多色流流式细胞仪分析细胞在恒河猴的免疫应答

该视频演示了刺激和染色外周血单核细胞或 PBMC 的程序。对于多色流式细胞术分析，将从全血中分离的 pbmc 的 Alec Watts 置于组织培养板中。细胞受到化学或生物刺激以产生免疫反应。

刺激后，添加抗体混合物以根据表达的表面标志物识别细胞类型。然后渗透细胞并添加不同的抗体混合物以检测细胞内细胞因子的表达，然后通过事实分析细胞以确定 PBMC 特定亚群的细胞因子谱。大家好，我是来自德克萨斯大学 MB 安德森癌症中心免疫学系 Jagan SAS 博士实验室的 Amy Courtney。

嗨，我是来自实验室的 Hong her。今天，我们将向您展示 T 细胞反应的多细胞术分析。我们在实验室中使用该程序来研究麦卡中的细胞免疫反应。

那么让我们开始吧。使用血细胞计数器开始该方案，通过 Trian Blue 染料排除方法确定来自罗伊斯玛卡的 pbmc 的活细胞计数。在层流罩 reus 中工作。

细胞悬浮在浓度为每毫升 1000 万个细胞的完全培养基中，以 100 微升细胞悬液进行非特异性刺激，放入 96 孔组织培养板的每个孔中。然后加入 100 微升含有 PMA 和 CIN 的培养基，使总体积达到 0.2 毫升，终浓度为 50 纳克/毫升 PMA，阴性对照孔为 500 纳克/毫升 CIN，每个孔单独添加 100 微升完全培养基。1.5 小时后，将细胞在 37 摄氏度下在加湿的 5% 二氧化碳气氛中孵育。

将 felden A 以 10 μg/mL 的终浓度添加到培养物中，然后再孵育 4.5 小时。将 felden A 添加到 gold G 装置中的 trapp 细胞因子中，以提高免疫染色的可见度，然后刺激离心以去除培养基，然后通过加入 200 μL 冷流洗涤液、缓冲液和低速离心进行洗涤。重复此洗涤，然后重新发送 50 μL 流式洗涤缓冲液。

细胞现在已准备好进行染色，以便在重悬细胞的每个孔中表达表面标志物。加入一微升根据制造商和 S 说明制备的活死可固定水荧光活性染料。在细胞孵育期间，在 4 摄氏度下避光孵育 30 分钟。

准备将用于微管中事实的染色溶液。首先，准备一杯常设鸡尾酒，适当地包括以下内容。滴定荧光标记的单克隆抗体、抗 CD 3、PE SCI 7、抗 CD 8、抗 CD 700、抗 CD 28（符合 CCP SCI 5.5）、抗 CD 95 A PC 和抗 CD 4 Pacific Blue Inflow 洗涤缓冲液。

接下来，准备补偿对照，通过将每种荧光偶联抗体的试管单独制备为单色染色剂，用于确定每种染色剂到其他检测器中的溢出系数。最后，通过混合除感兴趣的试剂之外的所有试剂来制备荧光减一或 FMO 染色剂。这将用于通过复制完全染色样品中存在的自发荧光水平和数据来确定阳性和阴性群体之间的边界。

细胞在活死染色剂中孵育后，用冷流洗涤缓冲液洗涤一次以去除多余的染料，吸出洗涤缓冲液。然后加入准备好的染色溶液。将细胞在 4 摄氏度下避光孵育 30 分钟。

用冷流洗涤缓冲液洗涤染色细胞以去除多余的抗体。然后加入 100 μL BD 固定渗透液至少 10 分钟。将细胞在 4 摄氏度下避光储存长达 24 小时，直到它们被使用或继续标记细胞内细胞因子以标记细胞内细胞因子。

首先在 100 μL 的 1 X 次渗透中渗透细胞。洗涤缓冲液：在细胞孵育期间，在 4 摄氏度下避光孵育 10 分钟。像以前一样，在一个 x perm 洗涤缓冲液中准备染色抗体、补偿对照和 FMO 对照。

细胞孵育 10 分钟后，离心并去除 1 x perm 洗涤缓冲液。添加适当的染色抗体。然后，在孵育后，将细胞和抗体在 4 摄氏度下避光孵育 60 分钟。

用渗透溶液洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，复苏将细胞悬浮在 DPBS 中的 1% 多聚甲醛中以固定细胞。将细胞在 4 摄氏度下避光储存，直到使用长达 24 小时。

细胞染色后，使用 LSR 双流式细胞仪或青色 DP 流式细胞仪进行事实分析。然后使用 FlowJo 或类似软件分析数据。使用传真分析确定罗伊斯玛卡中的 PBMC 组成。

该图显示了用于分析代表性动物的不同 T 细胞亚群的门控方案。淋巴细胞首先通过前向散射 FSC 与侧向散射 SSC 进行门控，然后根据 SSC 和 AQUA 阴性群体鉴定活淋巴细胞。然后通过 CD 3 表达鉴定 T 细胞 CD 4 阳性、CD 8 阴性和 CD 4 阴性 CD 8 阳性 CD 3 阳性 T 细胞群中的细胞群。

CD 28 和 CD 95 的表达，将 CD 4 阳性和 CD 8 阳性 T 细胞进一步区分为不同的亚群，作为初始中枢记忆和效应记忆细胞。该图显示了干扰素 γ 和 IL 2 在 Unstimulated 和 pma 中的产生。CIN 刺激 CD 4 个阳性 T 细胞和亚群。

注意刺激引起的不同细胞因子谱。在每个子集中。我们必须向您展示如何对 PBMC 进行多流式细胞术分析。

执行此过程时，请务必记住同时设置单色补偿控件和荧光减一控件。这两种控制对于正确分析流式细胞术数据都是必要的。请参阅我们的书面协议，了解有关选择补偿控制的更多信息。

此外，请记住，使用荧光标记抗体时，重要的是要覆盖样品以防止光照。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。