结构功能分析中蛋白质浓度准确性对动力学与亲和力测定的重要性

本视频文章的总体目标是回答以下两个问题：第一，通过测量蛋白质样品中实际能够与另一种蛋白质结合的部分所占比例，能否更可靠地开展蛋白质相互作用研究？第二，动力学分析如何帮助我们更好地理解结构与功能之间的关系？

本实验将通过使用 Corp X 100 仪器来回答这两个问题，该仪器可在无需标记的情况下实时检测蛋白质相互作用。实验将研究牛胱抑素 B 与半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶之间的相互作用；已有两种蛋白质复合物的晶体结构研究表明，多个残基参与了与蛋白酶的结合。本研究旨在确定每一个相互作用残基对胱抑素 B 与木瓜蛋白酶相互作用的影响。通过定点诱变技术，制备了多种胱抑素 B 的变异体。

在这些实验中，重组蛋白始终存在无法正确折叠、发生聚集或降解的可能性，从而导致错误且不可重复的结果。VIACORE X 100 能够通过无校准浓度分析（简称 CFCA）确定可用于结合的蛋白比例。该方法即使在缺乏校准标准品的情况下，也能测定仍保持结合活性的蛋白质浓度。

此处将使用CFCA来测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体的浓度。随后，这些数据将作为输入用于确定半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体与Pepin结合的动力学参数，后者同样使用BOR X 100进行评估。大家好，我是来自瑞典GE Healthcare的CLA gram。

今天，我的同事 Eva Pool 将向您展示如何使用 BOR X 100 进行结构-功能关系分析。重组蛋白可能会随着时间推移出现错误折叠或结合活性降低的情况，而依赖总浓度测量的方法无法检测到这种行为。这实际上可能导致在通过无校准浓度分析进行浓度测定后，获得错误的动力学数据。BOR X 100 用于分析半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 变体与木瓜蛋白酶相互作用的动力学和亲和力。

这些参数将有助于揭示结合机制。我们首先简要介绍实验设计，现在开始。半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶（papain）与抑制剂半胱氨酸蛋白酶抑制剂B（cystatin B）之间的相互作用主要由疏水相互作用主导，这一点通过两种蛋白质复合物的晶体结构得以揭示。

从抑制剂一侧来看，接触区域包括N端和C端的氮原子以及两个发夹环。本研究中检测了四种突变体，每种均引入了半胱氨酸3到丝氨酸的突变，以防止胱抑素B的二聚化。根据晶体结构揭示的背景，将73位的亮氨酸突变为甘氨酸，75位的组氨酸突变为甘氨酸，97位的酪氨酸突变为丙氨酸。引入两个甘氨酸突变是为了考察组氨酸75和亮氨酸73侧链与木瓜蛋白酶（Pepin）结合的重要性；将酪氨酸残基突变为丙氨酸则是为了研究胱抑素B的C末端与木瓜蛋白酶之间的相互作用。

三种双突变体以及INE三个叙利亚单突变体均被用于检测其与一种催化失活的木瓜蛋白酶S甲基抑制素变体的相互作用。该蛋白酶的催化失活形式在其活性裂隙中的CYS 25位点连接有一个甲基基团。为简便起见，我们将在本方案中始终称此变体为propan。

CFCA 依赖于在分析物分子向表面扩散受限的条件下测量结合速率。高配体固定化水平有利于实现这一条件。在开始固定化程序之前，将实验中使用的 HEPs 缓冲液置于左侧托盘上，并插入两根管路。

同时将一个空的废液瓶放在右侧托盘上。然后插入一个新的传感器石膏5，并通过Core X 100软件进行初始化，在起始界面点击“芯片对接工具”项目。在软件中点击“开始对接”。

接下来，使用固定化向导来设置固定化过程：从起始界面选择将偶联靶向 CM5 芯片的选项，点击“其他选项”按钮，然后选择“向导”。此时将显示一个包含可用向导的窗口。选择“固定化”向导，然后点击右下角的“新建”按钮，固定化向导的第一个界面将会出现，默认设置为靶向偶联至传感器芯片 CM5。

勾选流动池二下方的复选框，以在流动池二中进行固定。流动池一保持未修改状态，以便从下方三个可用选项中将其用作参考表面。勾选右侧的“指定接触时间”复选框，目标级别将更改为接触时间，设定接触时间为900秒。

接下来，在固定分子/配体溶液下输入固定化参数。输入木瓜蛋白酶。然后单击下一步。

下一个界面将显示样品架的布局。第一个位置用于放置乙醇胺，以在配体木瓜蛋白酶与芯片表面偶联反应完成后，使剩余的活性位点失活。将乙醇胺溶液插入至第二个位置。

将配体木瓜蛋白酶置于过量的硫酸甲酯中保存，并在10毫摩尔/升醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中稀释至每毫升含50微克。用双蒸水重悬胺偶联试剂盒中的EDC和NHS偶联试剂，用移液器吸取85微升EDC加入小瓶中。盖上盖子，并将其置于位置三。

在第四位点使用相同体积的 NHS。注意第五个管必须盖紧且为空，以便仪器在此管中混合 ED、C 和 NHS。同时记得用新鲜的去离子水填充 H2O 位点的清洗管。

按照屏幕上的示意图将样品架装填完毕后，单击“加载样品”，并将样品架装入仪器中。样品架装入后，单击下一步。在运行开始前，系统会显示一个检查清单。

确保在满足条件时完成所有项目符号所列内容。通过按下启动按钮开始运行。在固定化过程中开始运行。

数据实时采集。首先注入偶联试剂，然后将肽段偶联到芯片表面，最后使剩余的活性酯失活，完成整个过程。

运行结束后，会弹出一个对话框窗口，总结此次运行的结果。在此窗口中将显示固定化水平。整个偶联过程应使约 3000 RU 的木瓜蛋白酶被固定。

木瓜蛋白酶固定到传感器芯片后，开始进行CFCA分析，将半胱氨酸蛋白酶抑制剂B突变体样品稀释至总体积至少300微升，总浓度约为10纳摩尔。记录稀释倍数，因后续在分析设置中将使用该数值。首先，在分析文件夹的浓度部分，按照前文所述步骤调出向导对话框。

选择“无校准”，然后选择“新建”。向导的第一个界面显示注射序列。由于此处使用的是 CM5 传感器芯片和直接固定化检测方法，因此设置可保持不变。

在下一个界面中点击“下一步”。保持“运行前初始化”和“运行启动循环”复选框处于勾选状态。同时，将默认的启动循环次数保持为3次不变。

在溶液名称字段中输入堆缓冲液。然后点击下一步。在下一个界面中，输入再生溶液的名称，即 20 毫摩尔的氢氧化钠。

保持其他参数不变。单击下一步以查看样本表格。根据样本表格设置样本。

样本表中的每一行将产生两个循环：一个以每分钟10微升的流速进行，另一个以每分钟100微升的流速进行。运行开始前先使用空白样品。

然后输入稀释因子、20摄氏度时的扩散系数以及分子量。对于每个突变体，可使用产品网站上的网络工具计算其扩散系数。该工具的链接可在软件的支持导航器中找到。

由于建议对每个样本进行重复检测，因此请将表格从空白行到最后一个样本的整行内容复制，并粘贴到表格底部。点击“下一步”以继续。下一个界面将显示样本架。

根据软件指定的布局，将样本和试剂放入支架中。按下加载样本按钮，将支架载入仪器，然后单击下一步。

加样后，将显示一个带有核对清单的提醒界面。请务必检查所有项目，然后按开始。运行过程中数据将实时采集。

运行完成后，关闭显示所收集数据的窗口。观察到主窗口中已出现一个新的结果项。为根据数据计算浓度，请选中该新结果项，然后点击按钮。

通过核心 X 100 进行评估。启动评估软件后，工具栏中将显示所有采集的数据，从菜单中选择浓度分析，然后选择无校准曲线法。在第一个窗口中，选择要包含在分析中的数据。

滚动列表并依次浏览查看所有样本的数据。如果需要排除某些数据，请取消列表中的勾选。点击下一步以开始计算。

当拟合完成后，CFCA相互作用模型会自动拟合到实验数据上，结果窗口中将报告每个样品的结果。通过选择表格中相应的行，依次查看每个样品的拟合结果。名为“测得浓度”的列显示了所分析样品中的浓度。

原始样品中的浓度通过之前输入的稀释因子进行计算，结果将显示在“计算浓度”列中。完成后，单击“完成”以保存结果。现在我们已经获得了CFCA分析得到的蛋白质浓度，这为我们后续的动力学测量提供了良好的基础。接下来的动力学分析将有助于我们理解关键氨基酸残基在结合机制中的重要性。

首先开始进行动力学分析的设置。在起始界面中，将新的CM5传感器芯片插入仪器，以启动动力学分析。选择创建用于动力学亲和力分析的检测流程。

在左上角会出现一个对话窗口，用于输入配体的相关信息。在配体名称框中输入名称“papain”，并从物种类型列表中选择另一种蛋白质。然后从提供的两种配体固定方法中选择“使用CM5传感器芯片共价固定配体”，推荐的检测工作流程随即在窗口右侧显示出来。

首先进行固定步骤，然后进行检测步骤。请按“继续”以进入下一步。根据提示输入名称并点击“保存”，以保存检测工作流程。

软件现在通过与每个步骤关联的按钮来概述检测工作流程。传感器表面准备下的第一步是确定一个解离 pH 值。由于该 pH 值已知，请在出现的对话框中按下“输入已知值”。

输入缓冲液名称“acetate”和 pH 4.5，然后选择保存。此时，检测流程将出现绿色对勾标记，表示此步骤已完成。接下来需要进行固定化，请在固定化步骤中按下运行按钮。

这将打开与丙烷和CFCA分析中固定化所用相同的向导，此处用于木瓜蛋白酶的固定化以进行动力学分析，设置方法相同，只是注入的溶液浓度更低且注入时间更短。这是为了减少木瓜蛋白酶的固定量，避免半胱氨酸蛋白酶抑制剂突变体的结合速率受到扩散限制，从而能够独立测量动力学数据。由于配体名称和固定化pH已在检测流程的先前步骤中输入，因此这两项在此处均已预设。

唯一需要的更新是将接触时间设为50秒。随后固定化步骤按之前所示进行。固定化后的预期结合水平为50 R ru。

运行按钮旁的绿色对勾标记表示固定化已完成。接下来，在工作流程的步骤中输入再生溶液。通过单击弹出对话框中的“输入已知值”来查找再生条件。

输入再生溶液及接触时间，然后点击保存。现在配体已固定，且再生条件已输入，所有设置已完成，可在运行动力学亲和力检测框中生成动力学数据，按下运行按钮以开始动力学实验的第一步。

亲和力向导为单周期动力学的每个循环绘制了注射序列，此处使用该设置，无需更改任何内容。单击“下一步”继续。在下一步中，保持默认设置，表示运行前对系统进行预启动。

选择运行一个启动循环，以平衡芯片表面。接下来，定义样品的进样参数。由于再生溶液此前已指定且设置为预定义模式，因此无需更改该界面中的任何参数。

单击下一步。最后，指定样本。每种突变体变体输入两行，一行为空，另一行为含样本的行。

通过将最高浓度参数设为零来表示空白循环。每次运行可拟合两种半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 的变体。对于每个突变体，输入分子量、最高浓度和稀释因子，然后按下一步。

在接下来的界面中，已标出样品架的位置。请准备蛋白样品的稀释系列，并将带盖的小瓶按屏幕上所示放入样品架中。位置13放置含有缓冲液的小瓶，位置14放置含有再生溶液的小瓶。请确保用水位置加入新鲜的水。

将样品架放入仪器中，通过按下“加载样品”按钮加载样品，然后点击下一步。与之前相同，在按下“开始”按钮运行实验前，进行最终检查，相互作用数据将实时显示。运行结束后，立即按照刚刚演示的方法，继续运行剩余的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体。

如果依次运行其余的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变异体，则在步骤中取消选中相应的复选框，以跳过初始化步骤和启动循环。每次运行完成后，可通过链接访问数据。所有结果均位于检测工作流程中。

此时会弹出一个对话窗口，显示在此工作流程中生成的所有结果。为了计算动力学速率常数，选择要评估的结果，然后按“评估”按钮，核心 X 100 评估软件将重新启动并显示所有汇总数据。从工具栏菜单中选择“动力学亲和力”。

在第一个界面中，选择半胱氨酸三号位突变为丝氨酸的突变体进行评估。该突变体的数据将与为此突变体进行的空白运行结果一同显示，点击“下一步”继续。下一个界面显示的是从样品运行数据中减去空白运行数据后的结果。

选择点击“动力学”按钮来评估动力学。然后选择将数据拟合到一对一相互作用模型。点击“拟合”按钮后，拟合结果将在计算过程中实时显示在屏幕上。

准备就绪后，系统将自动应用质量控制并显示在底部。请逐一检查质量控制项目，然后查看传感器图谱数据，确保传感器图谱显示出足够的曲率。同时，请查看残差图，该图显示了采集数据与拟合模型之间的差异。

注意系统性偏差和非随机偏差。该拟合结果可以接受。现在查看报告标签页中的动力学数据。

结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数。完成后，按“完成”按钮，并对所有其他突变体重复相同操作。以下是针对所检测的不同半胱氨酸蛋白酶抑制剂B变体的CFCA分析的代表性结果。

从流速为 10 和 100 微升每分钟时获得的传感器图中提取特异性结合浓度数据。将通过两次 80 测量所确定的浓度与通过 CFCA 确定的浓度进行比较，可以明显看出，尽管在大多数情况下亮氨酸 73 甘氨酸突变体的蛋白完全具有活性，但活性蛋白的比例却非常低。使用单周期动力学方法测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B 突变体与胃蛋白酶的结合动力学。

传感器图显示了经过空白和参比扣除后的数据，并叠加了黑色的一对一相互作用模型动力学曲线。CFCA 测得的亮氨酸 73 变体的特异性结合浓度仅为通过双 80 测量确定的总蛋白浓度的约 10%。在计算动力学参数时使用正确浓度后，可以明显看出亮氨酸 73 的结合速率与其他变体相似。

尽管突变体的结合速率与野生型蛋白相当，但其解离速率常数可高出近两个数量级，相应地导致平衡解离常数增加。亲和力的降低主要取决于解离速率的升高，这表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的第二个结合环和C末端均在复合物形成后通过维持抑制剂与酶的结合而共同贡献于结合亲和力。得出这一结论的关键在于采用了无需校准的标准浓度分析方法，因为其中一个突变体表现出极低的结合活性。我的同事Pol现已向您展示了如何在结构功能研究中使用bi core X 100。在进行这些实验时，重要的是要记住，尽管浓度分析和动力学分析均基于相同的结合过程，但两者的实验条件却有很大不同。