Name: 多色流流式细胞仪分析细胞在恒河猴的免疫应答 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 学习多色流式细胞术分析恒河猴外周血单个核细胞的方法，用于HIV/AIDS疫苗研究中CD4+和CD8+ T细胞亚群的表型与功能表征。该技术可精确识别细胞表面标志物和胞内细胞因子表达。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pramod Nehete 博士和 Bharti Nehete 女士提供了猕猴血液和外周血单个核细胞（PBMC）样本；本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 AI 46969 的资助，所有细胞培养基均由中央培养基实验室制备，该实验室由 NIH 基金项目 CA 16672 资助。

对总T细胞及其记忆亚群进行详细表型和功能分析的步骤可分为四个部分：1）细胞准备与抗原刺激，2）表面标志物染色，3）细胞内细胞因子染色，以及4）流式细胞术分析。
1. 细胞准备与抗原刺激
<ol>
	<li>本方案中使用了新鲜分离以及冻存的外周血单个核细胞（PBMC）。PBMC 通过 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法（Histopaquen-1077，Sigma-Aldrich，ST. Louis，MO）从恒河猴肝素化或枸橼酸抗凝的静脉血样本中分离获得。PBMC 分装后以 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜保存于液氮中。</li>
	<li>使用冻存 PBMC 时，将冻存管从液氮中取出，在 37 °C 水浴中迅速解冻，轻柔混匀，用 RPMI-1640 培养基（HyClone Laboratories，Logan，UT）洗涤以去除冻存液，重悬于完全培养基 [CM；RPMI-1640 加 10% 热灭活胎牛血清（HyClone Laboratories）、2 mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）、100 U/ml 青霉素/链霉素（Invitrogen）]，并在 37 °C、湿润的 5% CO2 环境中接种于 6 孔组织培养板中过夜培养。次日早晨，采用台盼蓝染色排除法测定活细胞数量，并将细胞重悬于完全培养基中。</li>
	<li>细胞根据非特异性刺激与抗原特异性刺激的不同方式进行处理，随后进行细胞因子分析：（a）非特异性刺激使用佛波酯 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯（PMA）和离子霉素（I）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO），取 0.1 ml 细胞悬液（每孔 1.0 × 106 个细胞）接种于 96 孔组织培养板（BD Biosciences，Franklin Lake，NJ）的各个孔中。PMA 和离子霉素的终浓度分别为 50 ng/ml 和 500 ng/ml。96 孔组织培养板每孔的终体积为 0.2 ml；（b）抗原特异性刺激时，将 1.0 × 106 个细胞溶于 1.0 ml 体积中接种于 24 孔组织培养板（BD Biosciences，Franklin Lake，NJ）的各个孔中，其中各孔已按先前方法稍作修改进行预处理9。简言之，24 孔组织培养板每孔加入 2.5 μg/ml 的山羊抗小鼠 IgG（H + L）抗体（Kierkegaard and Perry Laboratory，Gaithersburg，MD）溶于 50 mM Tris 溶液（pH 8.6）中，4 °C 包被过夜。次日早晨用无菌 PBS 洗涤两次，每孔加入共刺激单克隆抗体 CD49d（克隆号 9F10，BD Biosciences；San Jose，CA），终浓度为 10 μg/ml，37 °C 孵育 1 小时。孵育后，室温下用无菌 PBS 洗涤两次。加入目标抗原（包括六种 HIV 包膜肽的混合物8），每种肽的终浓度为 10 μg/ml。另设仅含完全培养基的细胞孔作为阴性对照。24 孔组织培养板每孔的终体积为 1.0 ml。</li>
	<li>细胞在 37 °C、湿润的 5% CO2 环境中培养 6 小时。在刺激的最后 4.5 小时，向培养体系中加入布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO），终浓度为 10 μg/ml。随后将细胞转移至 5 ml 聚丙烯管中，用冷（4 °C）流式洗涤缓冲液（不含 Ca2/Mg2 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS；Life Technologies，Rockville，MD）加 2% 热灭活胎牛血清）洗涤，然后进行后续荧光标记抗体染色处理。</li>
</ol>
2. 免疫荧光表面标志物染色
<ol>
	<li>刺激后的细胞首先在4°C避光条件下，用1 µL活/死可固定Aqua荧光反应性染料染色30分钟，然后用冷流式洗涤缓冲液洗涤一次。</li>
	<li>随后，向细胞中加入以下经适当滴定的荧光标记单克隆抗体：抗CD3 PE-Cy7（SP34-2）、抗CD8 Alexa700（RPA-T8）、抗CD28 PerCP-cy5.5（L293）、抗CD95 APC（DX2）和抗CD4 Pacific Blue（OKT4），上述抗体均购自BD Biosciences（Franklin Lakes, NJ），其中CD4 Pacific Blue（OKT4）来自eBioscience（San Diego, CA）。细胞在4°C避光孵育30分钟。</li>
	<li>每次实验均使用补偿对照和荧光减一（FMO）对照10,11。补偿对照用于确定每种单独染料对其他检测通道的溢出系数。补偿对照管中，采用来自一只猴子的细胞悬液，分别单独使用荧光偶联的单克隆抗体进行单色染色。FMO是指包含所有染料但缺少目标染料的多色染色组合，用于通过复制完全染色样本中的自发荧光水平和背景信号，确定阳性与阴性细胞群之间的界限。</li>
	<li>染色后的细胞用冷流式洗涤缓冲液洗涤，随后在固定/破膜溶液（BD Biosciences；San Jose, CA）中固定至少10分钟（此步骤中细胞可在4°C避光条件下保存过夜），然后进行胞内细胞因子染色。</li>
</ol>
3. 胞内细胞因子染色
<ol>
	<li>固定后的细胞用流式洗涤缓冲液洗涤，然后根据生产商的说明书加入破膜/洗涤缓冲液（BD Biosciences；San Jose, CA）。简言之，细胞在0.1 ml的1×破膜/洗涤缓冲液中于4°C避光孵育10分钟。</li>
	<li>随后，细胞在4°C避光条件下与适当滴定浓度的FITC标记抗IFN-γ抗体（B27）和PE标记抗IL-2抗体（MQ1-17H12）孵育60分钟。</li>
	<li>然后用破膜溶液再洗涤细胞两次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，细胞重悬于含1%多聚甲醛的DPBS中，并在24小时内进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
4. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>使用 LSR II 流式细胞仪（BD Biosciences；San Jose, CA）或 CyAn ADP（Dako, Carpinteria, CA）获取染色后的细胞。流式细胞术数据采用 FlowJo 软件（Tree Star, Ashland, OR）进行分析。</li>
	<li>图 1 展示了用于分析代表性动物中不同 T 细胞亚群的设门策略。首先通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）圈选淋巴细胞，随后根据 SSC 及活细胞染料阴性群体确定活淋巴细胞。接着通过 CD3 表达阳性鉴定 T 细胞，然后在 CD3+ T 细胞群体中进一步识别 CD4+ CD8-（CD4+ T 细胞）和 CD4- CD8+（CD8+ T 细胞）亚群。根据文献报道5, 10，CD4+ 和 CD8+ T 细胞再依据 CD28 和 CD95 的表达进一步划分为不同亚群：初始型（Tn, CD28+ CD95-）、中央记忆型（Tcm, CD28+ CD95+）和效应记忆型（Tem, CD28- CD95+）细胞。</li>
	<li>图 2 展示了如何评估 CD4+ 和 CD8+ T 细胞不同亚群在 PMA 与离子霉素（PMA+I）刺激下产生细胞因子（INF-γ 和/或 IL-2）的功能能力。</li>
</ol>
5. 代表性流式细胞术数据
采用流式细胞术分析确定了食蟹猴外周血单个核细胞（PBMC）的组成。图1展示了来自一只代表性动物的不同T细胞亚群分析所使用的设门策略。首先通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）对淋巴细胞进行设门，随后根据SSC及Aqua染料阴性群体确定活淋巴细胞。接着通过CD3的表达鉴定T细胞，并在CD3+ T细胞群体中进一步确定CD4+ CD8-（CD4+ T细胞）和CD4- CD8+（CD8+ T细胞）亚群。如图2所示，根据CD28和CD95的表达情况，将CD4+和CD8+ T细胞进一步划分为不同的亚群：初始型（Tn, CD28+ CD95-）、中央记忆型（Tcm, CD28+ CD95+）和效应记忆型（Tem, CD28- CD95+）细胞。图2A展示了未刺激及PMA/离子霉素刺激条件下CD4+ T细胞及其各亚群中INF-γ和IL-2的产生情况，图2B展示了相同条件下CD8+ T细胞及其各亚群中INF-γ和IL-2的产生情况。请注意，各亚群经刺激后表现出不同的细胞因子谱型。
<img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="流式细胞术设门图 CD3+, CD8+, CD4+；T细胞、淋巴细胞分析、免疫谱型分析。" border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1. 用于恒河猴外周血单个核细胞（PBMC）组成流式细胞术分析的设门策略。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="流式细胞术图显示T细胞亚群；PMA/ION刺激下IL-2和IFN标志物分析。" border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="流式细胞术点图；IL-2对比IFN-γ；T细胞亚群；PMA/IONO刺激组与对照组。" border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 2b"> 图2. (A) 总CD4+ T细胞及其亚群的细胞因子产生谱。(B) 总CD8+ T细胞及其亚群的细胞因子产生谱。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">点击此处</a>查看图2a的放大版本，<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">或点击此处</a>查看图2b的放大版本。

<ol><li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li>
<li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+CD8%2B+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li>
<li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li>
<li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li>
<li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li>
<li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li>
<li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Primatol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li>
<li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cell+responses+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li>
<li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13-parameter+flow+cytometry%3A+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype%2C+function%2C+and+T-cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;溶液与缓冲液&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;李&gt;Ficoll-Hypaque（Histopaquen-1077，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;RPMI-1640 培养基（HyClone Laboratories，Logan，UT）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;胎牛血清（FBS），（HyClone Laboratories，洛根，犹他州）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;青霉素/链霉素（Invitrogen；Carlsbad, CA）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;台盼蓝试剂（Sigma-Aldrich；St. Louis, MO）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;50 mM Tris，pH 8.6；过滤后于4℃保存 &amp;deg;C&lt;/li&gt; &lt;李&gt;杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS，无钙无镁；Life technologies，Rockville，MD）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;流式洗涤缓冲液：含2% FBS的DPBS，4℃保存 &amp;deg;C&lt;/li&gt; &lt;李&gt;BD Cytofix/Cytoperm 固定/破膜溶液试剂盒（BD Biosciences；美国加利福尼亚州圣何塞）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p 类=&quot;jove_step&quot;&gt;激活剂&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;李&gt;佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO） &lt;/li&gt; &lt;李&gt;Ionomycin（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;共刺激单克隆抗体 CD49d，克隆株 9F10（BD Biosciences；加利福尼亚州圣何塞） &lt;/li&gt; &lt;李&gt;山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体 F(ab')2 片段（经亲和纯化），Kierkegaard 和 Perry 实验室（美国马里兰州盖瑟斯堡）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;特异性激活剂可包括肽段混合物、单个肽段或完整蛋白质&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;细胞因子分泌抑制剂&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;李&gt;布雷菲德菌素A（Brefeldin A，BFA，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;Golgi Plug 可替代使用（BD Biosciences；San Jose, CA）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;抗体&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;李&gt;活/死可固定蓝色荧光染色试剂盒（Invitrogen；Carlsbad，CA）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;CD3 PE-Cy7（SP34-2），（BD Biosciences；San Jose，CA）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;CD4 太平洋蓝（OKT4），eBiosciences（美国加利福尼亚州圣地亚哥）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;CD8 Alexa700（RPA-T8），（BD Biosciences；San Jose，CA） &lt;/li&gt; &lt;李&gt;CD28 PerCP-cy5.5（L293）（BD Biosciences；San Jose, CA）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;CD95 APC（DX2）（BD Biosciences；San Jose，CA）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;IFN- FITC (B27)，（BD Biosciences；San Jose，CA）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;IL-2 PE（MQ1-17H12），（BD Biosciences；San Jose，CA）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

食蟹猴模型目前是研究艾滋病病毒-艾滋病发病机制以及疫苗和治疗药物开发的最佳可用模型。1,2,3. 本文介绍了一种用于详细分析细胞免疫应答表型与功能的方法，特别是针对 CD4+ 和 CD8+ T 细胞及其各自记忆亚群的细胞内细胞因子产生情况。我们通过使用佛波酯（PMA）联合离子霉素（ionomycin, PMA+I）刺激恒河猴外周血单个核细胞（PBMC），精确测定了 CD4+ 和 CD8+ T 细胞中干扰素γ（INF-γ）和白细胞介素（IL）-2 产生的定量与定性指标。不同记忆T细胞亚群的细胞因子谱存在差异。此外，该方案具有足够灵敏度，可检测经本实验室研发的HIV包膜肽混合疫苗免疫后的恒河猴PBMC样本中极少量的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞亚群。多色流式细胞术是一种精确鉴定T细胞不同亚群的强大工具4,5具有产生细胞因子的能力6非特异性或抗原特异性刺激后5,7.

我们展示了多色流式细胞术在恒河猴中对CD4+和CD8+ T细胞的总群体及其记忆亚群进行详细表型和功能特征分析的应用价值，恒河猴是进行艾滋病疫苗研究的理想模型。

目前，恒河猴模型是研究艾滋病病毒致病机制以及开发……的最佳可用模型。

本视频演示了刺激和染色外周血单个核细胞（PBMC）的实验步骤。为了进行多色流式细胞术分析，将从全血中分离得到的PBMC置于组织培养板中。通过化学或生物学方法刺激细胞，以诱导其产生免疫应答。刺激后，加入抗体混合物，以根据细胞表面标志物的表达来鉴定细胞类型。随后对细胞进行透化处理，并加入另一组抗体混合物，以检测细胞内细胞因子的表达，然后通过流式细胞术分析细胞，确定外周血单个核细胞（PBMC）特定亚群的细胞因子谱型。大家好，我是艾米·考特尼（Amy Courtney），来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心免疫学系贾甘·萨斯（Jagan SAS）博士的实验室。大家好，我是来自实验室的Hong her。今天我们将向您展示一种T细胞反应的多重细胞分析技术。我们在实验室中使用该方法来研究恒河猴（Reus Maca）的细胞免疫反应。那么我们开始吧。首先使用血细胞计数板，通过台盼蓝染料排斥法测定来自Reuss Maca的外周血单个核细胞（pbmc）的活细胞数量。操作过程需在层流罩中进行。将细胞重悬于完全培养基中，浓度为每毫升1000万个细胞，取100微升细胞悬液加入96孔组织培养板的每个孔中，用于非特异性刺激。然后加入100微升含有PMA和CIN的培养基，使总体积达到0.2毫升，终浓度为50纳克/毫升PMA和500纳克/毫升CIN；对于阴性对照孔，则每孔仅加入100微升完全培养基。加样后，将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育1.5小时。向培养物中加入终浓度为10微克/毫升的佛波酯A（felden A），并在37°C下继续孵育4.5小时。加入佛波酯A可激活细胞内的细胞因子，使其在金G装置（gold G apparatus）中通过免疫染色更易被检测。刺激完成后，离心去除培养基，然后加入200微升冷的流式洗涤缓冲液，低速离心。重复洗涤一次，最后重悬于50微升流式洗涤缓冲液中。细胞现已准备好进行表面标志物染色，可将染色试剂加入重悬细胞的每个孔中。根据生产商的说明书，向每孔加入1 µL可固定的活死细胞蓝色荧光反应性染料。在细胞孵育期间，于4°C避光孵育30分钟。准备将在微管中用于染色的溶液。首先，配制一种混合染色液，其中应包含以下适当成分：滴定过的荧光标记单克隆抗体，抗 CD3 PE-Cy7、抗 CD8 Alexa 700、抗 CD28 PerCP-Cy5.5、抗 CD95 APC 以及抗 CD4 Pacific Blue，并加入流式洗涤缓冲液。接下来，制备补偿对照，通过为每种荧光标记抗体单独制备单色染色管，用于确定每种染料对其他检测通道的溢出系数。最后，制备荧光减一（FMO）对照，将所有试剂组合在一起，仅缺少待检测的目标试剂。该对照将用于确定阳性与阴性群体之间的界限，通过模拟完全染色样本中的自发荧光水平和数据来实现。细胞在活死染料中孵育后，用冷的流式洗涤缓冲液洗涤一次，以去除多余的染料，吸去洗涤缓冲液。然后加入配制好的染色溶液，在4°C避光条件下孵育30分钟。用预冷的流式洗涤缓冲液洗涤染色后的细胞，以去除多余的抗体。然后加入100微升BD固定破膜溶液，孵育至少10分钟。将细胞在4°C避光条件下保存，最长可保存24小时，直至后续使用；或继续进行细胞内细胞因子的标记。首先在 100 微升 1 × 破膜缓冲液中对细胞进行透化处理。将细胞在 4°C 避光孵育 10 分钟，同时在 1 × 破膜洗涤缓冲液中制备染色抗体、补偿对照和 FMO 对照，方法同前。细胞孵育10分钟后，离心并弃去一倍体积的破膜洗涤缓冲液。加入适量的染色抗体。随后，在避光条件下，于4°C将细胞与抗体共同孵育60分钟。用透化溶液洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于含1%多聚甲醛的DPBS中以固定细胞。将细胞置于4°C避光保存，最多可保存24小时，直至使用。细胞染色后，使用 LSR 两色流式细胞仪或 Cyan ADP 流式细胞仪进行检测。然后使用 FlowJo 或类似软件分析数据。采用流式细胞分析法测定雷氏马卡中的外周血单个核细胞（PBMC）组成。该图展示了一个代表性动物的不同T细胞亚群分析所采用的设门方案。首先通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）对淋巴细胞进行设门，然后根据SSC及AQUA染色阴性群体确定活淋巴细胞。T细胞通过CD3表达进行鉴定，并在CD3阳性T细胞群体中进一步确定CD4阳性、CD8阴性群体以及CD4阴性、CD8阳性群体。根据CD28和CD95的表达情况，将CD4阳性与CD8阳性T细胞进一步区分为不同的亚群，即初始型、中央记忆型和效应记忆型细胞。该图显示了未刺激以及PMA/离子霉素刺激条件下，CD4阳性T细胞及其亚群中干扰素γ和IL-2的产生情况。注意不同细胞亚群在刺激后产生的独特细胞因子谱。我们将向您展示如何对 PBMC 进行多色流式细胞术分析。进行此操作时，务必要记住设置单色补偿对照和荧光减一对照。这两种对照对于流式细胞术数据的正确分析都至关重要。有关选择补偿对照的更多信息，请参阅我们的书面实验方案。此外，请注意在使用荧光标记抗体时，必须遮盖样品以避免光照。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

多色流流式细胞仪分析细胞在恒河猴的免疫应答

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B...

一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法

介绍了一种通过将II-45间皮瘤细胞植入免疫功能正常大鼠的胸膜腔来建立胸膜恶性间皮瘤原位大鼠模型的方法。同时还描述了一种流式细胞术方法，可用于从25...

II-45同系大鼠间皮瘤模型中的原位移植及外周免疫细胞监测

本文介绍了一种优化的实验方案，用于计数和表征恒河猴抗艾滋病病毒的CD8+ T细胞。该文章不仅对HIV免疫学领域具有重要价值，也适用于其他已知CD8+...

通过肽-MHC-I 四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性 CD8+ T 细胞

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+...

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

本文描述了一种从人外周血中分离和鉴定CD4+ T细胞亚群的实验方案。通过流式细胞术分析纯化的CD4+...

从外周血中分离CD4+ T细胞并利用六色流式细胞术分析循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）亚群

本文介绍一种流式细胞术方案，仅使用两种荧光染料而非七种，即可鉴定人外周血中的CD4+和CD8+ T细胞、γδ...

通过双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群

本研究展示了如何使用流式细胞术检测由 FcγR 激活引发的活性氧（ROS）产生。该方法可用于评估吞噬细胞在免疫复合物、调理微生物或直接 FcγR...

流式细胞术检测FcγR交联诱导的巨噬细胞ROS产生

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。...

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。...

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

钙离子内流是T细胞信号传导的指标，可用于有效分析T细胞受体刺激后的反应。该方案利用全光谱流式细胞术高度灵活的检测能力，将Indo-1与针对细胞表面分子的多色抗体组合进行多重检测。...

通过全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流

学习多色流式细胞术分析恒河猴外周血单个核细胞的方法，用于HIV/AIDS疫苗研究中CD4+和CD8+ T细胞亚群的表型与功能表征。该技术可精确识别细胞表面标志物和胞内细胞因子表达。

多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

探索更多视频