一个微流体装置量化细菌趋稳定的浓度梯度
April 19th, 2010
本协议描述了一个微流体装置的发展，为细菌的趋化调查chemoeffectors稳定的浓度梯度。
大肠杆菌 RP 4 37 被引入趋化装置中，在那里它们暴露于确定的空间浓度。梯度进入腔室的细胞遇到浓度梯度的中点。根据信号是被感知为引诱物还是驱避物，细菌会迅速在浓度梯度中向上或向下移动。
大家好，我是来自德克萨斯农工大学分子系统生物技术实验室和化学工程系的 Derek Engler。今天，我们将向您展示一个在微流体设备中研究细菌化疗税的程序。我们在实验室中使用该程序来研究大肠杆菌 RP 4 37 如何在硫酸镍的浓度梯度中迁移。
那么让我们开始吧。流体层和控制层是通过 SU 8 母站的聚甲基 SUBOXANE 或 PDMS 复制成型制成的。要开始此程序，请将 PDMS 预聚物和交联剂以 10：1 的重量比混合。
将混合物在干燥液中脱气 1 小时，直到去除气泡。PDMS 混合物准备好后，将 SU 8 master 放入培养皿中，小心地将混合物倒在 SU 8 master 上至所需厚度的热量。将装有 PDMS 和 SU 8 母模的培养皿在 80 摄氏度下固化 PDMS 两个小时。
两小时后，从热板上取出固化的 PDMS 覆盖的 SSU 8 母版，并从 SU 8 母版上剥离 PDMS 模具。使用 20 号平头针刺在 PDMS 模具上打四个孔，将所需的结构嵌入到 PDMS 模具中，用于将管道连接到梯度发生器、样品池入口和样品池出口。现在我们已准备好组装 PDMS 器件以绑定 PDMS 器件。
首先，用异丙醇清洁玻璃显微镜载玻片，然后用 Airstream 尝试。接下来，将 PDMS 模具和载玻片在等离子蚀刻机中暴露于氧气等离子体中约 30 秒。使 PDMS 模具与载玻片接触 将接触的载玻片和 PDMS 模具在热板上加热至 65 摄氏度 15 分钟。
要组装 PDMS 设备，请使用剃须刀片将管子以 45 度角切割成所需的正确长度，具体取决于显微镜设置。然后使用镊子。将管路的一端插入设备中打出的四个孔之一。
将钝的 30 号针座插入管路的另一端。对所有剩余的孔重复插入管路和针座。将 1 毫升化疗税、缓冲液或 CB 装入 3 毫升注射器中。
小心去除注射器中的空气。使用移液器将 CB 添加到出口针座，然后轻敲针座以去除任何气泡。从 3 毫升注射器的尖端推出一点 CB，并将注射器连接到针座，不要滞留空气。
将 CB 推入设备，直到所有剩余的针座都充满 cb。这应该可以去除大部分气泡。接下来，用含有适当浓度的被测化疗效应子的 CB 填充两个 500 微升注射器。
通过推出一小滴注射器内容物并接触针座中的液体滴并连接注射器来消除气泡的形成，以制备高度运动的细菌。对于趋化性实验，在 32 摄氏度下摇动培养具有 GFP 表达的大肠杆菌 RP 4 37、在 tripton 肉汤或 TB 中培养过夜培养物。使用过夜培养物在 250 毫升锥形瓶中接种 20 毫升 TB 培养物，使其光密度为 600 纳米，约为 0.05。
当细胞的 OD 600 约为 0.35 至 0.45 时，在 32 摄氏度下振荡培养物。通过低速离心复苏收获它们，将细胞悬浮至约 0.35 的 CB 中的 OD 600，其中包含通道中间预期浓度的化疗效应子。最后，将 RFP 标记的死细胞添加到无 D 600 约 0.35 的活细胞中。
这些死细胞将作为内部对照，以确保任何迁移不是由于流动效应引起的。细胞悬液现在已准备好加载到微流体装置中进行趋化性实验。要开始趋化性实验，请从细胞入口针座中取出一些 CB，重新填充细胞悬液。
将重悬的细胞轻轻填充 50 μL 注射器。慢慢做，因为鞭毛可以被剪断，这会降低运动能力。如前所述，将 50 微升注射器连接到入口针座，方法是推出一小滴注射器内容物，将液滴接触针座中的液体，然后将注射器定位在配备高速相机的荧光显微镜载物台上用于图像采集。
将两个入口注射器放入注射泵中并启动流路，以形成梯度并且细胞流经管道。一旦细胞进入化疗税室，请等待大约 20 分钟，让系统稳定下来。在成像之前，在沿腔室长度的不同位置收集活的绿色和死红色荧光图像。
通常，我们会在每个位置以 3 秒的间隔收集 100 张图像。可以使用任何市售的图像分析程序（如 Image J 或 metamorph）或使用 MATLAB 编写的简单代码来分析采集的荧光图像。在此示例中，我们将使用 MATLAB 代码。
首先，通过此设置的阈值像素强度删除图像中的背景像素，然后删除强度小于阈值的所有像素。这样可以最大限度地减少噪音。在分析中，使用死细胞的位置来确定图像的中心。
这表示细胞进入趋化室的位置，以及在没有任何迁移的情况下检测到它们的位置。接下来，在图像中找到活细胞，将图像分成多个通道并确定每个通道中的活细胞数量。在我们之前的工作中，10 个 50 微米宽的化疗税室被分成 64 个通道，每个通道的宽度约为 16 微米。
对所有图像重复这些步骤后，所有图像中每个通道的一些总单元格计数。这给出了在实验期间在每个通道检测到的细胞总数。计算化疗税、分配系数或 CPC，它代表迁移方向。
通过执行以下步骤，分别为位于高浓度或右侧和低浓度或左侧的死细胞分配一个加一和负一的乘数。将所有乘以的值相加，并归一化为检测到的单元格总数。计算化疗税、迁移系数或 CMC，它通过行进的距离来权衡细胞的迁移。
移动到最远的高浓度位置通道 64 的细胞被赋予加 1 的加权因子，而移动到较高浓度侧一半的细胞被赋予正 0.5 的权重因子和一个细胞。移动到最远的低浓度位置时，权重为负 1。所有加权单元格计数中的一些并标准化为生成 CMC 的单元格数。
该图显示了使用异硫氰酸荧光素在微流体装置中形成的线性浓度梯度或曲线。该图使用蓝色和黄色染料演示了浓度梯度的形成。电池入口是 CA 的，因此没有流过它，可以看出形成了蓝色和黄色之间的颜色范围。
以下是来自代表性趋化性实验的伪彩色图像，其中大肠杆菌 RP 4 37 在装置中暴露于 0 至 100 微摩尔 L 天冬氨酸或 0 至 225 微摩尔硫酸镍的梯度下。每 2.5 秒对活绿色细菌向天冬氨酸或远离镍的迁移进行一次成像，持续 30 分钟。以红色显示的死细菌用作设备中流动效应的控制。
该图显示了 RP 4 37 在没有梯度的情况下在微流体装置中的空间分布，并与它对天冬氨酸梯度和硫酸镍梯度的响应进行了比较。我们刚刚向您展示了如何在硫酸镍梯度中监测大肠杆菌 RP 4 37 的化疗税。执行此程序时，请务必记住尽量减少细胞涡旋，以便可以使用高运动亚群。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
该协议描述了开发一种用于研究稳定化学效应物浓度梯度中细菌趋化性的微流控装置。将E. coli RP 4 37引入该装置以研究它们对定义的空间浓度梯度的响应。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 细菌趋化性
- 生物技术
背景
- 细菌趋化性是细菌对化学刺激的向前或向后移动。
- 微流控装置允许对化学梯度进行精确控制。
- 理解趋化性可以提供对细菌行为和生物技术应用的见解。
- 本研究侧重于E. coli RP 4 37及其对硫酸镍的反应。
研究目的
- 开发用于研究细菌运动的微流控装置。
- 研究E. coli如何响应不同的浓度梯度。
- 增强对细菌趋化性机制的理解。
使用的方法
- 微流控装置设计和制造。
- 将E. coli引入装置中。
- 观察细菌对化学效应物的响应行为。
- 分析浓度梯度中的迁移模式。
主要结果
- 细菌对吸引物表现出定向移动，并远离排斥物。
- 定义的浓度梯度显著影响细菌行为。
- 微流控装置为研究趋化性提供了受控环境。
- 结果有助于理解细菌导航机制。
结论
- 开发的微流控装置有效用于研究细菌趋化性。
- 研究结果增强了对E. coli在化学信号响应中行为的认识。
- 该研究对涉及细菌的生物技术应用具有意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying bacterial chemotaxis in stable gradients enables mechanistic de-risking of antimicrobial target validation by linking chemoeffector sensing to phenotypic behavior. This microfluidic approach supports predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible migration data under controlled chemical conditions. The platform enhances translational continuity from target screening to preclinical evaluation by standardizing chemotaxis readouts for cross-functional teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring bacterial migration toward or away from specific chemoeffectors.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative assessment of attractant and repellent responses.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by correlating chemotactic behavior with gene expression or pathway activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated bacterial systems for downstream screening by establishing baseline chemotactic responsiveness.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via stable, diffusive gradient generation.
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs such as chemotactic partition and migration coefficients for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling bacterial navigation in host-like chemical environments.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation using consistent microfluidic formatting.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying chemotactic de-risking of targets.
Pipeline & Workflow Integration
The device integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of chemoeffector-receptor interactions prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking migration patterns to specific chemoeffector detection mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through stable gradient formation and high-speed imaging compatibility.
- Analytics: Generates normalized chemotactic coefficients that allow cross-condition comparison of bacterial responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by standardizing bacterial behavior readouts across model systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening diverse chemoeffectors and bacterial strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in bacterial behavioral responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized microfluidic fabrication and gradient control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative chemotaxis data for target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with minimal chemotactic escape mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Depends on PDMS molding, plasma bonding, and syringe pump infrastructure for gradient generation.
- Necessitates cross-team standardization of chemoeffector concentrations and channel segmentation protocols.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, fluorescent labels, and chemoeffector solubilities.
- Limited by the need to minimize shear stress during cell loading to preserve flagellar integrity and motility.
