从夏威夷短尾乌贼 Euprymna scolopes 中获取血细胞并观察其对共生与非共生细菌的黏附性

在将短尾乌贼成体从水箱中取出，并用2%乙醇过滤海水溶液麻醉后，通过头部血管放血。使用26.5号注射器抽取血淋巴，提取的血淋巴呈蓝色。

由于血蓝蛋白的存在，将血细胞稀释至所需浓度后，分装到八室盖玻片中。待血细胞贴附于盖玻片后，用细胞追踪橙（cell tracker orange）——一种荧光染料——进行染色，并加入GFP标记的细菌进行刺激，随后可在荧光显微镜下观察。大家好，我是康涅狄格大学分子与细胞生物学系的Spencer Olm。

我是来自纽约家庭实验室的 Andrew Collins。今天我们将向您展示一种从夏威夷短尾乌贼中提取血淋巴（即血液）的操作方法。您需要先对这个吸头进行预处理。

目前，夏威夷短尾乌贼是一种夜间活动的动物，栖息于夏威夷海岸附近的珊瑚礁区域。它们利用体内共生菌产生的光亮，在夜间觅食时进行伪装，其最喜爱的食物是虾类。在实验室中，我们利用这种共生关系来研究有益细菌如何定植于动物组织。我们实验室采用这一实验方法，研究宿主先天免疫系统组分与其发光共生菌伙伴Vibrio fischeri之间的相互作用。

那么我们开始吧。在提取血淋巴之前，将一只成年鱿鱼放入一个一升的烧杯中，加入500毫升过滤除菌的人工海水，并用新配制的2%乙醇溶液进行麻醉。10分钟后，鱿鱼将停止游动，且对触碰不再产生主动反应。

然而，仍应观察到由外套膜运动以及表明色素细胞活跃的色素细胞活动所指示的持续呼吸现象。将烧杯中的部分无菌海水乙醇溶液倒入标准石蜡解剖盘中，并将鱿鱼腹面朝上置于盘内溶液中浸没。使用一个标准的200微升移液器吸头，向后拉开漏斗和外套膜，以暴露位于两眼之间的主要头部大血管。

使用带有26.5号针头的无菌注射器穿刺头静脉血管，抽取50至100微升或10至20微升的血淋巴。如果该动物将多次作为供体，应将血淋巴置于冰上的无菌1.5毫升离心管中。请注意，若此步骤操作正确，乌贼血液应呈深蓝色。

将动物放回正常海水水箱中以恢复活力，在室温下用微型离心机离心血淋巴，使血细胞沉淀，吸除上清液。用500 µL枪乌贼林格溶液重悬血细胞进行洗涤。然后再次离心，使细胞沉淀并移除上清液。

最后，用血细胞和鱿鱼林格溶液重悬。使用血细胞计数板测定细胞浓度，然后将约2000个细胞加入到玻璃盖玻片的每个腔室中。

让细胞在玻璃表面贴附约10分钟。在此密度下，血细胞应在玻璃表面形成均匀的单层。在28摄氏度的摇床中准备细菌时，将血细胞保持在冰上。

在海水型Tritone培养基中培养含绿色荧光报告基因的一种或多种Vireo菌株至对数生长中期。使用分光光度计在600 nm波长下测定菌液的光密度以确定细胞密度，随后将细菌离心形成沉淀，弃去上清液并重悬菌体沉淀。将细菌加入1毫升乌贼任氏液中，与血细胞混合。

在每孔含有100,000个细菌的多孔玻璃载片中，于室温孵育1小时。为实现最大程度的结合，加入细胞示踪橙染料，终浓度为0.005%，以染色血细胞胞质。

孵育30分钟，然后用150 µL新鲜的鱿鱼林格溶液洗涤。加入共聚焦显微镜，观察染色的血细胞及其相关细菌，并在整个血细胞表面计数细菌。接下来，我们将展示一些血细胞与GFP标记的非共生菌Filio Harvey Eye以及天然鱿鱼共生菌Filio fii相互作用的代表性图像。

这是一张未经过任何细菌刺激的血细胞位点图像。该细胞呈红色，且已被激活，因此可以看到其类似伪足的突起结构。

当细胞受到共生菌细菌 filio fii 的挑战时，仅观察到少量细菌结合在细胞表面。然而，当非共生细菌 filio Harvey Harveyi 与血细胞接触时，结合的细菌数量显著增多。我们刚刚向您展示了如何从夏威夷短尾鱿鱼中提取血淋巴，分离血细胞，并将其用于实验，以表征细菌对这些鱿鱼细胞的黏附特性。

通过在血细胞粘附到盖玻片表面后进行固定，该方案可修改用于免疫化学。在从动物体内获得血细胞后，也可提取RNA、DNA和蛋白质。以上即为全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。