Name: 剖析器官的成年斑马鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-04T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习成年斑马鱼解剖技术，系统分离心脏、肝脏、肠道、生殖腺和脑等器官。该方法为发育生物学和神经科学研究提供重要的实验基础。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 HD050901（授予MCM）以及美国癌症协会博士后奖学金#PF-05-041-01-DDC（授予TG）支持。

<ol>
<li>首先解剖一条雄性斑马鱼，然后解剖一条雌性斑马鱼。开始解剖前，先将鱼置于0.2% Tricaine中麻醉，再通过在冰水中孵育15分钟实施安乐死。
</li>
<li>首先用纸巾轻轻拍干鱼体表面，然后将其置于解剖垫上。从外部形态看，斑马鱼具有单个的背鳍、尾鳍和臀鳍，以及成对的胸鳍和腹鳍（图1）。 
 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig1.jpg" alt="斑马鱼解剖图，显示各鳍的位置：背鳍、尾鳍、胸鳍、腹鳍、臀鳍。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 成年雄性鱼，鳍已标记。 </li>
<li>用大头针穿过鱼尾的肉质部分和眼窝的腹侧部分，将其固定在解剖垫上。</li>
<li>在鱼腹部肛门鳍前方剪开皮肤。从肛门鳍沿腹部至鳃盖（覆盖鳃部的硬质结构）剪开皮肤及下方肌肉（图2，步骤1）。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig2.jpg" alt="斑马鱼解剖图；标注的循环系统路径；生物学教学研究" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 去除皮肤和体壁肌肉以暴露内脏器官的步骤 </li>
<li>接下来，移除鳃盖和胸鳍，包括胸鳍基部的胸带（鳍基部厚而骨质的区域）（图2，步骤2）。从暴露的鳃后方开始，沿鱼体侧面切开皮肤及下方肌肉，一直延伸至肛鳍（图2，步骤3）。</li>
<li>小心地去除鱼体侧面的皮肤及下方的肌肉组织。许多内部器官此时已清晰可见（图3）。 
<img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig3.jpg" alt="斑马鱼解剖示意图，显示用于研究的心脏、肝脏、肠道、睾丸和 swim bladder。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 去除体壁和肌肉后的成年雄性鱼类，以显示其内部器官。 </li>
<li>睾丸是成对的长条形白色器官，附着于体壁背侧。取一个睾丸置于 PBS 培养皿中。使用反射光观察睾游戏副本，可见其中的曲细精管（图4），曲细精管内含有处于不同发育阶段的生精细胞囊，从精原细胞到精子细胞（Leal 等，2009）。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig4.jpg" alt="植物淀粉颗粒的显微镜图像；显微技术；细胞结构研究" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 睾丸解剖。白色圆形结构为曲细精管。 </li>
<li>接下来，将鱼体腔内的消化系统取出。肝脏可通过其较大的体积、分叶状形态、棕褐色颜色以及丰富的血管分布来识别。在内脏中还可观察到胆囊，即一个充满绿色透明液体的囊状结构，以及呈鲜红色的脾脏。</li>
<li>将肠道与其他器官分离并拉直。根据上皮皱襞的高度，可将肠道分为前肠、中肠和后肠区域（Wallace et al., 2005）。</li>
<li>将一段肠道置于磷酸盐缓冲液中，利用透射光观察上皮皱襞。</li>
<li>接下来，观察鱼鳔。鱼鳔由后室和前室组成，其中后室通过气 duct 与食管相连，前室则通过韦伯氏器与内耳相连（Finney et al., 2006）。</li>
<li>移除并丢弃鱼鳔。取下固定针，将鱼重新以腹面朝上固定，以解剖位于背侧体壁的肾脏。肾脏为淡粉色半透明结构，与背主动脉及色素细胞相关联。肾脏可分为头区、体区和尾区三部分（图5）。切取一部分肾脏组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，分离肾脏组织以暴露肾小管。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig5.jpg" alt="扁形动物解剖图，标注头部、身体、尾部；用于生物学教学。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 图5. 头部、体部和尾部肾脏沿背侧体壁的位置。 </li>
<li>解剖一条雌性鱼。如前所述，将鱼置于冰水中实施安乐死后，用纸巾擦干鱼体，再将其固定于解剖垫上。按之前示范的方法去除鱼体一侧的皮肤。卵巢为双叶状结构，由富含血管的卵巢系膜悬吊于体腔内。</li>
<li>取出一侧卵巢，置于 PBS 中，用透射光观察。可用细针将卵母细胞分离后进行分期（图6，Selman 等，1993）。I 期卵母细胞大小约为 10 - 150 微米，呈半透明状。II 期卵母细胞大小约为 150 - 350 微米，其特征为出现皮质颗粒。III 期卵母细胞大小为 350 - 750 微米，由于卵黄积累而呈不透明状。成熟的 IV 期和 V 期卵母细胞呈半透明，通常不在近期交配过的雌性个体卵巢中发现。 
<img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig6.jpg" alt="菌落形态分析，显微镜图像，显示标记为 I、II、III 的不同细菌生长阶段。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 图6. 在解剖显微镜下利用透射光观察到的处于 I、II 和 III 期的活体卵母细胞。 </li>
<li>接下来，从鱼体内解剖出心脏。心脏位于鳃的后方和腹侧。首先将心脏及其周围所有组织一并剪下，并置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后仔细剥离心脏周围的组织，注意不要损伤 delicate 的心房。</li>
<li>将解剖后的心脏置于林格氏液中，以观察心脏搏动。 识别心房、心室和动脉球（图7，Hu等，2001）。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig7.jpg" alt="鱼类心脏解剖图，标注有心房、心室和动脉球。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 图7. 解剖的成年心脏。 </li>
<li>通过将鱼脑从鱼体中取出以完成解剖。首先解除固定鱼体的图钉，用剃刀片切下鱼头。用镊子尽可能去除颅骨腹侧的软组织。使用小型弹簧剪剪除眼睛。打开颅骨，去除脑腹侧的骨组织。随后将鱼头置于盛有PBS的培养皿中，从脑背侧去除皮肤和颅骨骨片。</li>
<li>识别嗅球、端脑、缰核、视顶盖、小脑和延髓（图8，Wullimann等，1996；Schilling，2002）。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig8.jpg" alt="斑马鱼脑解剖图；标注区域包括嗅球、小脑、延髓。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 图8. 成年斑马鱼解剖脑组织。背侧观，上端为头侧。 </li>
</ol>

<ol><li>Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Autonomic+Innervation+of+the+Swim+Bladder+in+the+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio).</a> J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).</li>
<li>Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+morphology+and+blood+pressure+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish.</a> Anat Rec. 264, 1-12 (2001).</li>
<li>Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+stereological+evaluation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+spermatogenesis+with+an+emphasis+on+spermatogonial+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations.</a> Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+larval+and+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach+%28The+Practical+Approach+Series%29%22%5BJournal%5D)">The morphology of larval and adult zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+Zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J. Morphol. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).</li>
</ol>

动物实验严格按照宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。

<table><tbody><tr><td colspan="4">试剂：</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;0.2% 三卡因（Tricaine，乙基-3-氨基苯甲酸酯）&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;200 mg 三卡因粉末&lt;br/&gt;97.9 ml 去离子水&lt;br/&gt;~1 ml 1 M Tris（pH 9）&lt;br/&gt;调节pH至7.0</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;磷酸盐缓冲液（PBS）&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;4.0 g NaCl&lt;br/&gt;0.1 g KCl&lt;br/&gt;100 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液，pH 7.3&lt;br/&gt;150 ml dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;林格氏液&amp;rsquo;s 溶液&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;6.7g NaCl&lt;br/&gt;0.2 g KCl&lt;br/&gt;0.2 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;1.2 g Hepes&lt;br/&gt;1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O &lt;br/&gt;调节pH至7.2</td></tr><tr><td>带垫片的解剖皿</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70540</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

成年斑马鱼器官的解剖

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

在过去的20年中，斑马鱼已成为研究脊椎动物发育与疾病的重要模式生物。尽管对胚胎和幼鱼的实验分析已十分广泛，形态学特征也已有详尽记录，但关于成年斑马鱼解剖结构的系统描述、成体器官和结构的发育研究，以及成鱼操作技术仍较为缺乏。在从幼鱼到成鱼的转变过程中，幼体器官在整体结构、形态及解剖位置上均发生显著变化。体表上，透明的幼鱼逐渐形成具有特征性的成体条纹色素模式和成对的腹鳍；在体内，各器官经历大规模的生长与重塑。此外，具有双向潜能的性腺原基将分化为睾丸或卵巢。本实验方案详细识别了多种成年斑马鱼的器官，并展示了成鱼脑、性腺、消化系统、心脏和肾脏的解剖方法。所获取的组织可用于原位杂交、免疫组织化学、组织学分析、RNA提取、蛋白质分析及其他分子生物学技术。本方案将有助于拓展斑马鱼相关研究，涵盖幼体器官的重塑、成体特有器官的形态发生，以及其他成体器官系统的深入探究。

关键词：斑马鱼，成体解剖，器官发育，性腺分化，消化系统，心脏，肾脏，脑，组织解剖，原位杂交，免疫组织化学，组织学，RNA提取，蛋白质分析

本实验方案描述了从成年斑马鱼中识别和解剖器官的步骤。

在过去的20年中，斑马鱼已成为研究脊椎动物发育和疾病的重要模式生物。尽管实验上……

在过去的20年中，斑马鱼已成为研究脊椎动物发育和疾病的重要模式生物。尽管斑马鱼胚胎和幼鱼的形态已被充分记录，但关于成年斑马鱼的解剖结构以及成鱼操作技术的描述仍较为缺乏。宾夕法尼亚大学Mary Mullin实验室研究性腺发育，并 routinely 对成年鱼的卵巢和睾丸进行解剖。本方案演示了性腺的解剖，以及其它主要器官系统的识别与解剖。首先，将一条鱼麻醉并实施安乐死，然后将其固定在解剖板上。去除鱼体的皮肤及下方肌肉，以暴露心脏、肝脏、肠、性腺和鳔。将内脏器官从体腔中取出。为了进一步检查或实验，宾夕法尼亚大学细胞与发育生物学系 Mary Mullins 实验室的 Tripti Gupta 将识别成年斑马鱼的多种器官，并演示如何从成年斑马鱼中解剖这些器官。为了便于观察和解剖操作，将从雄性斑马鱼中解剖睾丸、胃肠道系统和肾脏，然后从雌性斑马鱼中解剖卵巢、心脏和脑。为了减少肠道内的食物量，解剖前一天不要喂食鱼类。将解剖一条雄性斑马鱼。首先，您需要准备解剖垫、威尼斯弹簧剪镊、解剖针、一皿 PBS 以及一条已麻醉并实施安乐死的鱼。用纸巾轻轻将鱼体表面擦干，并将其侧放于解剖垫上。在解剖垫上观察，斑马鱼具有单一的背鳍和肛鳍，以及成对的腹鳍和胸鳍。使用解剖针穿过鱼尾部的肌肉部分和眼窝的腹侧部分，将鱼固定在解剖垫上。用弹簧剪在肛鳍前方的腹部剪开皮肤。从肛鳍开始，沿腹部剪开皮肤及下方肌肉，直至鳃部外侧坚硬的覆盖结构——鳃盖骨（operculom）。使用剪刀和镊子切除鳃盖骨和胸鳍，包括胸鳍基部称为胸带骨的厚实骨质区域。移除这些结构以暴露鳃部。从暴露的鳃部上方开始，沿鱼体侧面向后剪开皮肤及皮下肌肉，再向下剪至肛鳍。小心地去除鱼体侧的皮肤和下方肌肉，以暴露内部器官。睾丸为长条状、白色、成对的器官，附着于体腔背壁。取一个睾丸并置于盛有室温 PBS 的培养皿中，去除与睾丸相连的脂肪组织。在解剖显微镜下用反射光观察睾丸，以辨识生精小管，其中含有从精原细胞到精子细胞不同发育阶段的生精细胞囊。接下来，从鱼体体腔中取出消化系统、胆囊（一个充满绿色半透明液体的囊状结构）以及呈鲜红色的脾脏，这些器官均位于内脏中。肝脏可通过其较大的体积、分叶状形态、黄褐色外观以及丰富的血管化特征进行识别。将肠道与其他器官分离并拉直。肠道的前部、中部和后部根据上皮皱襞的高度进行划分，其中前部的皱襞最高。取一段肠道置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用透射光在显微镜下观察上皮皱襞的结构。现在观察鱼鳔。鱼鳔由后室和前室组成：后室通过气管与食管相连，前室则通过韦伯氏器与内耳相连。移除并丢弃鱼鳔，取下固定鱼体的图钉，将鱼重新固定为腹面朝上，以解剖肾脏。肾脏是位于体壁背侧的半透明粉红色结构，与背主动脉和色素细胞相关联。肾脏分为头区、体区和尾区。好的，这就是头、肾脏、体区和尾区。这是主动脉，这些是色素细胞。在显微镜下解剖一段肾脏组织并将其置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。用细针将肾脏组织分离，以暴露肾小管。进行雌鱼解剖时，除之前使用的工具外，还需准备一些细针、剃刀刀片以及一皿任氏液。进行心脏解剖时，先将已处死的鱼体擦干，然后用大头针将其固定在解剖垫上。与之前相同，采用相同的解剖技术去除雌鱼体侧的皮肤。卵巢是一种双叶结构，由富含血管的系膜悬吊于体腔内。取下一侧卵巢叶并置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。在显微镜下利用透射光观察卵巢。可用细针将细胞轻轻分离，然后根据其大小和形态特征确定所处的发育阶段。接着，从鱼体中解剖出心脏。心脏位于鳃的后方和腹侧。首先，在显微镜下将心脏及其周围组织剪下，并置于 PBS 中。轻轻解剖去除心脏周围的组织，注意不要损伤脆弱的心房。将解剖好的心脏放入任氏液中，并置于显微镜下。为了观察心跳，需辨认出心房、心室和动脉球。要获取脑组织，先取下固定鱼体的图钉，用剃刀片切下头部。用镊子尽可能去除颅骨腹侧的软组织。识别视交叉，然后使用小型弹簧剪刀摘除眼睛。用镊子击碎并打开颅骨，从脑腹侧去除颅骨骨片。用弹簧剪刀剪断脑神经。如有必要，将头部转移至一皿 PBS 中。在显微镜下将头部翻转，从脑部背侧去除皮肤和颅骨，辨认嗅球。辨认前脑、视顶盖、小脑和延髓。以下是嗅球、青绿色的头体、ula、视叶、小脑和延髓、心脏、胃肠道系统、性腺、 swim 膀胱、肾脏以及脑组织，这些器官均从成年斑马鱼中分离得到。这些器官现在可用于原位杂交、免疫组织化学、组织学、RNA 提取或其他分子技术。

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科研

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Biology

生物学

剖析器官的成年斑马鱼

斑马鱼的肾脏含有肾源性和造血性成体干细胞/祖细胞，为在脊椎动物模式生物中研究这些细胞类型及其分化后代提供了极佳的机会。本文展示了一种详细的解剖操作步骤，使研究人员能够识别并手术切除成年斑马鱼的肾脏，该组织可用于细胞分离、移植以及肾脏和/或血细胞群体的表达研究等应用。...

成年斑马鱼肾脏的解剖

本文描述了在多个发育阶段对斑马鱼心脏进行解剖和分离的清晰、标准化方法。同时讨论了相关的标注与定量技术。...

斑马鱼（Danio rerio）幼虫、幼体及成体的心脏解剖

本视频介绍了分离肠道以评估生物活性化合物肠道吸收的技术。在此示例中，我们将从成年斑马鱼中分离肠道，以分析免疫刺激剂的吸收情况。...

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本视频介绍了一种在多个发育阶段从斑马鱼中分离心脏以研究心脏发育、成熟和衰老的技术。...

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斑马鱼脑解剖：一种鱼类神经生物学技术

斑马鱼脊髓中的增殖、模式形成、分化和轴突导向等发育过程可被便捷地建模。本文介绍一种优化斑马鱼胚胎固定的方法，以实现对这些事件的清晰可视化。...

斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片：脊髓发育分析

斑马鱼在心血管研究中的应用正逐步扩展到成年心脏的研究。对于这些应用而言，快速且简便地分离心脏组织是关键，以避免死后变化并获得足够数量的样本。本文介绍了一种快速且可重复的成年斑马鱼心脏解剖方法。...

成年斑马鱼心脏的回收及其在高通量应用中的使用

本文介绍了一种分离幼体斑马鱼性腺组织的实验方案，该方法将有助于开展斑马鱼性别分化与维持机制的研究。...

斑马鱼幼体性腺组织的解剖

本文介绍了一种实验方法，可用于对成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统进行简便分析，作为长期血管病变（与新生血管形成及结构改变相关）研究中的快速检测手段。...

通过鱼类之眼研究糖尿病：成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的显微解剖、可视化与分析

本方案描述了在成年斑马鱼中切除肝脏腹叶以研究肝脏再生的过程。...

成年斑马鱼的部分肝切除术

本方案描述了从成年、幼年、幼虫期及胚胎期斑马鱼（Danio...

用于电生理研究的成年、幼年、幼虫及胚胎斑马鱼心脏和血管平滑肌细胞的分离

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成年斑马鱼器官的解剖

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