Name: Ferumoxides植入人类间质干细胞在软骨缺损的标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: 学习使用Ferumoxides标记人间充质干细胞并制备琼脂糖基质植入物，通过7T磁共振成像追踪软骨缺损中的干细胞。该方法为软骨修复的干细胞治疗提供了可重复的非侵入性监测方案。

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本工作获得了美国国立关节炎与肌肉骨骼皮肤疾病研究所（NIH RO1AR054458）的资助。

1. 使用 Endorem 标记 hMSCs
<ol>
<li> 细胞在标记前至少培养18小时，直至达到80%汇合度。
</li><li> 在此期间，通过将Endorem以100 µg Fe/mL的剂量加入无血清培养基中，制备标记培养基。
</li><li> 细胞达到汇合后，吸除培养基，并用PBS或无血清培养基洗涤细胞1次。
</li><li> 随后吸除洗涤液，加入预先制备的标记培养基，将细胞置于37°C、5% CO2条件下孵育4小时。
</li><li> 孵育4小时后，吸除标记培养基，用PBS洗涤细胞，并按常规方法进行胰酶消化。
</li><li> 胰酶消化后，细胞用PBS洗涤3次，以400 ×g离心5分钟。
</li><li> 完成洗涤步骤后，将细胞重悬，计数并评估活力，根据实验需要使用。
</li>
</ol>
2. 准备琼脂糖
<ol>
<li> 细胞标记完成后，即可开始制备琼脂糖溶液。
</li><li> 使用精密天平称取80mg琼脂糖粉末，加入2ml PBS中。
</li><li> 将该溶液轻轻振荡混匀后进行高压灭菌。
</li><li> 约40分钟后，可从高压灭菌器中取出液态琼脂糖溶液。测量其体积，并用预热的PBS相应调整至所需体积。
</li><li> 随后将溶液冷却至42°C</li>
</ol>
3. 创建 MASI
<ol>
<li> 当琼脂糖溶液达到所需温度后，对细胞进行计数，并在1.5 ml离心管中最后一次离心。
</li><li> 离心后弃去上清液，将细胞与DMEM混合，使细胞浓度达到30 × 106 个细胞/ml。
</li><li> 现在将细胞与42°C温热的琼脂糖混合。
</li><li> 使用冷的移液枪头可能导致琼脂糖在枪头内部凝固，因此建议通过反复吸取热的无菌PBS来预热枪头。
</li><li> 现在吸取与培养基等体积的琼脂糖，与细胞-培养基悬液充分混合，以形成均匀的悬液。
</li><li> 混合过程中将离心管置于预热的水浴中，以防止琼脂糖冷却至凝固。
</li><li> 当悬液均匀后，将细胞植入缺损部位。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1793/1793fig1.jpg" alt="组织工程分析用标记/未标记hMSCs分布显微图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 髌骨标本冠状面T2加权自旋回波成像（TR 4000 ms/ TE 18.27 ms），显示软骨缺损处植入的hMSCs。

<ol><li>Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+and+functional+maturation+of+bovine+mesenchymal+stem+cells+in+long-term+agarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Rahfoth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+allograft+chondrocytes+embedded+in+agarose+gel+into+cartilage+defects+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).</li>
<li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+iron+oxide+nanoparticles+for+non-invasive+in+vivo+tracking+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

本方案提供了一种可重复的方法，用于用氧化铁纳米颗粒标记间充质干细胞（MSCs），并将标记后的MSCs植入软骨缺损区域。该技术可通过磁共振成像（MR成像）无创地显示软骨缺损部位的干细胞移植情况，从而实现对MASI治疗失败的早期检测。通过观察MR图像上移植部位标记信号的消失，可诊断标记细胞的移位或外流。早期诊断这些事件具有重要意义，可避免患者接受不必要的替代性有创诊断操作。所述的这种用于评估MASI治疗效果的无创方法，有助于推动基于细胞的骨关节炎软骨再生疗法的成功开发。目前，本方案正应用于临床前的体内研究，原则上具备临床应用潜力，未来可作为临床实践中评估MASI疗法效果的无创性结局评价指标。

<table><tbody><tr><td>D-MEM 高糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS（无 Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;）</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>25399-120</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>超顺磁性氧化铁颗粒（Ferumoxides，商品名：Endorem）</td><td></td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖 VII 型</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9045</td><td>将琼脂糖用 PBS 稀释至终浓度为 4%</td></tr></tbody></table>

植入氧化铁标记的人类间充质干细胞修复软骨缺损

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

组织工程领域融合了工程学、细胞生物学和医学的原理，旨在实现特定细胞和功能性组织的再生。基质相关干细胞植入物（MASI）旨在修复因关节炎或创伤性关节损伤导致的软骨缺损。成体间充质干细胞（MSCs）具有分化为软骨细胞谱系的能力，并在基于细胞的关节软骨修复技术中展现出良好的应用前景。自体MSCs可从多种组织中分离获得，能够在细胞培养中扩增而不丧失其分化潜能，并已在体外和体内实验证实具有软骨分化能力in vitro和in vivo1, 2。
为了在软骨缺损中实现移植间充质干细胞（MSCs）的局部滞留和存活，需要使用支架材料，该材料还需支持细胞后续的分化与增殖。支架的结构可引导组织形成，并允许干细胞产生的细胞外基质得以扩展。既往研究表明，2%琼脂糖支架可支持稳定透明软骨的发育，且不会引发免疫反应3。
在MASI中长期保留移植的干细胞对于软骨再生至关重要。利用氧化铁纳米颗粒标记MSCs，可实现通过无创性MR成像技术对细胞进行长期的体内示踪4。
本演示将介绍使用氧化铁纳米颗粒标记间充质干细胞（MSCs）、制备细胞-琼脂糖复合物以及将这些复合物植入软骨缺损部位的技术。标记后的复合物可通过磁共振成像（MR-Imaging）进行无创追踪。

本演示的目的是展示一种高度可重复的方法，用于在软骨缺损中生成可被磁共振成像（MR成像）可视化的基质相关干细胞植入物。干细胞使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁颗粒Ferumoxides进行标记，与琼脂糖混合后植入软骨缺损区域，并使用7T磁共振扫描仪进行成像。

组织工程学领域融合了工程学、细胞生物学和医学的原理，致力于特定细胞的再生以及……

本演示的目的是展示一种利用标记了HMEs的对苯二酚氧化物来制备MASI的简便且可重复的方法，用于追踪基于干细胞的治疗。通过磁共振成像（MRI）标记，将制备好的培养基加入T75培养瓶中，孵育4小时。随后对细胞进行胰酶消化并洗涤。洗涤细胞后，将细胞重悬三次，并向试管中加入琼脂糖凝胶。现在，细胞已准备好植入软骨缺损部位。你好，我是Alex。我来自加利福尼亚大学旧金山分校放射科的高德尔塔布莱克实验室，即对比剂实验室。我是Lydia Men，同样来自对比剂实验室。今天，我们将向您展示一种用氧化铁纳米颗粒标记间充质干细胞以生成细胞聚集体构建物，并将这些构建物植入软骨缺损部位的操作流程。在我们的实验室中，利用该方法通过磁共振成像对间充质干细胞进行无创示踪。现在，让我们开始吧。首先，细胞需培养至至少80%融合度，培养时间不少于18小时，然后开始标记。在此期间，配制标记培养基，以便在细胞达到融合时可立即使用。具体操作为：按照每毫升无血清培养基中加入100微克铁的剂量，向样品中添加end durum。待细胞生长至融合后，吸除培养基，并用 PBS 或无血清培养基洗涤细胞。随后吸除洗涤液，加入预先配制的标记培养基。将细胞在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 4 小时。孵育四小时后，吸除标记培养基。用 PBS 清洗细胞，然后加入冰冷的胰蛋白酶。待细胞脱落时，用 PBS 洗涤细胞三次，并在 400 ×g 离心五分钟。完成此洗涤步骤后，重悬细胞，计数并评估其活力，最后根据实验需要使用。现在我们来看如何制备基质相关干细胞植入物。首先配制新鲜的琼脂溶液。当琼脂冷却至42摄氏度时，对细胞进行计数，并将其在1.5毫升离心管中离心。离心后，弃去上清液，用Dobe Echo改良的伊格尔培养基重悬细胞，使细胞浓度达到每毫升30×10⁶个细胞。在将细胞与温热的琼脂混合前，先通过反复吹打热的无菌PBS预热移液器吸头，以防止琼脂在吸头内凝固。然后吸取与培养基相同体积的琼脂糖（aros），并将其与细胞悬液充分混合，注意避免产生气泡。混合过程中，将离心管置于预热的水浴中，以确保琼脂糖温度不会降低至凝固，直至悬液均匀。将细胞植入缺损部位后，即可进行磁共振成像（MR Imaging）。现在我们将向您展示一些代表性结果，首先是我们的标记技术，其次是我们的植入技术。标记后，培养瓶中的细胞仍与未标记细胞具有相同的形态。正如 Caspase 3 检测所示，标记细胞的活力未发生改变。标记细胞与凝胶的结合会导致植入物信号丢失，这在T2加权的磁共振图像中可见，而未标记细胞则不显示任何信号。细胞凝胶构建体的切片经普鲁士蓝染色后可见蓝色减少，证实了细胞内铁的积聚。我们刚刚向您展示了如何使用氧化铁纳米颗粒内间期标记机械敏感干细胞，如何用标记后的细胞构建组织工程化聚集体，以及如何将这些聚集体植入软骨缺损部位。进行该操作时，需注意在向细胞悬液中添加预热的培养基之前，应预先温育移液器吸头。此外，Mr.Imaging 还必须避免任何气泡的形成。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Ferumoxides植入人类间质干细胞在软骨缺损的标记

为了评估新的干细胞疗法，重要的是能够以非侵入性方式在活体内追踪注射的细胞。本视频将向您展示如何在活体内用基于氧化铁的对比剂标记人类间充质干细胞和胚胎干细胞，以便随后进行活体磁共振成像。...

使用氧化铁纳米颗粒标记人胚胎干细胞和人骨髓间充质干细胞以实现磁共振成像无创体内示踪

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

我们介绍一种使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁（SPIO）——菲柔莫醇（Feraheme）对干细胞进行标记和追踪的技术。该细胞成像技术利用磁共振（MR）成像进行可视化，可便捷地用于患者干细胞移植成功或失败的长期监测与诊断。...

使用美国食品药品监督管理局批准的氧化铁纳米颗粒 Ferumoxytol 标记干细胞

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基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。...

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

使用自体血清培养人源间充质基质细胞（hMSCs），可降低异种物质引发的排斥风险及其他不良反应。该方法还可回收一部分中胚层前体细胞，从而获得新鲜的hMSCs。将hMSCs包埋于自体纤维蛋白凝块中，便于操作并实现有效的外科植入。...

自体条件下间充质基质细胞的培养与递送：骨科应用的智能策略

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。...

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

本方案描述了一种通过关节内注射，在大鼠膝骨关节炎（KOA）模型中利用远红荧光标记高效监测人脂肪来源的间充质干细胞（haMSCs）细胞存留及生物分布的方法。...

体内追踪荧光脂溶性膜染料标记的人脂肪源性间充质干细胞在大鼠膝骨关节炎模型中的分布

本文介绍了一种在创伤性脑损伤小鼠模型中进行非侵入性间充质干细胞（MSC）递送与示踪的实验方案。采用超顺磁性氧化铁 纳米颗粒作为磁共振成像（MRI）探针，对MSC进行标记，并通过实时MRI技术在经鼻递送后实现非侵入性的活体示踪。...

通过鼻内递送后利用磁共振成像追踪超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在创伤性脑损伤小鼠模型中的分布

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。...

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

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植入氧化铁标记的人类间充质干细胞修复软骨缺损

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