Name: 获得血细胞从夏威夷短尾鱿鱼 Euprymna scolopes和观察他们坚持共生和非共生细菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-11T04:52:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学习从夏威夷短尾鱿鱼Euprymna scolopes中提取血细胞并进行荧光染色，观察其与GFP标记细菌的粘附过程。该方法可用于研究宿主先天免疫系统与共生细菌的相互作用。

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资助来源：康涅狄格大学研究基金会及分子与细胞生物学系对 SVN 的资助，Sigma Xi 研究资助奖及 Antonio H. 和 Marjorie R. 
罗曼诺研究生教育奖学金授予 AJC

<ol>
 <li>制备 500 mL 的 0.22 μm 经滤膜除菌的人工海水（FSW；盐度 35 ppt）。将人工或天然海水通过滤膜过滤 0.22 μm 微米滤膜过滤以去除颗粒和细菌。</li>
 <li>麻醉一只成年夏威夷短尾鱿鱼（Euprymna scolopes）Euprymna scolopes将动物置于含2%乙醇的FSW溶液中进行麻醉。麻醉时间约为10分钟。乌贼将停止游动，且对触碰无主动反应。此时仍应观察到由外套膜运动指示的持续呼吸作用以及色素细胞的活动。</li>
 <li>将鱿鱼腹面朝上置于标准石蜡解剖盘中，用含2%乙醇的过滤海水（FSW）淹没动物。</li>
 <li>使用一种标准 200 μl 移液管吸头，向后拉开漏斗和外套膜，以暴露位于两眼之间的主头静脉血管。</li>
 <li>使用无菌的1 mL注射器（配26.5号针头），穿刺头静脉血管，抽取50–100 μl 血淋巴。将血淋巴置于冰上的一次性无菌1.5 mL离心管中。 注意：如果一只动物将多次作为供体，每次仅采集10-20 μl 任何时间点的血淋巴量。将动物放回正常海水水箱中，动物将在30分钟内恢复。</li>
 <li>新鲜采集的血细胞经洗涤后重悬于 500 μl 的鱿鱼林格溶液（S-Ringers；530 mM NaCl，10 mM KCl，25 mM MgCl2，10 mM CaCl2 和 10 mM HEPES 缓冲液（pH 7.5）。 </li>
 <li>通过血细胞计数板测定血细胞浓度，将约2,000个细胞加入带腔室的玻璃盖玻片中，于室温下静置10分钟，使其贴附于玻璃表面。在此密度下，血细胞在玻片表面形成均匀的单层。</li>
 <li>为了观察细菌与宿主血细胞的结合，可将血细胞暴露于荧光标记的细菌菌株，例如 费氏弧菌 ES114 和/或 Vibrio harveyi B392，均含有绿色荧光报告基因。 V. fischeri ES114 和 V. harveyi B392 在海水胰蛋白胨培养基（SWT）中培养至对数生长期中期 28°C 在摇床中孵育。通过分光光度法测定600 nm处的光密度以确定菌液浓度。将细菌以5,000 rpm离心5分钟收集菌体，弃去上清液，菌体沉淀用S-Ringers溶液重悬。</li>
 <li> 每个腔室孔中加入100,000个细菌细胞，使每个血细胞平均与50个细菌接触。将血细胞与细菌的混合物在S-Ringer溶液中孵育 25°C 1小时，该时间可获得最大结合水平。 </li>
 <li>然后用 0.005% CellTracker Orange（Invitrogen）对血细胞的细胞质进行荧光染色，并用 S-Ringers 溶液洗涤以观察细胞。 </li>
 <li>使用蔡司Discovery V20荧光体视显微镜或徕卡SP2光谱激光共聚焦显微镜通过荧光观察带有相关细菌的染色血细胞，并在整个动物细胞表面进行计数。</li>
</ol>
代表性结果
由于头足类血淋巴含有细胞外血蓝蛋白而非血红蛋白，因此在氧合后，血淋巴会变为深蓝色。平均每约5000个血细胞 μl 可采用此方法获取血淋巴。血细胞在腔室载玻片上贴壁并经荧光染色后，应呈现明亮的红色荧光，形态呈变形虫状。进行细菌黏附实验时， V. fischeri 与血细胞的黏附性较差（每个血细胞仅1-2个细菌细胞） V. harveyi 会牢固黏附（每个血细胞附着10-15个细菌细胞）。
<img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="头足类解剖结构示意图，箭头指示眼部结构，海洋生物学图示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 成年夏威夷短尾乌贼 Euprymna scolopes，显示头部血管的位置。
<img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="荧光显微镜图像，细胞结构呈红色，外来颗粒呈绿色，细胞研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 血细胞暴露于Vibrio fischeri（A）和Vibrio harveyi（B）的结果。红色：Cell Tracker Orange；绿色：GFP标记的细菌。

<ol><li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unseen+forces%3A+the+influence+of+bacteria+on+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+animal-bacterial+association%3A+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes%3A+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li>
<li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+fischeri+and+its+host%3A+it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li>
</ol>

近年来，关于免疫系统在有益细菌与其宿主之间介导分子信号传导作用的研究，极大地增进了我们对真核生物与其微生物群共同进化的理解。鱿鱼/弧菌系统已被证明是回答该领域基本问题的一个可行模型系统2,3,5,6,8。鱿鱼Euprymna scolopes的发光器官仅允许发光细菌Vibrio fischeri定植。由于容纳细菌的组织始终与海水接触，鱿鱼宿主不仅必须促进这种特异性共生关系，还必须持续排斥其他细菌。持续的研究表明，类似巨噬细胞的血细胞可能在该共生关系的建立和维持过程中发挥重要作用1,4,7。由于鱿鱼宿主缺乏适应性免疫系统，这种共生关系中所表现出的高度特异性必然完全或部分由先天免疫系统介导。最近对这些血细胞的一项研究表明，从E. scolopes中分离出的血细胞能够差异性地识别并吞噬V. fischeri和非共生细菌，且定植过程可能诱导了对共生菌的一种“免疫耐受”4。本实验方案将演示如何成功地从成年鱿鱼中获取这些血细胞，并检测其结合细菌的能力。

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek 8孔腔室#1.0硼硅酸盐盖玻片系统</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>26.5 G 1ml 无乳胶胰岛素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V20 显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP2 共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从夏威夷短尾乌贼 euprymna scolopes 中获取血细胞并观察其对共生与非共生细菌的黏附性

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

近年来，关于免疫系统在有益细菌与其宿主之间介导分子信号传导作用的研究，极大地增进了我们对真核生物与其微生物群共同进化的理解。夏威夷短尾鱿鱼与其共生的费氏弧菌之间的共生关系，Euprymna scolopes以及发光细菌Vibrio fischeri已被用作研究有益细菌对动物发育影响的模式系统。最近的研究表明，类似巨噬细胞的血细胞——该鱿鱼宿主先天免疫系统的唯一细胞组分——可能在介导这一共生关系的建立与维持过程中发挥重要作用。本实验方案将演示如何从鱿鱼中获取血细胞E. scolopes然后将这些细胞用于细菌结合实验。首先将成年鱿鱼麻醉，再用注射器从其头部主要的血管中采集血淋巴。从血淋巴中提取的宿主血细胞被接种到带孔的玻璃盖玻片上，随后暴露于绿色荧光蛋白标记的共生菌。Vibrio fischeri以及非共生的Vibrio harveyi. 使用荧光染料（Cell Tracker Orange，Invitrogen）对血细胞进行复染，然后通过荧光显微镜观察。

本视频将演示如何从夏威夷短尾乌贼（Euprymna scolopes）中获取血细胞（血淋巴细胞），用于细胞生物学和细菌黏附实验。血细胞将用荧光染料染色，并与表达GFP的标记细菌共孵育。

从夏威夷短尾乌贼 Euprymna scolopes 中获取血细胞并观察其对共生与非共生细菌的黏附性

近年来，关于免疫系统在有益细菌与其宿主之间介导分子信号传导作用的研究已取得……

在将短尾乌贼成体从水箱中取出，并用2%乙醇过滤海水溶液麻醉后，通过头部血管放血。使用26.5号注射器抽取血淋巴，提取的血淋巴呈蓝色。由于血蓝蛋白的存在，将血细胞稀释至所需浓度后，分装到八室盖玻片中。待血细胞贴附于盖玻片后，用细胞追踪橙（cell tracker orange）——一种荧光染料——进行染色，并加入GFP标记的细菌进行刺激，随后可在荧光显微镜下观察。大家好，我是康涅狄格大学分子与细胞生物学系的Spencer Olm。我是来自纽约家庭实验室的 Andrew Collins。今天我们将向您展示一种从夏威夷短尾乌贼中提取血淋巴（即血液）的操作方法。您需要先对这个吸头进行预处理。目前，夏威夷短尾乌贼是一种夜间活动的动物，栖息于夏威夷海岸附近的珊瑚礁区域。它们利用体内共生菌产生的光亮，在夜间觅食时进行伪装，其最喜爱的食物是虾类。在实验室中，我们利用这种共生关系来研究有益细菌如何定植于动物组织。我们实验室采用这一实验方法，研究宿主先天免疫系统组分与其发光共生菌伙伴Vibrio fischeri之间的相互作用。那么我们开始吧。在提取血淋巴之前，将一只成年鱿鱼放入一个一升的烧杯中，加入500毫升过滤除菌的人工海水，并用新配制的2%乙醇溶液进行麻醉。10分钟后，鱿鱼将停止游动，且对触碰不再产生主动反应。然而，仍应观察到由外套膜运动以及表明色素细胞活跃的色素细胞活动所指示的持续呼吸现象。将烧杯中的部分无菌海水乙醇溶液倒入标准石蜡解剖盘中，并将鱿鱼腹面朝上置于盘内溶液中浸没。使用一个标准的200微升移液器吸头，向后拉开漏斗和外套膜，以暴露位于两眼之间的主要头部大血管。使用带有26.5号针头的无菌注射器穿刺头静脉血管，抽取50至100微升或10至20微升的血淋巴。如果该动物将多次作为供体，应将血淋巴置于冰上的无菌1.5毫升离心管中。请注意，若此步骤操作正确，乌贼血液应呈深蓝色。将动物放回正常海水水箱中以恢复活力，在室温下用微型离心机离心血淋巴，使血细胞沉淀，吸除上清液。用500 µL枪乌贼林格溶液重悬血细胞进行洗涤。然后再次离心，使细胞沉淀并移除上清液。最后，用血细胞和鱿鱼林格溶液重悬。使用血细胞计数板测定细胞浓度，然后将约2000个细胞加入到玻璃盖玻片的每个腔室中。让细胞在玻璃表面贴附约10分钟。在此密度下，血细胞应在玻璃表面形成均匀的单层。在28摄氏度的摇床中准备细菌时，将血细胞保持在冰上。在海水型Tritone培养基中培养含绿色荧光报告基因的一种或多种Vireo菌株至对数生长中期。使用分光光度计在600 nm波长下测定菌液的光密度以确定细胞密度，随后将细菌离心形成沉淀，弃去上清液并重悬菌体沉淀。将细菌加入1毫升乌贼任氏液中，与血细胞混合。在每孔含有100,000个细菌的多孔玻璃载片中，于室温孵育1小时。为实现最大程度的结合，加入细胞示踪橙染料，终浓度为0.005%，以染色血细胞胞质。孵育30分钟，然后用150 µL新鲜的鱿鱼林格溶液洗涤。加入共聚焦显微镜，观察染色的血细胞及其相关细菌，并在整个血细胞表面计数细菌。接下来，我们将展示一些血细胞与GFP标记的非共生菌Filio Harvey Eye以及天然鱿鱼共生菌Filio fii相互作用的代表性图像。这是一张未经过任何细菌刺激的血细胞位点图像。该细胞呈红色，且已被激活，因此可以看到其类似伪足的突起结构。当细胞受到共生菌细菌 filio fii 的挑战时，仅观察到少量细菌结合在细胞表面。然而，当非共生细菌 filio Harvey Harveyi 与血细胞接触时，结合的细菌数量显著增多。我们刚刚向您展示了如何从夏威夷短尾鱿鱼中提取血淋巴，分离血细胞，并将其用于实验，以表征细菌对这些鱿鱼细胞的黏附特性。通过在血细胞粘附到盖玻片表面后进行固定，该方案可修改用于免疫化学。在从动物体内获得血细胞后，也可提取RNA、DNA和蛋白质。以上即为全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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