利用 Styryl 染料光转化研究突触囊泡池

本视频演示了Styro Dye FM 1-43的光转化过程。为了研究黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的突触小泡池，首先解剖果蝇幼虫以暴露腹侧肌肉，从而制备出神经肌肉接头（NMJ）标本。将标本孵育在含有FM染料的缓冲液中，图中以灰色显示，用于标记细胞膜。

随后通过电刺激或化学刺激诱导其发生物理融合，使囊泡膜内化。刺激后的胞吐作用将用FM染料进行染色。之后洗去细胞外的FM染料，将其从质膜上清除，并在持续高强度光照条件下固定组织。染料被完全漂白，由于二氨基苯的沉淀，呈现出黑色。

随后可通过透射电子显微镜观察该沉淀物。大家好，我是来自德国哥廷根欧洲神经科学研究所 Sylvia Olli 实验室的 Philippe o Paso。今天我们将向您展示一种在神经肌肉接头中进行 FM 光转换的实验方法。

我们在实验室中使用此方法研究突触囊泡的循环。好的，现在开始吧。在解剖显微镜下操作，首先将一条果蝇幼虫背侧朝上固定在一个硅化处理的培养皿中。

用注射器针头滴加果蝇生理盐水覆盖组织，用解剖剪沿背侧纵向切开。随后去除内脏器官。接着，将标本拉伸并再次用图钉固定于Sylgard培养皿中。

随后可利用几块腹侧肌肉来保护本实验中使用的 FM 染料免于漂白。该操作应在低光照条件下进行。用含有 90 毫摩尔氯化钾和 10 微摩尔 FM1 43 染料的果蝇生理盐水覆盖夹住的果蝇标本，以化学方式刺激神经。

刺激后，在室温下孵育一分钟。移除刺激溶液，并将插有果蝇的培养皿浸入盛有 100 毫升果蝇生理盐水的烧杯中，清洗两次，以去除细胞外的 FM 1-43 染料，操作过程需在化学安全通风橱中进行。

将神经肌肉接头样品在含有2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中固定，室温下处理45分钟。用PBS洗涤样品一次，然后将其从培养皿中取出，浸入100毫摩尔浓度的氯化铵溶液中15分钟，以淬灭残留戊二醛固定剂中的游离醛基。

用正常的 PBS 清洗氯化铵溶液，将神经肌肉接头制备物放入新的培养皿中，并浸入过滤后的 1.5 毫克/毫升二氨基苯（DAB）PBS 溶液中，在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。将样品置于配备汞灯光源的荧光显微镜下，汞灯灯箱内含后置反射镜，使用相对较低放大倍数的干式物镜进行观察。

找到样品后，使用普通的蓝色激发绿色荧光滤光片组，将荧光信号调至清晰对焦。神经肌肉接头在肌肉上呈现为明亮的斑点。

接下来，使用相同的荧光滤光片组，以最大强度照射样品，直至 FM D 完全漂白。使用 20 倍物镜时，通常需要 30 至 45 分钟。然而，光转化所需时间会因光照强度、DAB 渗入样品的程度以及所用物镜的不同而有所差异。

光照后，在透射光下观察样本。若光转化已发生，应可见深棕色沉淀物。返回解剖显微镜，然后使用剪刀从幼虫中切下光转化的区域。

返回解剖显微镜，然后使用剪刀从幼虫中剪下已发生光转化的区域。现在将样品放入含有 PBS 的微量离心管中，在化学安全通风橱内操作，并佩戴适当的安全装备，包括手套和护目用具。

每份样品准备 300 微升 1% 四氧化锇溶液。将样品放入带有塑料盖的玻璃瓶中，加入已配制的四氧化锇溶液以进行后固定。在样品孵育的同时，分别配制含 30%、50%、70%、90%、95% 和 100% 乙醇的溶液。

用 PBS 每次五分钟，清洗样品四到五次。每次清洗后，使用塑料移液管将样品转移至新的烧瓶。最后一次清洗后，将样品转移至洁净的玻璃烧瓶中。

接下来，通过将样品置于系列乙醇溶液中进行脱水。首先在1 mL的30%乙醇中孵育，5分钟后使用移液管吸除乙醇，并更换为1 mL的50%乙醇。

继续进行脱水处理，将神经肌肉接头样本依次置于70%、90%和95%的乙醇溶液中孵育。随后，将样本在95%乙醇溶液中孵育的次数需多于在100%乙醇中孵育三次的次数。加入两毫升1:1的EIN树脂与乙醇混合液，并将样本置于旋转器上孵育。

室温下旋转孵育100% EIN 2至4小时后，将样品置于敞口烧瓶中，使残留的乙醇挥发4至6小时。将新鲜的EIN倒入模具中，加入制备好的样品，并在60摄氏度下孵育36小时。

当EIN包埋样品制备完成后，使用超薄切片机和金刚石刀切出50至80纳米的超薄切片I。样品被切成薄片后，切片会漂浮在刀具的水浴面上，随后可转移至普通的透射电镜载网上。

现在可以使用常规的透射电镜技术对样品进行成像。如图所示，采用高钾溶液刺激黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）分离的神经肌肉接头，使细胞内化膜并用FM 1-43染色。

可以使用传统的落射荧光显微镜观察神经末梢的荧光。在持续照明下，染料会完全漂白，当照明继续时，由于二氮苯沉淀，会出现黑色。该神经末梢含有突触小泡，但其中没有一个发生光转化。

这可能是由于光照不足或DIA氨基苯在组织中渗透不良所致。相反，光照过强会导致整体终端过暗，无法分辨囊泡或细胞器；而在适当光照下，则可观察到相应的光转化现象。该显微图像显示了一个突触终末，其中可见一群深色囊泡，表明FM染料发生了光转化。

我们刚刚向您展示了如何对使用 fem die 标记的突触小泡进行光转化。在进行此操作时，重要的是要始终仔细校准转化步骤的照明时间。就是这样。

感谢观看。祝您的实验顺利。