Name: 正确的蛋白浓度的动力学结构与功能分析和亲和力测定的重要性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: 学习使用无标记检测技术和校准自由浓度分析法（CFCA）测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体与木瓜蛋白酶的相互作用动力学。该方法可提高蛋白质活性测定可靠性，阐明结构功能关系。

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<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="显示三维折叠和结合位点的蛋白质结构示意图；对分子相互作用研究至关重要。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 复合物（蓝色）与木瓜蛋白酶（黄色）的三维结构。突变的半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 残基以红色显示。
1. 使用Biacore系统进行无标记相互作用分析的原理
在使用Biacore系统的典型无标记结合实验中，一种称为“配体”的生物分子被固定在传感器芯片表面。通过流路系统将与其结合的分子（称为“分析物”）引入并与芯片表面接触，从而进行检测。当分析物与配体结合时，表面累积质量的变化将通过表面等离子共振（SPR）技术被检测到。SPR信号响应值与结合的分析物量成正比。
由于结合过程是实时测量的，因此可以确定特定相互作用的动力学结合和解离速率常数。根据这些常数，可计算出平衡解离常数作为亲和力的指标。也可以通过稳态结合数据来计算亲和力。类似的方法还可用于确定特异性结合表面配体的蛋白质浓度。
2. 分析蛋白质-蛋白质相互作用的动力学特性
在 Biacore X100 中，可使用单周期动力学进行动力学分析。在单周期动力学实验中，分析物的一系列浓度在单个分析周期内依次注入，且各次注入之间无需再生传感器表面。因此，当难以找到合适的再生条件时，单周期动力学可实现动力学分析。
动力学实验数据收集完成后，Biacore X100 分析软件通过将数据拟合至相互作用模型，计算出 ka、kd 和 KD 的数值。
3. 测定蛋白质浓度的方法
分析生物分子之间的相互作用对于理解其功能至关重要。表征蛋白质与其他蛋白质、核酸或小分子的结合是生物化学研究的基础，并广泛应用于药物发现等多个领域。
为了准确测量两种相互作用蛋白之间的相互作用动力学，必须知道用作分析物的实验样品中特异性结合蛋白的浓度。通常使用分光光度计在 A280 处读数，或采用 Bradford 试剂等比色法测定总蛋白浓度。然而，蛋白杂质可能影响测定结果。更重要的是，总蛋白浓度中同时包含了蛋白的活性与非活性形式。特别是在重组蛋白的情况下，由于错误折叠可能导致蛋白失活，因此确定样品中特异性结合蛋白所占的百分比尤为重要。
在 Biacore X100 中，与特异性结合活性相关的浓度可以通过将结合响应水平与已知标准品建立的校准曲线进行比较来确定，也可以采用近期引入的无需校准品浓度分析法（Calibration-Free Concentration Analysis, CFCA）。CFCA 不依赖于标准品，因此在研究突变蛋白形式时特别有用，因为此类情况通常无法获得标准品。
在CFCA实验中，当样品向芯片表面扩散的速率是限速步骤时，需在不同流速下测定初始结合速率。根据初始结合速率计算特异性结合浓度时，需考虑分析物的扩散系数、流通池的尺寸以及流速等因素1,2。
在动力学实验中，分析物的浓度用于根据实验数据计算动力学结合速率常数和亲和力。CFCA 和 Biacore 系统中的动力学测量均依赖于相同的相互作用特性。因此，使用通过 Biacore 分析确定的特异性结合浓度，而非总蛋白浓度，可提高结果的可靠性。
4. 使用Biacore分析表征半胱氨酸蛋白酶抑制剂B与木瓜蛋白酶之间的相互作用
哺乳动物囊抑蛋白B是一种可逆、竞争性且紧密结合的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶抑制剂，主要抑制组织蛋白酶B、H、K、L和S。这些蛋白主要参与细胞内非选择性蛋白质降解。据推测，囊抑蛋白可保护细胞和组织免受这些酶介导的不当蛋白水解作用。它们还能使寄生虫和病毒来源的半胱氨酸蛋白酶失活，可能参与抵御此类病原体入侵的防御机制。此外，囊抑蛋白还可抑制多种植物来源的半胱氨酸蛋白酶，例如在结构-功能研究中常用作模型酶的木瓜蛋白酶。囊抑蛋白B与木瓜蛋白酶复合物的三维结构3显示，两种蛋白之间的相互作用主要由疏水接触介导，从抑制剂一侧来看，这些疏水接触由N端和C端以及两个发夹环提供（图1）。在本研究中，我们利用牛源囊抑蛋白B的点突变体，研究其C末端和第二个结合环在与木瓜蛋白酶结合过程中的重要性。首先测定所使用的四种囊抑蛋白B突变体以及野生型蛋白的特异性结合浓度。在确定了具有活性的囊抑蛋白B的特异性结合浓度后，采用Biacore X100测定野生型及突变型囊抑蛋白B与木瓜蛋白酶结合的反应速率常数和亲和力常数。
5. 仪器与试剂
<ol>
 <li>半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的变异体Cys3Ser/His75Gly、Cys3Ser/Leu73Gly、Cys3Ser/Tyr97Ala和Cys3Ser的制备方法如前所述4。所有突变体均在第3位点含有额外的半胱氨酸至丝氨酸取代，以防止形成二硫键连接的无活性半胱氨酸蛋白酶抑制剂B二聚体。</li>
 <li>木瓜蛋白酶靶标也按先前所述方法制备5。该靶标为S-(甲基硫代)木瓜蛋白酶（MMTS-木瓜蛋白酶），其活性裂隙中的Cys25位点连接有甲基硫代基团，使蛋白酶失去催化活性。</li>
 <li>使用Biacore X100结合Biacore X100 Plus软件包来测定和分析特异性结合浓度及结合动力学。</li>
 <li>使用Biacore胺偶联试剂盒将MMTS-木瓜蛋白酶固定在CM5传感芯片上。</li>
 <li>实验在25°C下进行，缓冲液组成为0.01 M Hepes（pH 7.4）、0.15 M NaCl、0.0034 M EDTA和0.05%聚山梨酯20。</li>
 <li>每种半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变异体之间，传感器表面以20 mM NaOH溶液、10 μl/min流速再生30秒。</li>
</ol>
6. 配体 MMTS-木瓜蛋白酶的固定化
用于CFCA分析的MMTS-木瓜蛋白酶共价连接
CFCA 依赖于在分析物分子向表面扩散受限（质量传输限制）的条件下测量结合速率。高配体固定化水平有利于实现这一条件。MMTS-木瓜蛋白酶的固定化使用 Biacore X100 控制软件中的固定化向导进行设置和运行。
<ol>
 <li>以10 μl/min的流速向流通池2中注入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与碳二亚胺（EDC）的混合溶液，活化表面7分钟。流通池1保持未修饰状态，作为参比表面使用。</li>
 <li>以5 μl/min的流速在pH 4.5的醋酸钠缓冲液中注入50 μg/ml的MMTS-木瓜蛋白酶溶液，持续15分钟。</li>
 <li>以10 μl/min的流速注入乙醇胺7分钟，以封闭剩余的活性酯基团。</li>
</ol>
整个偶联过程应在2号流通池中固定约3000 RU的MMTS-木瓜蛋白酶。
用于动力学分析的 MMTS-木瓜蛋白酶共价结合
用于固定 MMTS-木瓜蛋白酶以进行动力学分析的步骤与此相同，唯一的区别在于动力学分析中固定量需较低，以避免结合速率受扩散限制。在此步骤中，流路池1也保持未修饰状态，以便作为参比表面使用。
<ol start="4">
 <li>按照7.1步骤，用NHS和EDC混合物活化表面后，注入浓度为1μg/ml的MMTS-木瓜蛋白酶，持续50秒。随后按照步骤7.3注入乙醇胺，使表面失活。</li>
</ol>
此步骤后，偶联水平应约为 50 RU。
7. 使用 CFCA 检测法测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 的浓度
 <ol>
 <li>根据 Biacore X100 Plus 软件包中的 CFCA 向导设置 CFCA 实验。以 10 和 100 μl/min 的流速，分别重复注入约 10 nM 的蛋白质，持续 48 秒。每次循环之间用 20 mM NaOH 再生表面。</li>
 <li>为每个流速设置空白注入对照。</li>
 <li>然后使用 Biacore X100 Plus 软件包评估软件中的 CFCA 分析功能，从结合数据（图 3）中确定蛋白质浓度。 <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="野生型响应动力学图，传感图，时间 vs. RU，Fc=2-1，分子相互作用分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 野生型半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 的 CFCA 分析结果。从流速为 10 和 100 μl/min 时获得的传感图中提取出特异性结合浓度数据。 <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="通过 A280 和 CFCA 测量比较不同突变体蛋白质浓度的柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3. 通过 A280 测定（n=3）和 CFCA（n=2）确定的突变体浓度。标准误差以误差线表示。摩尔吸光系数的计算方法如文献 (6) 所述。可观察到 Cys3Ser/Leu73Gly 突变体通过两种方法测得的浓度值存在显著差异。</li>
 <li>将 A280 测定法与 CFCA 法测定的浓度进行比较，可以明显看出，尽管大多数情况下蛋白质完全具有活性，但对于 Cys3Ser/Leu73Gly 变体，其活性蛋白所占比例非常低（图 3）。下表显示了半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 各变体的活性与 A280 测得的总浓度之间的关系。
<table border="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>样品</td>
 <td>CFCA 相对于 A280 (%)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>野生型</td>
 <td>94</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cys3Ser/His75Gly</td>
 <td>101</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cys3Ser/Leu73Gly</td>
 <td>9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cys3Ser/Tyr97Ala</td>
 <td>99</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cys3Ser</td>
 <td>83</td>
	</tr>
</tbody>
</table> 
</li>
</ol>
8. 测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂B与木瓜蛋白酶结合的动力学
<ol>
	<li>根据 CFCA 测量结果，为每种半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体配制浓度范围为 2.5 至 40 nM 的两倍稀释浓度系列。</li>
 <li>使用 Biacore X100 中的动力学向导，采用单循环方法设置动力学实验。表面在每次进样之间不进行再生，而是在每个分析循环结束后使用 20 mM NaOH 作为再生溶液进行再生。</li>
 <li>设置实验时，使每个含样品的循环前后均包含一个空白循环，即注入缓冲液而非样品。</li>
 <li>使用 Biacore X100 中的动力学评估功能，在拟合 1:1 相互作用模型之前，自动对参考扣除数据进行空白扣除。</li>
 <li>半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体与木瓜蛋白酶结合的实验数据如图 4 所示。下表总结了动力学分析中获得的结合与解离速率常数以及平衡解离常数。
<table border="0">
<tbody>
<tr>
 <td>样品</td>
 <td>ka (M-1 s-1)</td>
 <td>kd (s-1)</td>
 <td>KD (M)</td>
</tr>
<tr>
 <td>野生型</td>
 <td>1.8 x 106</td>
 <td>0.41 x 10-3</td>
 <td>2.3 x 10-10</td>
</tr>
<tr>
 <td>Cys3Ser/His75Gly</td>
 <td>1.1 x 106</td>
 <td>1.7 x 10-3</td>
 <td>1.5 x 10-9</td>
</tr>
<tr>
 <td>Cys3Ser/Leu73Gly</td>
 <td>1.1 x 106</td>
 <td>23 x 10-3</td>
 <td>2.2 x 10-8</td>
</tr>
<tr>
 <td>Cys3Ser/Tyr97Ala</td>
 <td>1.7 x 106</td>
 <td>12 x 10-3</td>
 <td>7.1 x 10-9</td>
</tr>
<tr>
 <td>Cys3Ser</td>
 <td>0.9 x 106</td>
 <td>0.53 x 10-3</td>
 <td>5.8 x 10-10</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="表面等离子共振图；蛋白质结合响应比较；野生型与 Cys 突变体。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 图 4. 采用单循环动力学测定的半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体与 MMTS-木瓜蛋白酶结合的动力学曲线。传感器图显示了经空白扣除和参考扣除的数据，并叠加了黑色的 1:1 相互作用模型动力学拟合曲线。</li>
 <li>尽管突变体的结合速率与野生型蛋白相当（图 5，上图），但突变体的解离速率常数可高出近两个数量级，相应地平衡解离常数也增加（图 5，下图）。 <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="结合动力学与计算；结合/解离速率；突变体比较柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 图 5. 速率常数与亲和力常数的计算基于 CFCA 获得的浓度。图中展示了与突变相关的 ka、kd 和 KD 的变化。</li>
	<li>由于样品浓度是根据实验数据计算结合速率常数时的一个参数，因此其准确性至关重要。若使用 A280 测量值而非 CFCA 确定的浓度，可能会得出 Leu73 对结合速率具有重要影响的结论，因为其替换似乎导致结合速率比其他半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体慢约 10 倍。然而，在此情况下，CFCA 测得的特异性结合浓度仅占总蛋白的约 10%。当考虑这一因素后，可以明确 Leu73 的结合速率与其他变体相似。因此，CFCA 能够对 ka 和 KD 进行准确评估，从而实现对相互作用机制的正确解读。</li>
</ol>

<ol><li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li>
<li>Sigmundsson, K., Mâsson, G., Rice, R., Beauchemin, N., Öbrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules%3A+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li>
<li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain%3A+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li>
<li>Pol, E., Björk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+%28Stefin+B%29+for+inhibition+of+cysteine+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li>
<li>Björk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li>
<li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ProteinScience%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li>
</ol>

作者受雇于GE Healthcare，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

本研究中，为评估半胱氨酸蛋白酶抑制剂B与木瓜蛋白酶相互作用中第二结合环及C末端的重要性，制备了四种突变体及野生型半胱氨酸蛋白酶抑制剂B。该研究展示了利用Biacore X100测定特异性结合浓度并分析蛋白质-蛋白质相互作用动力学的优势与便捷性，有助于理解结构与功能之间的关系。我们发现，总蛋白浓度的测定无法揭示结合活性降低的蛋白变体，这在本研究中会导致结合亲和力和动力学参数测定出现显著测量误差。通过Biacore X100结合循环微量进样分析（CFCA）确定了半胱氨酸蛋白酶抑制剂B各变体的特异性结合浓度。将CFCA测得的浓度数据用于动力学分析，获得了可靠的速率常数和亲和常数，从而实现了对相互作用机制的正确解读。
突变体亲和力的降低几乎完全是由于 kd 值增加所致，而 ka 仅受到轻微影响。该现象表明，第二个结合环区域和C末端对抑制剂与木瓜蛋白酶结合速率并不重要，而是主要通过在复合物形成后使抑制剂保持与酶的结合，从而贡献于结合亲和力。

<table><tbody><tr><td>Biacore&amp;#8482; X100 系统</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1100-73</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Biacore&amp;#8482; X100 Plus 套件</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1007-98</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CM5 传感器芯片</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-14</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td></td></tr><tr><td>乙酸盐缓冲液 pH 4.5，50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>HBS-EP+ 缓冲液 10X，4 × 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1008-26</td><td></td></tr><tr><td>塑料小瓶 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-87</td><td></td></tr><tr><td>橡胶盖，2 型</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1004-11</td><td></td></tr></tbody></table>

结构功能分析中蛋白质浓度准确性对动力学与亲和力测定的重要性

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

在本研究中，我们利用Biacore X100通过实时无标记分析方法，探究牛源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin B与一种无催化活性的植物半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶（papain）（图1）之间的相互作用。我们构建了多个在与木瓜蛋白酶相互作用区域含有单点突变的cystatin B变异体。针对每种cystatin B变异体，我们采用无需校准的标准品浓度分析法（CFCA）测定其特异性结合浓度，并将所得结果与通过A280. 之后，使用单周期动力学（SCK）测量每种半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体与木瓜蛋白酶结合的动力学。我们发现，在所检测的四种半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体中，有一种仅表现出部分结合活性。这种部分活性由CFCA揭示，表现为关联速率常数（ka）和亲和力（KD），相较于使用总蛋白浓度计算的值。在结构-功能研究中，将CFCA与动力学分析相结合，有助于获得可靠的结果，并帮助正确解读相互作用机制。

我们采用Biacore X100进行无标记蛋白质相互作用分析，通过动力学表征研究多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂B突变体与木瓜蛋白酶的结合，从而实现结构-功能分析。无校准浓度分析（CFCA）可在无需标准曲线的情况下，测定保持结合活性的蛋白质浓度。我们证明，利用CFCA确认浓度可提高动力学分析的可靠性，即使重组蛋白的活性降低，仍能可靠地测定其动力学常数。

在本研究中，我们探讨了牛源半胱氨酸蛋白酶抑制剂胱抑素B与一种无催化活性的木瓜蛋白酶（papain）形式之间的相互作用（图1），……

本视频文章的总体目标是回答以下两个问题：第一，通过测量蛋白质样品中实际能够与另一种蛋白质结合的部分所占比例，能否更可靠地开展蛋白质相互作用研究？第二，动力学分析如何帮助我们更好地理解结构与功能之间的关系？本实验将通过使用 Corp X 100 仪器来回答这两个问题，该仪器可在无需标记的情况下实时检测蛋白质相互作用。实验将研究牛胱抑素 B 与半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶之间的相互作用；已有两种蛋白质复合物的晶体结构研究表明，多个残基参与了与蛋白酶的结合。本研究旨在确定每一个相互作用残基对胱抑素 B 与木瓜蛋白酶相互作用的影响。通过定点诱变技术，制备了多种胱抑素 B 的变异体。在这些实验中，重组蛋白始终存在无法正确折叠、发生聚集或降解的可能性，从而导致错误且不可重复的结果。VIACORE X 100 能够通过无校准浓度分析（简称 CFCA）确定可用于结合的蛋白比例。该方法即使在缺乏校准标准品的情况下，也能测定仍保持结合活性的蛋白质浓度。此处将使用CFCA来测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体的浓度。随后，这些数据将作为输入用于确定半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体与Pepin结合的动力学参数，后者同样使用BOR X 100进行评估。大家好，我是来自瑞典GE Healthcare的CLA gram。今天，我的同事 Eva Pool 将向您展示如何使用 BOR X 100 进行结构-功能关系分析。重组蛋白可能会随着时间推移出现错误折叠或结合活性降低的情况，而依赖总浓度测量的方法无法检测到这种行为。这实际上可能导致在通过无校准浓度分析进行浓度测定后，获得错误的动力学数据。BOR X 100 用于分析半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体与木瓜蛋白酶相互作用的动力学和亲和力。这些参数将有助于揭示结合机制。我们首先简要介绍实验设计，现在开始。半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶（papain）与抑制剂半胱氨酸蛋白酶抑制剂B（cystatin B）之间的相互作用主要由疏水相互作用主导，这一点通过两种蛋白质复合物的晶体结构得以揭示。从抑制剂一侧来看，接触区域包括N端和C端的氮原子以及两个发夹环。本研究中检测了四种突变体，每种均引入了半胱氨酸3到丝氨酸的突变，以防止胱抑素B的二聚化。根据晶体结构揭示的背景，将73位的亮氨酸突变为甘氨酸，75位的组氨酸突变为甘氨酸，97位的酪氨酸突变为丙氨酸。引入两个甘氨酸突变是为了考察组氨酸75和亮氨酸73侧链与木瓜蛋白酶（Pepin）结合的重要性；将酪氨酸残基突变为丙氨酸则是为了研究胱抑素B的C末端与木瓜蛋白酶之间的相互作用。三种双突变体以及INE三个叙利亚单突变体均被用于检测其与一种催化失活的木瓜蛋白酶S甲基抑制素变体的相互作用。该蛋白酶的催化失活形式在其活性裂隙中的CYS 25位点连接有一个甲基基团。为简便起见，我们将在本方案中始终称此变体为propan。CFCA 依赖于在分析物分子向表面扩散受限的条件下测量结合速率。高配体固定化水平有利于实现这一条件。在开始固定化程序之前，将实验中使用的 HEPs 缓冲液置于左侧托盘上，并插入两根管路。同时将一个空的废液瓶放在右侧托盘上。然后插入一个新的传感器石膏5，并通过Core X 100软件进行初始化，在起始界面点击“芯片对接工具”项目。在软件中点击“开始对接”。接下来，使用固定化向导来设置固定化过程：从起始界面选择将偶联靶向 CM5 芯片的选项，点击“其他选项”按钮，然后选择“向导”。此时将显示一个包含可用向导的窗口。选择“固定化”向导，然后点击右下角的“新建”按钮，固定化向导的第一个界面将会出现，默认设置为靶向偶联至传感器芯片 CM5。勾选流动池二下方的复选框，以在流动池二中进行固定。流动池一保持未修改状态，以便从下方三个可用选项中将其用作参考表面。勾选右侧的“指定接触时间”复选框，目标级别将更改为接触时间，设定接触时间为900秒。接下来，在固定分子/配体溶液下输入固定化参数。输入木瓜蛋白酶。然后单击下一步。下一个界面将显示样品架的布局。第一个位置用于放置乙醇胺，以在配体木瓜蛋白酶与芯片表面偶联反应完成后，使剩余的活性位点失活。将乙醇胺溶液插入至第二个位置。将配体木瓜蛋白酶置于过量的硫酸甲酯中保存，并在10毫摩尔/升醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中稀释至每毫升含50微克。用双蒸水重悬胺偶联试剂盒中的EDC和NHS偶联试剂，用移液器吸取85微升EDC加入小瓶中。盖上盖子，并将其置于位置三。在第四位点使用相同体积的 NHS。注意第五个管必须盖紧且为空，以便仪器在此管中混合 ED、C 和 NHS。同时记得用新鲜的去离子水填充 H2O 位点的清洗管。按照屏幕上的示意图将样品架装填完毕后，单击“加载样品”，并将样品架装入仪器中。样品架装入后，单击下一步。在运行开始前，系统会显示一个检查清单。确保在满足条件时完成所有项目符号所列内容。通过按下启动按钮开始运行。在固定化过程中开始运行。数据实时采集。首先注入偶联试剂，然后将肽段偶联到芯片表面，最后使剩余的活性酯失活，完成整个过程。运行结束后，会弹出一个对话框窗口，总结此次运行的结果。在此窗口中将显示固定化水平。整个偶联过程应使约 3000 RU 的木瓜蛋白酶被固定。木瓜蛋白酶固定到传感器芯片后，开始进行CFCA分析，将半胱氨酸蛋白酶抑制剂B突变体样品稀释至总体积至少300微升，总浓度约为10纳摩尔。记录稀释倍数，因后续在分析设置中将使用该数值。首先，在分析文件夹的浓度部分，按照前文所述步骤调出向导对话框。选择“无校准”，然后选择“新建”。向导的第一个界面显示注射序列。由于此处使用的是 CM5 传感器芯片和直接固定化检测方法，因此设置可保持不变。在下一个界面中点击“下一步”。保持“运行前初始化”和“运行启动循环”复选框处于勾选状态。同时，将默认的启动循环次数保持为3次不变。在溶液名称字段中输入堆缓冲液。然后点击下一步。在下一个界面中，输入再生溶液的名称，即 20 毫摩尔的氢氧化钠。保持其他参数不变。单击下一步以查看样本表格。根据样本表格设置样本。样本表中的每一行将产生两个循环：一个以每分钟10微升的流速进行，另一个以每分钟100微升的流速进行。运行开始前先使用空白样品。然后输入稀释因子、20摄氏度时的扩散系数以及分子量。对于每个突变体，可使用产品网站上的网络工具计算其扩散系数。该工具的链接可在软件的支持导航器中找到。由于建议对每个样本进行重复检测，因此请将表格从空白行到最后一个样本的整行内容复制，并粘贴到表格底部。点击“下一步”以继续。下一个界面将显示样本架。根据软件指定的布局，将样本和试剂放入支架中。按下加载样本按钮，将支架载入仪器，然后单击下一步。加样后，将显示一个带有核对清单的提醒界面。请务必检查所有项目，然后按开始。运行过程中数据将实时采集。运行完成后，关闭显示所收集数据的窗口。观察到主窗口中已出现一个新的结果项。为根据数据计算浓度，请选中该新结果项，然后点击按钮。通过核心 X 100 进行评估。启动评估软件后，工具栏中将显示所有采集的数据，从菜单中选择浓度分析，然后选择无校准曲线法。在第一个窗口中，选择要包含在分析中的数据。滚动列表并依次浏览查看所有样本的数据。如果需要排除某些数据，请取消列表中的勾选。点击下一步以开始计算。当拟合完成后，CFCA相互作用模型会自动拟合到实验数据上，结果窗口中将报告每个样品的结果。通过选择表格中相应的行，依次查看每个样品的拟合结果。名为“测得浓度”的列显示了所分析样品中的浓度。原始样品中的浓度通过之前输入的稀释因子进行计算，结果将显示在“计算浓度”列中。完成后，单击“完成”以保存结果。现在我们已经获得了CFCA分析得到的蛋白质浓度，这为我们后续的动力学测量提供了良好的基础。接下来的动力学分析将有助于我们理解关键氨基酸残基在结合机制中的重要性。首先开始进行动力学分析的设置。在起始界面中，将新的CM5传感器芯片插入仪器，以启动动力学分析。选择创建用于动力学亲和力分析的检测流程。在左上角会出现一个对话窗口，用于输入配体的相关信息。在配体名称框中输入名称“papain”，并从物种类型列表中选择另一种蛋白质。然后从提供的两种配体固定方法中选择“使用CM5传感器芯片共价固定配体”，推荐的检测工作流程随即在窗口右侧显示出来。首先进行固定步骤，然后进行检测步骤。请按“继续”以进入下一步。根据提示输入名称并点击“保存”，以保存检测工作流程。软件现在通过与每个步骤关联的按钮来概述检测工作流程。传感器表面准备下的第一步是确定一个解离 pH 值。由于该 pH 值已知，请在出现的对话框中按下“输入已知值”。输入缓冲液名称“acetate”和 pH 4.5，然后选择保存。此时，检测流程将出现绿色对勾标记，表示此步骤已完成。接下来需要进行固定化，请在固定化步骤中按下运行按钮。这将打开与丙烷和CFCA分析中固定化所用相同的向导，此处用于木瓜蛋白酶的固定化以进行动力学分析，设置方法相同，只是注入的溶液浓度更低且注入时间更短。这是为了减少木瓜蛋白酶的固定量，避免半胱氨酸蛋白酶抑制剂突变体的结合速率受到扩散限制，从而能够独立测量动力学数据。由于配体名称和固定化pH已在检测流程的先前步骤中输入，因此这两项在此处均已预设。唯一需要的更新是将接触时间设为50秒。随后固定化步骤按之前所示进行。固定化后的预期结合水平为50 R ru。运行按钮旁的绿色对勾标记表示固定化已完成。接下来，在工作流程的步骤中输入再生溶液。通过单击弹出对话框中的“输入已知值”来查找再生条件。输入再生溶液及接触时间，然后点击保存。现在配体已固定，且再生条件已输入，所有设置已完成，可在运行动力学亲和力检测框中生成动力学数据，按下运行按钮以开始动力学实验的第一步。亲和力向导为单周期动力学的每个循环绘制了注射序列，此处使用该设置，无需更改任何内容。单击“下一步”继续。在下一步中，保持默认设置，表示运行前对系统进行预启动。选择运行一个启动循环，以平衡芯片表面。接下来，定义样品的进样参数。由于再生溶液此前已指定且设置为预定义模式，因此无需更改该界面中的任何参数。单击下一步。最后，指定样本。每种突变体变体输入两行，一行为空，另一行为含样本的行。通过将最高浓度参数设为零来表示空白循环。每次运行可拟合两种半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 的变体。对于每个突变体，输入分子量、最高浓度和稀释因子，然后按下一步。在接下来的界面中，已标出样品架的位置。请准备蛋白样品的稀释系列，并将带盖的小瓶按屏幕上所示放入样品架中。位置13放置含有缓冲液的小瓶，位置14放置含有再生溶液的小瓶。请确保用水位置加入新鲜的水。将样品架放入仪器中，通过按下“加载样品”按钮加载样品，然后点击下一步。与之前相同，在按下“开始”按钮运行实验前，进行最终检查，相互作用数据将实时显示。运行结束后，立即按照刚刚演示的方法，继续运行剩余的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体。如果依次运行其余的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变异体，则在步骤中取消选中相应的复选框，以跳过初始化步骤和启动循环。每次运行完成后，可通过链接访问数据。所有结果均位于检测工作流程中。此时会弹出一个对话窗口，显示在此工作流程中生成的所有结果。为了计算动力学速率常数，选择要评估的结果，然后按“评估”按钮，核心 X 100 评估软件将重新启动并显示所有汇总数据。从工具栏菜单中选择“动力学亲和力”。在第一个界面中，选择半胱氨酸三号位突变为丝氨酸的突变体进行评估。该突变体的数据将与为此突变体进行的空白运行结果一同显示，点击“下一步”继续。下一个界面显示的是从样品运行数据中减去空白运行数据后的结果。选择点击“动力学”按钮来评估动力学。然后选择将数据拟合到一对一相互作用模型。点击“拟合”按钮后，拟合结果将在计算过程中实时显示在屏幕上。准备就绪后，系统将自动应用质量控制并显示在底部。请逐一检查质量控制项目，然后查看传感器图谱数据，确保传感器图谱显示出足够的曲率。同时，请查看残差图，该图显示了采集数据与拟合模型之间的差异。注意系统性偏差和非随机偏差。该拟合结果可以接受。现在查看报告标签页中的动力学数据。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数。完成后，按“完成”按钮，并对所有其他突变体重复相同操作。以下是针对所检测的不同半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体的CFCA分析的代表性结果。从流速为 10 和 100 微升每分钟时获得的传感器图中提取特异性结合浓度数据。将通过两次 80 测量所确定的浓度与通过 CFCA 确定的浓度进行比较，可以明显看出，尽管在大多数情况下亮氨酸 73 甘氨酸突变体的蛋白完全具有活性，但活性蛋白的比例却非常低。使用单周期动力学方法测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 突变体与胃蛋白酶的结合动力学。传感器图显示了经过空白和参比扣除后的数据，并叠加了黑色的一对一相互作用模型动力学曲线。CFCA 测得的亮氨酸 73 变体的特异性结合浓度仅为通过双 80 测量确定的总蛋白浓度的约 10%。在计算动力学参数时使用正确浓度后，可以明显看出亮氨酸 73 的结合速率与其他变体相似。尽管突变体的结合速率与野生型蛋白相当，但其解离速率常数可高出近两个数量级，相应地导致平衡解离常数增加。亲和力的降低主要取决于解离速率的升高，这表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的第二个结合环和C末端均在复合物形成后通过维持抑制剂与酶的结合而共同贡献于结合亲和力。得出这一结论的关键在于采用了无需校准的标准浓度分析方法，因为其中一个突变体表现出极低的结合活性。我的同事Pol现已向您展示了如何在结构功能研究中使用bi core X 100。在进行这些实验时，重要的是要记住，尽管浓度分析和动力学分析均基于相同的结合过程，但两者的实验条件却有很大不同。

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