正确的蛋白浓度的动力学结构与功能分析和亲和力测定的重要性

本视频文章的总体目标是为以下两个问题提供答案。第一，能否通过测量蛋白质样品中实际能够与另一种蛋白质结合的分数来更可靠地研究蛋白质相互作用？第二，动力学分析如何让我们更好地了解结构、功能的关系？

这两个问题都将在涉及 Corp X 100 的实验中得到解决，Corp X 100 是一种无需使用标记即可实时检测蛋白质相互作用的仪器。本实验将检查牛胱抑素 B 与胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶的相互作用，复合物中两种蛋白质的晶体结构指向参与与蛋白酶结合的几个残基，以确定每个相互作用的残基如何影响胱抑素 B papin 相互作用。几种胱抑素 B 变体是通过定点诱变产生的。

在此类实验中，重组蛋白总是有可能无法正确折叠、聚集或变质，从而导致不正确和不可重复的结果。VIACORE X 100 能够通过免校准浓度分析（简称 CFCA）确定可结合的蛋白质组分。这种方法允许测定具有保留结合活性的蛋白质浓度，即使没有校准标准品。

此处将使用 CFCA 来确定胱抑素 B 变体的浓度。然后将这些数据用作确定胱抑素 B 变体与 Pepin 结合动力学的输入，这也使用 BOR X 100 进行评估。嗨，我是来自瑞典 GE Healthcare 的 CLA gram。

今天，我的同事 Eva Pool 将向您展示如何使用 BOR X 100 重组蛋白进行结构功能关系分析，随着时间的推移，重组蛋白可能会表现出不正确的折叠或松散的 bin 活性，并且这种行为无法通过依赖于总浓度测量的方法检测到。这实际上可能导致在通过免校准浓度分析进行浓度测量后出现不正确的动力学数据。BA 核心 X 100 用于分析胱抑素 B 变体与培烷相互作用的动力学和亲和力。

这些参数将深入了解绑定机制。我们首先简要说明实验设计，让我们开始吧。胱氨酸、蛋白酶、papin 和抑制剂胱抑素 B 之间的相互作用以疏水接触为主，复合物中两种蛋白质的晶体结构揭示了这一点。

从抑制剂侧，接触区域是 N 和 C 末端 Ns 和两个发夹环。在这项研究中，检查了四个突变体，每个突变体都含有半胱氨酸 3 到叙利亚突变，以防止胱抑素 B 二聚化，根据晶体结构中揭示的背景，亮氨酸 73 突变为甘氨酸，组胺 75 突变为甘氨酸，酪氨酸 97 变为丙氨酸。引入两个甘氨酸突变以检查组氨酸 75 和亮氨酸 73 侧链与 Pepin 结合的重要性，将酪氨酸残基突变为丙氨酸以研究胱抑素 B 和 Pepin 的 C 末端之间的相互作用。

测试三个双突变体以及 INE 三个到叙利亚单个突变体与木瓜蛋白酶 S 甲基 popin 的催化失活变体的相互作用。Proteus 的这种催化性非活性形式在活性裂隙中具有一个甲基，连接到 CYS 25。为简单起见，我们将在整个协议中将此变体称为 propan。

CFCA 依赖于在结合速率受分析物分子向表面扩散限制的条件下的结合速率测量。配体的高固定水平有利于这一点。在开始固定程序之前，将实验中使用的 HEPs 缓冲液放在左侧托盘上并插入两根管子。

此外，将一个空废液瓶放在右侧托盘上。然后将新的传感器石膏 5 插入仪器中，通过 core X 100 软件初始化，并在开始屏幕上单击 dock chip 工具项。点击 开始文档 在软件中。

接下来，使用固定向导设置间隙和固定化，方法是从开始屏幕将耦合对准审查 CM 5，单击其他选项按钮，然后选择向导。这将显示一个包含可用向导的窗口。选择 immobilization（固定），然后单击新按钮 在右下角，将出现 immobilization 向导的第一个屏幕：瞄准耦合传感器 gypsum 5 是默认设置。

选中流通池 2 下的框，将其固定在流通池 2 中。流通池 1 保持不变，以便将其用作以下三个可用选项中的参考表面。选中右侧目标级别上的指定联系时间框，更改为联系时间，将联系时间指定为 900 秒。

接下来，在 capture molecule slash ligand solution 下输入固定参数。进入木瓜蛋白酶。然后单击 Next。

下一个屏幕显示样品架的布局。位置 1 将保持乙醇胺，用于在配体木瓜蛋白酶瞄准偶联到芯片表面后使剩余的活性物质失活。将乙醇胺溶液插入位置 2 中的位置 1。

将配体木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶储存在过量的硫酸甲酯中，并在 10 毫摩尔乙酸钠缓冲液中以 50 μg/mL 的浓度补充。pH 值为 4.5 的溶液：用双蒸水将胺偶联试剂盒中的 EDC 和 NHS 偶联试剂重新配制，将 85 μL EDC 移液到小瓶中。盖上盖子并将其放在位置 3。

位置 4 的 NHS 使用相同的体积。请注意，文件 5 应封顶并为空，以便仪器在此文件中混合 ED、C 和 NHS。还要记住用新鲜的去离子水填充 H2O 位置的洗涤文件。

根据屏幕上的轮廓填充样品架后，单击 Load Samples（加载样品）并将样品架加载到仪器中。加载机架后，单击 Next。在运行开始之前，会显示一个清单。

确保所有要点都已满足。按下启动按钮即可开始运行。在固定过程中开始运行。

数据是实时收集的。首先，注入偶联试剂。接下来，将 pape 偶联到芯片表面，该过程以使剩余的活性酯失活而结束。

运行后，对话框窗口汇总了运行结果。在此窗口中，将显示固定级别。整个偶联过程应产生约 3000 RU 固定的木瓜蛋白酶。

一旦木瓜蛋白酶被固定在传感器芯片上，通过将胱抑素 B 突变样品稀释至至少 300 微升中约 10 纳摩尔的总浓度来开始 CFCA 分析。记录稀释因子，因为我们稍后将在分析设置中使用它。首先，在分析文件夹的浓度部分打开向导对话框，如上一节所述。

选择 calibration free （校准免费），然后选择 new （新建）。向导的第一个屏幕显示进样序列。由于此处使用了传感器芯片 CM 5 和直接固定测定方法，因此设置可以保持不变。

在下一个屏幕中单击 Next。选中 prime before run （运行前启动） 和 Run startup cycles （运行启动周期） 复选框。此外，将默认启动周期数保持为 3 不变。

在 solution 字段的名称中输入 heaps buffer。然后单击 Next。在下一个屏幕中，输入再生溶液的名称，即 20 毫摩尔氢氧化钠。

保持其他参数不变。单击 Next 查看示例表。根据样品表设置样品。

样本表中的每一行都会产生两个周期。一种流速为每分钟 10 微升，另一种流速为每分钟 100 微升。从空白开始运行。

然后输入名称、稀释因子、20 摄氏度时的扩散系数和分子量。对于每个突变体，可以使用产品网站上的网络工具计算扩散系数。软件的支持导航器中提供了指向此工具的链接。

由于建议运行每个样品并复制，因此请将整个表格从空白行复制到最后一个样品，并将其粘贴到表格底部。单击 下一步 以继续。下一个屏幕显示样品架。

根据软件概述的布局，将样品和试剂放入架子中。按下 Load samples（加载样品）按钮，将样品架装入仪器中。然后单击 Next。

加载样本后，将显示一个带有清单的提醒屏幕。确保检查所有内容，然后按开始。在运行期间实时收集数据。

运行完成后，关闭显示所收集数据的窗口。请注意，主窗口中出现了一个新的结果项。为了从数据中计算浓度，请选择新的结果项并单击 按钮。

通过 core X 100 进行评估。评估软件启动，从工具栏显示所有收集的数据，选择浓度分析，然后从菜单中选择免费校准。在第一个窗口中，选择要包含在分析中的数据。

滚动列表并逐步浏览视图列表，以查看所有样品的数据。如果要排除任何数据，请从列表中删除复选标记。单击 Next 开始计算。

拟合完成后，CFCA 交互模型会自动拟合到实验数据中，在结果窗口中报告每个样品的结果。通过选择表中的相应行来逐步浏览每个样品的接头。称为 measured concentration 的列显示被分析样品中的浓度。

原始样品中的浓度是使用之前输入的稀释因子计算的，完成后显示在计算浓度列中，单击完成保存结果。现在我们从 CFCA 分析中了解了蛋白质的浓度，我们为后续的动力学测量奠定了良好的基础。动力学分析现在将帮助我们了解关键氨基酸残基对结合机制的重要性。

让我们开始设置动力学分析。动力学分析首先将新的传感器芯片 CM 5 对接到开始屏幕中的仪器中。选择为 kinetic 的亲和力创建分析工作流程。

在左上角，会出现一个对话框窗口，可在其中输入有关配体的信息。在配体名称框中输入名称木瓜蛋白酶，然后从物种类型列表中选择另一种蛋白质。然后使用传感器芯片 CM 5 从介绍的两种替代配体连接方法中选择共价固定配体，推荐的检测工作流程现在在窗口右侧概述。

它从固定步骤开始，然后是检测步骤。按 continue 继续。根据要求输入名称并按 Save （保存） 来保存分析工作流程。

该软件现在概述了分析工作流程，并带有与每个步骤相关的按钮。传感器表面制备的第一步是找到移动 pH 值。由于此 pH 值已知，因此在出现的对话框中按 Enter known value。

输入缓冲液名称 acetate 和 pH 4.5，然后选择 save（保存）。检测工作流程现在更新了绿色复选标记，表示此步骤已完成。现在是时候固定了，按下固定步骤中的运行按钮。

这将显示与用于丙烷和固定化相同的向导，用于 CFCA 分析的 papin 固定化在此处以相同的方式设置，只是注入更稀的溶液的时间更短。这是为了固定较少的 papin，以避免胱抑素突变体的结合速率受到扩散限制的情况，以便可以孤立地测量动力学数据。由于配体名称和固定化 pH 值是在分析工作流程的前面步骤中输入的，因此此处都预设了这些名称。

唯一需要的更新是 50 秒的联系时间。然后如前所述进行固定。固定后的预期结合水平为 50 R ru。

run （运行） 按钮旁边的绿色复选标记表示固定已完成。接下来，在步骤的工作流中输入重新生成解决方案。通过在出现的对话框中单击 enter known values 来查找重新生成条件。

输入再生解决方案和接触时间。然后单击 Save （保存）。现在，配体已固定并输入了再生条件，所有内容都设置为在运行动力学亲和测定框中生成动力学数据，按下动力学的第一步，按下运行按钮。

Affinity 向导概述了单循环动力学的每个循环的注射顺序，此处使用，无需更改任何内容。单击 下一步 继续。在下一步中，保留指示运行前系统启动的默认设置。

选择运行一个启动周期以平衡芯片表面。接下来，定义样品的进样参数。由于之前指定了 regeneration solution 并且设置是预定义的，因此无需更改屏幕中的任何参数。

单击 Next。最后，指定样本。为每个突变变体输入两行，一行为空，另一行包含 sample。

通过将最高浓度参数设置为零来指示空白循环。二。胱抑素 B 变体可以适合每次运行。对于每个突变体，输入分子量、最高浓度和稀释因子，按 Next。

在以下屏幕中，概述了样品架。制备一系列稀释的蛋白质样品，并将带盖的小瓶放入架子上，如屏幕上所示，将装有缓冲液的小瓶放置在位置 13，将装有再生溶液的小瓶放置在位置 14。确保用淡水填充水位。

将样品架放入机器中，按下 load samples（加载样品）按钮加载样品，然后单击 Next（下一步）。与以前一样，在继续运行实验之前，通过按 start interaction data appear in real time 来执行最终检查。运行完成后，立即根据刚才演示的运行剩余的胱抑素 B 变体。

如果连续运行剩余的胱抑素 B 变体，请取消选中 step 中的相应复选框，以省略 prime step 和 startup cycle。每次运行完成后，都可以从链接访问数据。检测工作流程中的所有结果。

此时将显示一个对话框窗口，其中包含此工作流程中生成的所有结果。为了计算动力学速率常数，选择要评估的结果，然后按评估，因为核心 X 100 评估软件再次启动，显示所有集体数据。从工具栏菜单中选择 kinetics affinity。

在第一次筛选中，选择半胱氨酸 3 到 Syrian 突变体进行评估。通过单击，将显示来自此突变体的数据以及为此突变体执行的空白运行。下一个。下一个屏幕显示从含样本的运行中减去空白运行的数据。

选择通过单击 kinetics 按钮来评估 kinetics。现在选择将数据拟合到一对一交互模型。通过单击按钮 fit，拟合将在计算时显示在屏幕上。

准备就绪后，将自动应用质量控制并在底部突出显示。浏览质量控制项目，然后查看传感器图数据，以确保传感器图显示足够的曲率。此外，请查看残差图，其中显示了收集的数据和拟合模型之间的差异。

注意系统性和非随机偏差。这种契合是可以接受的。现在，请查看 report （报告） 选项卡中的动力学数据。

缔合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数。完成后，按 finish 对所有其他突变体重复相同的过程。以下是所检查的不同胱抑素 B 变体的 CFCA 分析代表性结果。

特异性结合浓度数据是从以每分钟 10 和 100 微升的流速获得的传感器克中提取的。将 2 次 80 测定测定的浓度与 CFCA 测定的浓度进行比较时，很明显，虽然在大多数情况下蛋白质对亮氨酸 73 甘氨酸变体具有完全活性，但活性蛋白质的分数非常低。使用单循环动力学确定胱抑素 B 变体与 pepin 结合的动力学。

传感器克显示空白和参考减去数据，其中一对一交互模型的动力学叠加在黑色上。CFCA 测量的亮氨酸 73 变体的特异性结合浓度仅为总蛋白浓度的 10% 左右，由 2 80 测量确定。当使用正确的浓度来计算动力学参数时，很明显 Lucien 73 的结合率与其他变体的结合率相似。

虽然突变体的结合速率与野生型蛋白的结合速率相当，但突变体的解离速率常数可以高出接近两个数量级，平衡解离常数相应增加。降低的亲和力主要取决于解离速率的增加，表明胱抑素 B 的第二个结合环和 C 末端都通过保持抑制剂附着在酶上来促进结合亲和力一旦复合物形成，使用无校准浓度分析对于该结论至关重要，因为其中一个突变体被证明具有非常低的结合活性， 我的同事 Pol 现在已经向您展示了如何在结构化函数研究中使用 bi core X 100。在进行这些实验时，重要的是要记住，尽管浓度和动力学分析都基于相同的结合程序，但实验条件却大不相同。