Name: 微流体调查可溶性信号介导的相互作用的上皮细胞和细菌的共同文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学习微流体共培养技术，用于研究上皮细胞与细菌的相互作用。该方法利用HeLa细胞和E. coli模拟人体胃肠道环境，通过荧光显微镜观察病原体定植过程，为益生菌筛选提供新工具。

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本工作部分由美国国家科学基金会（CBET 0846453）和美国国立卫生研究院（1R01GM089999）资助。

1. 使用标准SU-8光刻技术制备硅模板1 (本视频中未展示).
<ol>
 <li> 在洁净室中，采用标准的 SU-8 光刻工艺制备 SU-8 “母模”（SU-8 2050，MicroChem，Newton，MA），用于制造不同部件（不同厚度的 PDMS 膜、共培养室）。此类母模可在任意微加工设施中制备（例如，斯坦福微流控工坊；<a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a>）。</li>
 <li> 在进行 PDMS 复型前，将 SU-8 母模置于连接真空源的干燥器中，暴露于氟硅烷蒸气，以促进 PDMS 从母模上顺利脱模。将一滴氟硅烷滴加至纸巾上，并抽真空 1 分钟。随后释放真空，静置 30 分钟以完成氟硅烷沉积。将 SU-8 母模保存于密闭容器中以备后续使用。</li>
</ol>
2. 以SU-8模具为模板的PDMS复制模塑2
<ol>
 <li> 流体层和控制层通过在SU-8模具上复制成型PDMS制备。</li>
 <li> 按10:1（重量比）混合PDMS预聚物与交联剂，并在真空干燥器中脱气1小时（或直至PDMS混合物中的气泡完全去除）。</li>
 <li> 将SU-8模具置于培养皿中，小心地将PDMS混合物倾倒于其表面，再次对PDMS进行脱气。</li>
 <li> 以1200 rpm转速旋转模具1分钟，使PDMS在模具上形成约100μm的均匀厚度。</li>
 <li> 将含有PDMS和SU-8模具的培养皿在80°C下加热1小时，使PDMS固化。</li>
 <li> 从加热板上取下已固化的、带有PDMS的SU-8模具。</li>
 <li> 将PDMS模具从SU-8模具上剥离下来。</li>
 <li> 使用20号钝头针在PDMS模具上钻四个孔，分别用于两个细菌入口、一个出口和一个气动端口。</li>
</ol>
3. 多层PDMS装置的键合：该装置由三层组成——包含主通道的上层、中间的气动层，以及包含细菌通道的底层。这三层结构的组装方法如下所述。
<ol>
 <li> 用甲醇润湿PDMS膜，并使用洁净的镊子小心地从SU-8模具上剥离。将膜放置在聚四氟乙烯（teflon）片上。</li>
 <li> 将气动膜和流体层放入氧气等离子体腔室中。开启等离子体处理40秒（氧气压力10 sccm，射频功率100 W）。</li>
 <li> 经等离子体处理后，在10分钟内使用镊子将膜与底部PDMS通道对齐。在膜和PDMS层上添加甲醇有助于层间自由移动，使对齐更方便。此时，将装置置于纱布上，以允许甲醇蒸气逸出。</li>
 <li> 将对齐后的PDMS层在80°C的加热板上固化8小时。</li>
 <li> 在将气动膜键合到底层后，重复步骤3.2–3.4，将顶部通道键合到已组装的复合PDMS装置上。</li>
</ol> 
4. 组装PDMS装置3,4
<ol>
	<li> 在用于接种真核细胞和细菌的进样口和出样口处钻孔。</li>
 <li> 将Tygon管（外径0.01英寸）连接至端口，并通过拉动20 mL注射器操作气动层。</li>
 <li> 将PDMS模型和一块预先清洁的玻片放入氧气等离子体腔室中。在不施加真空的情况下，开启等离子体20秒（氧气流速20 sccm，射频功率300 W）。</li>
 <li> 为防止岛状壁（PDMS）在与玻片键合时发生接触，应立即在装置上连接注射器，并通过拉动注射器并保持其位置施加真空。</li>
 <li> 在两分钟内轻轻将PDMS模型压在玻片上。</li>
 <li> 将PDMS装置在80°C下固化10分钟。</li>
</ol>
5. 用纤连蛋白处理玻璃表面
<ol>
 <li> 连接所有端口的Tygon管后，将装置置于紫外线下灭菌15分钟。</li>
 <li> 向通道中注入并流过已灭菌的PBS，以清除通道内的任何碎片。持续灌流10分钟以去除气泡。由于PDMS具有透气性，气泡可轻易逸出。</li>
 <li> 向气动通道中注入染色液，以防止通道内形成气泡。</li>
 <li> 为促进真核细胞在玻璃表面的接种，向装置中引入1 μg/mL的纤连蛋白溶液，并在37°C下孵育40分钟。</li>
 <li> 用1 mL培养基清洗未结合的纤连蛋白。</li>
</ol>
6. 共生性 E. coli 生物膜在微岛中的形成与测定
<ol>
 <li> 在M9最小培养基中稀释共生细菌（例如 E. coli BW25113/pCM18），使其OD600约为1，用于在封闭腔室/微岛中形成共生生物膜。</li>
 <li> 通过施加正向液体压力封闭微岛壁。使用自制的气液压力转换装置，以防止通道内产生气泡。</li>
 <li> 在阀门关闭的情况下将共生性 E. coli 引入微岛，并在32°C下孵育1小时，使细菌附着。</li>
 <li> 洗去未附着的细菌，并以0.25 mL/hr的流速灌注稀释的细菌悬液（OD600~0.05），持续12小时。</li>
 <li> 用新鲜的DMEM培养基冲洗生物膜，去除松散附着的细菌，为真核细胞附着做准备。</li>
 <li> 使用Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜（Bannockburn, IL）对生物膜成像，并利用IMARIS软件5可视化生物膜结构。</li>
</ol>
 7. 在细菌岛周围接种真核细胞6-8
<ol>
 <li> 用胰蛋白酶消化贴壁的HeLa细胞，从细胞培养瓶中解离后重悬于DMEM培养基中，调整细胞密度至5 × 105 个细胞/mL。</li>
 <li> 使用Picoplus注射泵（Harvard Apparatus, MA）以2 mL/min的流速将HeLa细胞注入装置中。确保微岛壁处于下降位置，使细菌生物膜区域与HeLa细胞区域相互分离。此步骤应在光学显微镜载物台上进行，以便观察细胞接种的均匀性。</li>
 <li> 夹闭细胞出口以减少通道内细胞悬液的流动，并在37°C、5% CO2培养箱中孵育6小时。</li>
 <li> 以0.5 mL/hr的流速向装置中灌注新鲜培养基，以清除未贴壁的细胞。</li>
 <li> 每6小时更换一次HeLa细胞和共生大肠杆菌（E. coli）的DMEM培养基。</li>
</ol>
8. 将病原菌引入微岛并使其暴露于真核细胞
<ol>
 <li> 准备 E. coli O157:H7（EHEC）以感染复数（m.o.i.）100:1 至 200:1（每 HeLa 细胞对应的 EHEC 数量）感染 HeLa 细胞。</li>
 <li> 冲洗并洗去松散附着的共生细菌。 </li>
 <li> 加入稀释的EHEC悬液（OD600 ~ 0.1）进入岛屿。</li>
 <li> 将装置孵育于 37°C 在5% CO2 在无流动条件下于培养箱中孵育6小时，使EHEC暴露于共生生物膜中存在的信号分子。</li>
 <li> 抬起 PDMS 壁，使共生物岛屿中的 EHEC 暴露于 HeLa 细胞 6 小时。</li>
 <li> 用 PBS 冲洗通道，然后使用活/死细胞染色试剂盒（L3224，Invitrogen，CA）对活细胞和死细胞进行染色。</li>
 <li> 在蔡司Axiovert 200M荧光显微镜上对多个位点进行成像，并估算活细胞与死细胞的数量。</li>
</ol>
9. 典型结果 9
通过建立HeLa细胞单层和共生大肠杆菌（E. coli）生物膜，并在感染HeLa细胞前将肠出血性大肠杆菌（EHEC）暴露于该共生生物膜，模拟了胃肠道感染的事件顺序。图1展示了微流控共培养模型构建的各个步骤。图2A显示了共培养装置的三维结构示意图。图2B用不同颜色的染料（真核细胞区域为紫色，细菌岛为绿色）标示出共培养装置中的两个区域——真核细胞培养腔和细菌岛。图2C利用染料显示了将细菌培养区域与周围真核区域隔离的可行性。图3展示了上皮细胞与细菌共培养的代表性结果。图3A显示EHEC（红色）在共生生物膜（绿色）形成的细菌岛上定植。图3B显示了上皮细胞与携带绿色荧光蛋白（GFP）的共生E. coli及携带红色荧光蛋白（RFP）的EHEC在细菌岛中的空间排布。当聚二甲基硅氧烷（PDMS）壁下降时，表达RFP的EHEC和表达GFP的共生细菌被限制在细菌岛内，表明可实现细菌岛与上皮细胞之间的有效隔离。
<img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="用于逐步暴露细菌和HeLa细胞的微流控装置示意图；阀门、压力" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1: 共培养模型中的细胞接种示意图。（1）降低PDMS壁以形成一个岛状区域，将共生细菌引入该岛状区域，并将纤连蛋白溶液流经岛状区域周围。（2）在岛状区域周围的区域接种HeLa细胞。（3）当HeLa细胞达到汇合状态且共生生物膜已形成后，将肠出血性大肠杆菌（EHEC）引入岛状区域。（4）升起PDMS壁，使岛状区域周围的HeLa细胞暴露于EHEC。插图为阀门操作细节示意图。
<img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="用于细菌与真核细胞研究的微流控图案化示意图，含流动池。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="显示在气动通道系统中细菌分离的微流控实验示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2bc"> 图 2：上皮细胞与细菌共培养的微流控模型。（A）共培养装置的三维示意图，显示由气动驱动的捕获区域，用于在上皮细胞中形成细菌微岛。每个细菌微岛（直径 1200 μm，间距 1000 μm）均设有独立的进样口和出样口，用于供给培养基并清除微岛废物。（B）共培养装置的显微图像，使用彩色染料显示不同区域（上皮细胞区、细菌微岛）。（C）通过气动激活通道（蓝色）降低 PDMS 壁（左图），将紫色染料引入封闭的微岛，并在周围持续流加黄色染料 48 小时，以展示气动捕获系统的可靠性。当 PDMS 壁被抬升（右图）后，微岛区域暴露于周围的黄色染料中。比例尺为 500 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="大肠杆菌菌落图谱，微生物生长研究，HeLa细胞，PDMS边界，气动通道" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3: HeLa细胞与细菌的共培养.（A）表达RFP的EHEC与表达GFP的 E. coli BW25113 在岛状结构中。（B）装置中透射光、绿色和红色荧光图像的叠加。比例尺代表 200 μm.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li>
<li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li>
<li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li>
<li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+with+tunable+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li>
<li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

传统的病原体黏附与定植检测方法利用组织培养板中的真核细胞单层，将病原体加入其中进行实验。这些模型缺乏生理相关性，因为它们未包含在真核细胞表面形成的共生细菌生物膜。简单地将预先培养的细菌接种到真核细胞上，几乎不可能形成这种结构，因为生物膜是随时间逐步发育形成的高度有序结构，而在细菌共存条件下长期培养真核细胞极其困难，几乎不可能实现而不造成细胞活力显著下降。由于在这些模型中，病原体无需穿越共生生物膜即可附着于上皮细胞，因此这些模型无法准确模拟胃肠道中上皮细胞与共生菌群的组织结构。本文中，我们介绍了一种微流控装置的构建方法，该装置利用气动控制的捕获机制实现真核细胞与细菌的共培养。以HeLa细胞作为模型真核细胞系，肠出血性大肠杆菌（EHEC）作为模型病原体，我们证明该共培养装置能够保持“岛状”区域的隔离，同时支持HeLa细胞单层以及共生E. coli生物膜的培养与发育。该微流控共培养模型不仅能够实现共生细菌与上皮细胞的空间定位，还能在病原体接触上皮细胞之前使其预先暴露于共生菌群；从而在定植过程中提供更接近生理状态的环境。此外，该共培养模型还可作为研究特定信号对EHEC感染性影响的基础研究工具，也可用于潜在益生菌株筛选等应用。

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高分辨率（16,256 dpi）光刻掩模</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三氯(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>道康宁公司（Dow Corning）</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.）</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>可编程旋涂仪</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>掩模对准器</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>氧气等离子体刻蚀机</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究可溶性信号介导相互作用的上皮细胞与细菌微流控共培养

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

人体胃肠道（GI）道是一个独特的环境，其中肠上皮细胞与非致病性（共生）细菌共存。有研究提出，病原体在共生菌层中所接触的微环境对其定植程度具有重要影响。目前用于研究病原体定植的培养方法并不适用于验证这一假说，因为它们无法以模拟胃肠道微环境的方式实现细菌与上皮细胞的共培养。本文描述了一种微流控共培养模型，该模型可实现真核细胞与细菌的独立培养，并可用于检测共生微环境对病原体定植的影响。该共培养模型通过构建一个共生菌Escherichia coliHeLa 细胞间的生物膜，随后引入肠出血性大肠杆菌E. coli（EHEC）定植到共生菌岛中，这一序列模拟了胃肠道感染中的事件顺序。

本方案描述了一种用于上皮细胞与细菌同时且局部共培养的微流控共培养模型。该模型可用于研究不同可溶性分子信号在发病机制中的作用，以及筛选潜在益生菌菌株的有效性。

人体胃肠道（GI）道是一个独特的环境，其中肠上皮细胞与非致病性（共生）细菌共存。它具有……

本方案展示了一种新型微流控共培养模型的使用方法，该模型可实现真核细胞与细菌的独立共培养，以检测共生微环境对病原菌定植的影响。通过在HeLa细胞中构建共生性大肠杆菌生物膜，随后将肠出血性大肠杆菌（EHEC）引入该共生区域，从而演示该共培养模型的应用，其操作顺序模拟了胃肠道感染过程中的事件序列。使用荧光显微镜观察EHEC对上皮细胞定植的程度。大家好，我来自德克萨斯A&M大学化学工程系分子系统生物技术实验室。今天我们将向您展示一种在微流控装置中共同培养细菌与eCard细胞的方法，该方法可模拟人体胃肠道中的组织结构。我们在实验室中采用此方法研究致病性细菌在定植上皮细胞时，其定植过程如何受到细菌在进入三道系统前所遇到信号的影响。现在让我们开始。实验前，根据预期的实验用途设计并制备硅胶母版。例如，斯坦福微流控制造中心可根据设计的母版制作出后续实验所需的复制模具。本方案所述的三层装置需要制备两个膜的模具，分别用于真核细胞培养层和气动层，以及一个用于细菌通道的模具。细菌层、气动层和真核细胞培养层的通道高度分别为 5、200 和 100 微米。在制备复制模具前，将 SU-8 母版置于连接真空源的干燥器中，暴露于氟硅烷蒸气中。为便于聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具从母版上顺利脱模，可在真空腔内的纸巾上滴加一滴氟硅烷，然后抽真空一分钟。移除真空，静置30分钟以完成氟化物的沉积。将SU-8模具保存在培养皿中，以备后续制作复制模具使用。按10:1的质量比配制PDMS预聚物与交联剂，充分混合后置于真空腔中脱气1小时。为去除气泡，将SU-8模具放入培养皿中，并使用5克PDMS用于上层，30克PDMS用于细菌层，小心地将PDMS倒在模具上。再次对PDMS抽真空10分钟以去除气泡。接着，将模具旋转1分钟，使PDMS spread形成均匀的膜。在此方案中，真核细胞培养膜在1200 RPM转速下离心，厚度为150微米，而气动膜在800 RPM转速下离心，厚度为250微米。离心后，将含有离心后的PDMS和SU-8主模具的培养皿在室温下静置15分钟，然后在80摄氏度的加热板上加热一小时。PDMS固化后，用甲醇润湿PDMS，并使用洁净的镊子小心地从SU-8主模具上剥离。将细菌层置于体视显微镜下，使用20号钝端针头钻三个孔，包括两个细菌入口和一个出口。三层装置的组装顺序如下：先将气动层与细菌层键合，再将真核细胞培养层与细菌层及气动层的组合体进行键合。将气动膜和细菌层置于载玻片上，然后在氧气等离子体腔室中暴露于等离子体处理40秒，氧气压力为10标准立方厘米每分钟（SCCM），射频（RF）功率为100瓦。在膜中加入甲醇可促进各层的自由移动，使对齐更加容易。在氧气等离子体处理后的10分钟内，使用镊子和体视显微镜将细菌层转移至培养皿中。根据细菌的入口和出口孔，将中间的气动膜与细菌层对齐。对齐后，将带有对齐PDMS结构的培养皿置于80摄氏度的加热板上加热八小时，以实现键合。完成后，在气动层上钻一个孔，用于控制气动通道。接下来，重复从组装到对齐的步骤，将真核细胞培养通道键合至已组装的复合PDMS装置上。在用于接种真核细胞的进样口和出样口处钻孔。将Tigon管连接至各端口，并通过拉动20毫升注射器操作气动层。将复合PDMS结构和预先清洁的玻片放入氧气等离子体腔室中。开启等离子体20秒，期间不施加真空。从氧气等离子体腔室中取出复合PDMS结构，并连接一个20毫升注射器。立即拉动以产生真空，防止阀门与玻璃接触。在一分钟内滑动。等离子处理后，轻轻将复合PDMS结构压到玻璃上。将PDMS装置置于80摄氏度的加热板上固化10分钟。随后，将特氟龙管连接至每个端口，并在紫外线下对装置进行15分钟的灭菌处理。接下来，用1毫升无菌注射器吸取500微升无菌PBS，注入通道以清除任何残留碎片。若观察到气泡，使用 einor 微量离心管夹住出口管路，并施加轻微压力，使气泡通过气体可渗透的 PDMS 层排出。向气动通道中注入无菌水，以防止通道内形成气泡。使用自制的气液压力转换器，以防止在气动通道中形成气泡。为在玻璃上进行真核细胞接种做准备，将500微升纤连蛋白加入细胞培养区域的真核细胞培养入口。使用注射器操作，保持阀门关闭，并在37摄氏度下孵育40分钟。最后使用注射泵以一毫升培养基冲洗过量的纤连蛋白。该装置现已准备就绪，可用于实验以形成共生生物膜。将细菌用M9最小培养基稀释至600 nm处的OD值约为1。本示例中使用的是大肠杆菌（E. coli）的实验室菌株，但任何非致病性细菌菌株均可使用。通过施加正向液体压力，关闭分隔细菌与真核细胞培养区域的阀门。使用注射泵将0.2毫升OD600约为1.0的大肠杆菌（e coli）引入微岛结构中，并在32摄氏度下孵育一小时，使细菌附着。孵育结束后。以每小时0.25毫升的流速，灌注浓度约为OD 600 0.05的稀释细菌悬液和新鲜M9最小培养基，持续12小时。使用注射泵，以每小时0.5毫升的流速，用0.5毫升新鲜的无血清且无抗生素的DMEM培养基冲洗生物膜，以去除松散附着的细菌，并为真核细胞附着成像做准备。使用Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜，结合MS软件观察生物膜的结构。用胰蛋白酶消化组织培养瓶中的HeLa细胞，并重悬于DMEA培养基中，总体积为0.1毫升，接种密度为每毫升5×10⁵个细胞。使用Pico Plus注射泵以每分钟2毫升的流速将HeLa细胞注入装置的真核细胞区域。接下来，使用光学显微镜确认分隔共生细菌区域与真核细胞区域的阀门已完全关闭，以确保细菌生物膜与悬浮细胞区域分离。使用微型离心管夹夹住细胞出口，以减少通道内细胞悬液的移动，并在37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育6小时。孵育结束后，使用注射泵以每小时0.5毫升的流速向装置中灌注50微升DMEM培养基。为去除未贴壁的细胞，每六小时更换一次 HeLa 细胞和共生大肠杆菌区域的 DMEM 培养基。在 M9 培养基中培养大肠杆菌 O157:H7（EHEC），用于以感染复数（MOI）为 100 至 200 个 EHEC 细胞比 1 个 HeLa 细胞的比例感染 HeLa 细胞，并按照前文所述方法洗去松散附着的共生细菌。通过注射泵以每小时 0.25 毫升的流速，将 100 微升稀释的 EHEC 悬液（OD600 约为 0.1）引入微岛区域。随后，将装置置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育6小时，期间不进行流动，以使EHEC暴露于共生生物膜中存在的信号。孵育结束后，使用真空泵产生负压，打开分隔共生细菌区域与真核细胞区域的阀门，并保持阀门开放6小时。这将使共生细菌生物膜中的HEC暴露于HeLa细胞。随后，再次于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育6小时。根据制造商说明书，将活死染色试剂引入已制备好的装置中。为检测helo细胞活力，使用1毫升注射器向装置的真核细胞区域注入0.1毫升染色工作液，作为评估helo细胞死亡的对照。在无EHEC的情况下，重复前述三个步骤，并向装置中引入无菌、无血清且不含抗生素的DMEM培养基。在蔡司AIOt 200 M荧光显微镜上，无需拍摄EHEC图像的多个位置，而是通过在至少七个不同位置获取的图像中计数绿色细胞的数量，来估算红色死细胞中存活的上皮细胞数量。接下来，我们将展示一些试层微流控装置的代表性图像。在此图像中，我们使用惰性食用色素来表示不同的培养区域。紫色染料代表真核细胞培养区域，而绿色染料代表共生细菌生物膜。在此图像中，我们证明了保持真核细胞区域与细菌区域相互分离的可行性，因为细菌区域内的紫色染料与周围黄色染料明显区分开来。此处展示了表达红色蛋白的致病菌对表达绿色蛋白的共生细菌生物膜的定植过程。如图所示，EHEC 和共生细菌与包围细菌生物膜的 HeLa 细胞有明显区别。我们刚刚向您展示了如何组装一种用于细菌与上皮细胞共培养的干层微装置，通常用于研究旁分泌信号对病原体定植的影响。进行此操作时，重要的是要记得去除装置中的任何气泡，并以适当的多重细胞感染复数使用该病原体。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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