Name: 收获的小鼠精子和人工授精 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习小鼠人工授精技术，从雄性小鼠睾丸中提取精子并注射到发情期雌性小鼠体内。该方法适用于发育生物学和转基因研究中的精确育种控制，无需麻醉即可完成操作。

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我要感谢来自鹿鼠遗传资源中心的 Mike Dewey，感谢他在啮齿类动物繁殖方面提供的宝贵见解、耐心指导和专业知识。

人工授精
人工授精取代自然交配，以提高所有雌性动物的妊娠几率。每1只超排卵的雌性或已知处于动情期的雌性，使用2只雄性。将成年雄性小鼠的尾部附睾置于9%的牛奶悬浮液中，用18号针头切开。精子自由游出数分钟后，将附睾从混合液中取出。用显微镜评估悬浮液中精子的密度和活动力。使用钝头的22号、1½英寸长的针头进行精子注射。在距针尖约3/4处形成一个120°的弯曲th 沿针头方向将针插入阴道，直至弯曲处，并注入0.025–0.05 ml。若有助手协助固定雌性动物于适当位置，则无需使用麻醉剂。
准备
<ol>
<li>使用4只雄性与6只雌性配对</li>
<li>在动物饲养室处死雄性动物</li>
<li>用奶粉配制约5 ml的9%牛奶溶液</li>
<li>取1.5 ml放入小培养皿中</li>
<li>取出附睾和输精管</li>
<li>放入1.5 ml的9%牛奶溶液中</li>
<li>使用两根18号针头，以长切动作切开附睾和输精管，释放精子</li>
<li>去除残留组织，在显微镜下检查精子</li>
</ol>
注射
<ol>
<li>使用钝针以120°角进针</li>
<li>用手固定小鼠并注射混合液。若一人操作固定与注射感到不便，可由两人配合完成。不应使用麻醉剂，因为目前尚无人知晓麻醉可能对实验过程产生何种影响。</li>
<li>每只雌鼠注射0.05ml的精子/乳汁混合液</li>
</ol>
受体雌性
<ol>
<li>对受体雌性小鼠进行阴道涂片检查（此时受体雌性小鼠应处于动情前期/动情期）</li>
<li>至第5天仍未达到动情期的雌性小鼠应&nbsp;可能不应使用</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>培养皿</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-30</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>工具</td><td>BD 生物科学</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>奶粉</td><td>试剂</td><td>任何供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>工具</td><td>国家科学公司</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>工具</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>工具</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液</td><td>试剂</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>22 G 钝针</td><td>工具</td><td>给我</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠精子采集与人工授精

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

鹿鼠属（Peromyscus）啮齿类动物（鹿鼠）是北美最常见的本土哺乳动物。Peromyscus 物种被广泛应用于毒理学、流行病学、生态学、行为学以及遗传学等领域的研究。在此，它们为人工授精技术的演示提供了一个有效的模型。

类似于本视频所展示的方法已在多项鹿鼠研究中使用过，但此前尚未发表详细的实验方案。本文演示了人工授精的基本方法：首先从啮齿类动物体内取出睾丸，然后从附睾和输精管中分离精子。将成熟的精子置于乳状混合液中，在雌性动物排卵时注入其生殖道内。以受精当天记为胚胎发育的第0天，随后可在预定的时间点取出胚胎并进行相应操作。

人工授精可用于多种啮齿类动物，尤其在需要精确胚胎发育时间或难以确定交配时间的情况下至关重要。该技术对于某些物种或品系（包括大多数鹿鼠属 Peromyscus）尤为关键，因为这些动物可能不会立即交配和/或难以判断是否已完成交配。此外，人工授精可为胚胎发育提供精确的时间控制，适用于胚胎发育进程的定位研究和/或转基因实验。由于受精过程可得到保障，因此可减少实验动物的使用数量。该方法对推动鹿鼠属 Peromyscus 的研究体系发挥了重要作用，未来也有望使其他研究领域受益。

本方案展示了从小鼠雄性个体的睾丸中提取精子，然后对雌性小鼠进行授精的方法。在需要精确控制发育研究时间以及进行转基因操作时，该程序非常有用。

鹿鼠属（Peromyscus）啮齿类动物是北美最常见的本土哺乳动物。Peromyscus 物种被广泛应用于多种研究领域……

我叫Amanda Dli，来自加州大学欧文分校Paul Verana博士的实验室。今天我将演示人工授精的操作流程。该过程包括从雄性个体中提取精子，然后将精子注入处于排卵期的雌性个体体内。你可能希望进行这一操作的原因是，雄鼠和雌鼠可能在你需要的时候不交配，或者根本不交配。此外，如果某只小鼠品系非常重要，也可使用冻存的精子进行该操作。该操作过程的演示非常重要，因为许多手册和期刊并未展示正确的小鼠操作步骤。可由一人单独操作小鼠并进行注射，无需对雌鼠使用任何麻醉剂。这意味着雌鼠不会受到任何损伤，并可确保受精过程以最佳状态进行。我们将使用的解剖工具包括两把尖头镊子和一把尖头剪刀。这些将用于贯穿整个睾丸和脂肪组织的分离。完成后，我们将使用镊子分离附睾。使用9%的牛奶将精子转运至雌性体内。它由一份在当地杂货店购买的脱脂奶粉中的 XPBS 制成。将该物质放入小型培养皿中，以隔离方式放置，使精子位于一个局部区域内。使用18号针头切开附睾，以便精子能够游入培养皿中含9%奶粉的溶液中。将精子置于9%的牛奶溶液中，使用一支钝头、22号、呈120度角的针头吸取该溶液。针头连接一个1毫升注射器，随后将0.025毫升溶液注入雌性花鼠（peanut mouse）或啮齿类动物Polyus is体内。实际上，Polyus is是北美地区最丰富的内源性哺乳动物，常见于美国东南部佛罗里达州地区。如您所见，与小家鼠相比，它的体型在眼睛部位略大一些。此外，它的毛色较浅，这也有助于它融入佛罗里达地区常见的沙丘环境中。我将要进行的是分离这只小鼠的整个睾丸区域。该小鼠已1岁，因为已知这种小鼠在圈养条件下可繁殖至四岁。实际上，它们在圈养状态下的寿命尚不明确，因为已有个体存活达七年之久。首先，我将用70%乙醇浸润该雄性个体的下部区域，以确保毛发不会妨碍操作。如您所见，此处的膨大部分即为睾丸。我将切开皮肤的外层，在内壁上做一个小切口，然后进行非常大的横向切割。实际上，我发现此时直接将睾丸推出会更容易，因为脂肪垫很大且易于观察。一旦睾丸暴露出来，你需要做两个切口：一个在脂肪垫上方，以将其分离；另一个在附睾下方，该处连接着另一侧的体壁，切口位置应足够低，以免损伤附睾。睾丸由这个较大的部分构成。此外，附睾位于此处，沿睾丸延伸至上方这一位置。附睾底部看起来像一束意大利面，而脂肪垫则位于顶部。我首先将睾丸上的表皮组织剪除。完成后，稍加牵拉以分离表皮中的脂肪垫。此步骤完成后，我将睾丸翻转过来，尽可能将附睾从脂肪垫中分离出来。完成此操作后，很容易将附睾轻轻从睾丸上撕下，从而将整个附睾从睾丸中分离出来。附睾实际上已沿睾丸侧面断裂。因此这里需要分离出两个不同的部分：一部分在底部，仍然保持连接；另一部分在上部，我将再次将其翻转，使其位于左手以便隔离，这样我就可以用右手进行切割，并立即切除脂肪组织。这样，你就得到了两部分不同的表皮组织

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

收获的小鼠精子和人工授精

本文展示了新开发的 I•Cryo 小鼠精子冷冻保存试剂盒。使用该试剂盒，在5种小鼠品系中，冻融精子获得的二细胞期胚胎发育率 consistently 得到提高。在1.5年期间，利用 I•Cryo...

小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 I·Cryo 试剂盒

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

精液液化是精子从精液凝胶中释放出来的必要条件。本研究提供了从雌性生殖道在交配后收集精液以及测定精液液化时间的操作步骤。...

从小鼠雌性生殖道收集交配后精液并测定精液液化

本文介绍一种通过将慢病毒载体直接注射到受精卵的卵周隙中，以高效促进外源基因整合并制备首建者转基因小鼠的实验方案。...

慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究 Founder 小鼠的简单高效方法

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。...

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

许多子宫内膜异位症的啮齿类动物模型受限于技术复杂性、可重复性差，和/或需要使用免疫缺陷动物或特殊报告基因小鼠。我们提出了一种简化的病灶诱导系统，该系统可应用于任何实验小鼠，具有独立可验证的客观评分系统，且无需进行卵巢切除术或存活手术。...

使用自然动情周期小鼠建立同系小鼠子宫内膜异位症模型

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本文介绍的宫颈操作方法可诱导小鼠假孕，无需使用输精管结扎雄鼠与雌鼠交配。假孕的诱导对于非手术胚胎移植和非手术人工授精的成功至关重要，这两种技术在本文中均有介绍。...

无需使用输精管结扎雄鼠诱导雌鼠假孕以进行非手术胚胎移植或人工授精

本文介绍了一种在小鼠中进行圆头精子细胞注射（ROSI）的方法，该技术具有潜在的临床应用价值，并可用于研究胚胎发育背后的机制。...

小鼠圆头精子细胞注射

本文介绍了一种建立卵胞浆内单精子注射（ICSI）-胚胎移植（ET）小鼠模型的方案，可用于观察与年龄相关的葡萄糖代谢变化，这些变化可能归因于ICSI技术，从而为该技术对人类发育潜在的长期影响提供见解。...

监测小鼠子代经胞浆内精子注射后的血糖水平

学习小鼠人工授精技术，从雄性小鼠睾丸中提取精子并注射到发情期雌性小鼠体内。该方法适用于发育生物学和转基因研究中的精确育种控制，无需麻醉即可完成操作。

小鼠精子采集与人工授精

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