能保护细胞免受阳光照射以避免光漂白。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。