突触小泡池，利用苯乙烯染料的光转化的研究
2010年2月15日
调频染料已宝贵的帮助，在突触动力学的理解。外长荧光显微镜下通常遵循在不同的刺激条件下。然而，与电子显微镜相结合的FM染料的光转化允许不同的突触小泡池的可视化，以及其他超微结构组件，在突触boutons。
该视频演示了 Styro 染料 FM 1 43 的照片转换过程。为了研究黑腹果蝇中的突触囊泡池，首先解剖果蝇幼虫以暴露构成神经肌肉接头或 NMJ 制剂的腹肌。将制剂在含有 FM D 的缓冲液中孵育，此处显示为灰色标记的细胞膜。
然后，它们受到电或化学刺激，以诱导物理融合囊泡膜内化。刺激的胞吐作用将用 FM D 染色，然后洗涤细胞外 FM 染料，将其从质膜中去除，并在连续高强度照明下固定组织。染料完全漂白，由于二氨基 Ben 和沉淀而出现黑色。
然后可以通过透射 em 来可视化这种沉淀物。大家好，我是来自德国加翁欧洲神经科学研究所 Sylvia Olli 实验室的 Philippe o Paso。今天我们将向您展示 FM 光转换 inria 神经肌肉接头的程序。
我们在实验室中使用该程序来研究突触膀胱循环。好了，让我们开始在解剖显微镜下工作。首先将果蝇幼虫的背面朝上固定在 so guard 涂层的培养皿中。
使用注射器针头将其覆盖在果蝇盐水中，然后找到纵向解剖剪刀在背侧切片。然后去除内脏。接下来，拉伸准备工作，然后再次将其固定在 sigar 盘上。
然后可以使用几块腹肌来保护该程序中使用的 FM 染料不被漂白。该程序应在弱光条件下进行。用含有 90 毫摩尔氯化钾的果蝇盐水覆盖捏住的果蝇制剂，然后 10 微摩尔 FM.1 43 死亡以化学刺激神经。
刺激后在室温下孵育 1 分钟。取出刺激溶液，将盘子与固定的果蝇浸入水中。在装满 100 毫升果蝇盐水的烧杯中制备 2 次，以去除在化学安全罩下工作的细胞外 FM 1 43 模具。
将神经肌肉接头制备物置于 2.5% 戊二醛、磷酸盐缓冲盐水或 PBS 溶液中，在室温下固定 45 分钟。用 PBS 清洗制剂一次，然后将其从雪茄盒中取出，浸入 100 毫摩尔氯化铵中 15 分钟。淬灭剩余谷醛固定剂的游离醛基团。
使用普通 PBS 洗涤氯化铵溶液，将神经肌肉接头制剂放入新的雪茄盘中，然后浸入过滤的 1.5 毫克/毫升中。在 PBS 中加入二胺、苯或 DAB，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。将样品置于配备汞灯光源的荧光显微镜下，灯罩包含使用相对低放大倍率的干式物镜的后镜。
查找样本。然后使用普通的蓝色激发绿色荧光滤光片立方体，聚焦荧光信号。神经肌肉接头在肌肉上表现为亮点。
接下来，使用相同的荧光滤光片组，以最大强度照射样品，直到 FM D 完全漂白。使用 20 倍物镜，30 到 45 分钟应该就足够了。然而，光转换的时间取决于照明强度、DAB 对制剂的渗透强度以及所使用的物镜。
照明后，在透射光下检查样品。如果发生照片转化，应看到深棕色沉淀物。返回解剖范围，然后用剪刀从幼虫上剪下照片转换的斑点。
返回到 dissection 范围。然后用剪刀从幼虫身上剪下照片转换的斑点。现在将样品放入含有 PBS 的微量离心管中，在化学安全罩下工作，并佩戴适当的安全设备，包括手套和护目镜。
每个样品制备 300 微升 1% 四氧化锇。现在将样品放入塑料盖玻璃瓶中，并加入制备好的四氧化锇溶液以后固定制备物。在样品孵育时，制备含有 30、50、70、90、95 和 100% 乙醇的单独溶液。
用 PBS 洗涤样品 4 至 5 次，每次 5 分钟。每次洗涤后，使用塑料 PE 移液管将样品转移到新培养瓶中。最后一次洗涤后，将样品转移到干净的玻璃瓶中。
接下来，将样品放入一系列乙醇溶液中，使其脱水。首先在一毫升 30% 乙醇中孵育。然后，5 分钟后，使用牧场移液器去除乙醇，并用 1 毫升 50% 乙醇代替。
继续脱水，在 70、90 和 95% 溶液中孵育神经肌肉接头制剂。脱水后，样品将在 95% 乙醇溶液中孵育，比在 100% 乙醇中孵育 3 次多。向乙醇中加入 2 毫升一对一 EIN 树脂，并将样品置于旋转器上孵育。
在 100% ein 下旋转后，在室温下放置 2 至 4 小时，然后将样品放入敞开的培养瓶中，让剩余的乙醇蒸发 4 至 6 小时。将新鲜的 EIN 倒入模具中。加入制剂并在 60 摄氏度下孵育 36 小时。
当 EIN 包埋制剂准备好后，使用超薄切片机通过金刚石刀制备 50 至 80 纳米的薄切片 I。样品被切成薄片。切片在刀的水浴上流动，然后可以在普通的 EM 网格上拾取。
准备工作现在可以使用常规 EM 程序进行成像。使用高钾和内化膜刺激来自果蝇 Melan gaster 的分离神经肌肉接头。使用 FM 1 43 染色，如图所示。
神经末梢的荧光可以使用传统的落射荧光显微镜进行观察。在连续照明下，染料完全漂白，当照明继续时，由于恐龙汽油沉淀而出现黑色。这个神经末梢包含突触小泡，但它们都没有经过光转换。
这可能是由于没有足够的照明或 DIA 氨基苯在组织中的渗透性差引起的。相比之下，过多的照明会导致整体较暗的末端，其中看不到囊泡或细胞器，并且可以看到适量的照明光转换。这张显微照片显示了一个突触 bhuton，其中可以看到一池深色囊泡，表明 FM 光转换。
我们刚刚向您展示了如何对用 fem die 标记的突触小泡进行照片转换。执行此过程时，请务必记住始终仔细校准转换步骤的照明时间。就是这样。
感谢观看。祝你的实验好运。
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概述
这段视频展示了将Styro Dye FM 1-43进行光转换以研究果蝇突触小泡池的程序。该方法包括解剖幼虫以暴露神经肌肉接点，在FM染料中孵育，并使用高强度光照进行可视化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 突触动力学
背景
- FM染料对于理解突触动力学至关重要。
- 它们允许可视化突触小泡池。
- 将FM染料与电子显微镜结合可以增强结构洞察。
- 光转换技术揭示了不同的小泡群体。
研究目的
- 可视化果蝇的突触小泡池。
- 展示FM染料的光转换过程。
- 增强对突触机制的理解。
使用的方法
- 解剖果蝇幼虫以访问神经肌肉接点。
- 在FM染料溶液中孵育制剂。
- 电或化学刺激以诱导胞吐。
- 用于染料漂白和可视化的高强度光照。
主要结果
- 用FM染料成功标记细胞膜。
- 可视化刺激后的小泡融合事件。
- 清晰识别不同的突触小泡池。
- 在显微镜下展示光转换的有效性。
结论
- FM染料是研究突触动力学的有效工具。
- 光转换增强了突触结构的可视化。
- 这种方法可应用于各种突触研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise mapping of synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes enables high-resolution analysis of vesicle recycling dynamics, a critical step in understanding neurotransmitter release mechanisms. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in early neuroscience drug discovery, informing portfolio decisions where synaptic function is a therapeutic focus. Integration of optical and ultrastructural readouts enhances predictive confidence for translational research in neuropharmacology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of vesicle recycling, clarifying synaptic pathway mechanisms.
- Supports functional target validation by linking vesicle dynamics to neuronal activity.
- Facilitates mechanistic de-risking for synaptic targets in neurodegenerative and psychiatric disorders.
- Provides structural context for hypothesis-driven interrogation of synaptic function.
Screening & Assay Development
- Establishes validated neuromuscular junction preparations for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of vesicle pool dynamics via fluorescence and EM.
- Enables assay standardization for cross-study and cross-site comparability.
- Supports scalability for screening synaptic modulators in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vesicle pool measurements with disease-relevant synaptic dysfunction models.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of synaptic targets.
- Informs risk-adjusted advancement of candidates affecting neurotransmitter release pathways.
- Enhances predictive value for translational biomarker development in CNS disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This photoconversion method bridges early discovery and preclinical research by enabling direct, quantitative analysis of synaptic vesicle dynamics in model systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for synaptic targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative vesicle pool measurements for assay development.
- Analytics: Delivers high-resolution structural and functional readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for synaptic vesicle analysis across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target validation.
- Operational Value: Standardizes vesicle pool analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation for CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of synaptic target programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, electron microscopy, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to high-intensity illumination sources and EM infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of stimulation and photoconversion parameters.
- Adaptation may be needed for different model organisms or synaptic systems.
- Photoconversion efficiency is sensitive to illumination calibration and tissue penetration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:24
Preparation of Drosophila melanogaster Neuronal Muscular Junction (NMJ)
2:05
Stimulation and FM Staining
2:43
Fixing Neuromuscular Junction Preparations
4:49
Processing the Sample for Electron Microscopy
7:29
Representative Results
3:19
Photoconversion of FM1-43
8:19
Conclusion
