Name: 液相恢复GELFREE 8100分馏系统使用基于分子量分馏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-03T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习使用GELFREE 8100分馏系统进行基于分子量的蛋白质液相分馏。该系统可在90分钟内高效处理八个样品，实现高回收率，适用于复杂组织匀浆的下游蛋白质组学分析。

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1. 样品蛋白制备
<ol>
 <li>在500 μl的微量离心管中，加入以下成分：</li>
</ol>
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>添加体积：</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>*蛋白样品（最多 1 mg）</td>
 <td>最多 112 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>上样缓冲液（5X）试剂盒中提供</td>
 <td>30 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 1M</td>
 <td>8 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 Ω H2O</td>
 <td>x μL，补足至总体积 150 μL**</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
<ol start="2">
 <li>在 95°C 下变性样品 5 分钟。冷却至室温。</li>
</ol>
*待分离的蛋白质总量取决于样品的复杂程度。对于组织匀浆等更复杂的样品，建议每通道上样量为 150-200 μg。
**如果样品体积小于 112 μL，加入 18 Ω H2O 使最终体积达到 150 μL。
2. 上样 GELFREE 胶条
<ol>
 <li>从铝箔袋中取出 GELFREE 8100 电泳 cartridge。</li>
 <li>移除并丢弃封板膜。</li>
 <li>使用移液器从 cartridge 的各个腔室中移除保存缓冲液。如果将使用 cartridge 的全部 8 个腔室，可将 cartridge 倒置以排净各腔室中的保存缓冲液。</li>
 <li>通过向每个 cartridge 腔室中加入 GELFREE 运行缓冲液，准备上样，具体操作如下：</li>
</ol>
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>GELFREE 胶条室</td>
 <td>需加入的 GELFREE 电泳缓冲液体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>阳极缓冲液储液槽</td>
 <td>8 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>阴极缓冲液储液槽</td>
 <td>6 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>收集室</td>
 <td>每个 100 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol start="5">
 <li>移除并丢弃样品加样室中的任何缓冲液。</li>
 <li>使用8通道移液器将150 μL样品加入加样室中。</li>
 <li>将装有样品的 cartridge 放入 GELFREE 8100 分离系统中。降下电极阵列并关闭盖子。</li>
</ol>
3. 运行检测卡
 <ol>
 <li>使用仪器的触摸屏显示屏，按下 方法 单击按钮以查看预设方法列表。每种预设方法均包含特定的电压设置和基于时间的暂停程序，旨在分离特定分子量范围内的蛋白质。GELFREE 8100 将根据方法中设定的时间间隔自动暂停，以便进行组分收集。</li>
 <li>一旦确定了合适的方法，按下 获取 按钮，然后使用屏幕上的小键盘输入所需预设程序的编号。按下 好的，然后按下 应用 按钮。所应用的方法将显示在主屏幕底部。 </li>
 <li>要选择运行中将使用的通道（样本数量），请按下 通道 主屏幕上的按钮。要选择全部八个通道，请按 select 全部然后，按压 完成 返回主屏幕。 </li>
 <li>确保安全盖已关闭，且屏幕底部的指示灯为绿色。 </li>
 <li>开始蛋白质分离时，按下 开始当需要收集组分时，组分收集站将自动暂停。 注意：系统运行期间，屏幕左侧方框中显示的圆圈表示各通道的状态。绿色圆圈表示通道处于活动状态，黄色圆圈表示仪器已暂停，红色圆圈表示通道出现故障。通道状态圆圈右侧显示施加的电压和电流。只有当状态圆圈变为黄色且仪器屏幕上出现文本警报时，方可取出样品。</li>
 <li>打开仪器盖子，使用8通道移液器从每个收集室中吸取150 μL液体以去除组分。 </li>
 <li>去除各组分后，向每个通道加入 100 μl GELFREE Running Buffer，上下吹吸两次，对收集室清洗两遍。 </li>
 <li>洗涤后，向收集室中重新加入 100 μL GELFREE 运行缓冲液，盖上盖子，并按下 继续 按钮 </li>
 <li>GELFREE 8100 将持续运行至下一个时间间隔。实验剩余总时间显示在屏幕右侧。切换显示 剩余时间，已用时间 和 暂停的时间， 按下显示时间的方框上方的按钮。</li>
 <li>所有组分收集完毕后，可立即用于后续下游实验，如等电聚焦或凝胶电泳，或用于液相色谱-质谱联用及免疫亲和分析。</li>
</ol>
4. 代表性结果
使用 GELFREE 分离系统将 200 μg 牛肝匀浆分成 12 个组分，每个组分各一份。每个组分取 6 μL 在标准的一维 SDS-PAGE 凝胶上电泳，并进行银染。如图 1 所示，蛋白质样品被分离为 12 个不同的组分，分子量范围从 3.5 kDa 到 150 kDa。泳道 1 和 14 中还显示了分子量标准品（ColorBurst，Sigma）。本图展示了使用 GELFREE 8100 系统进行蛋白质分离所达到的高回收率。本图所示凝胶代表了从 200 μg 蛋白质中回收的蛋白的 4%。
<img src="/files/ftp_upload/1842/1842fig1tmb.jpg" alt="SDS-PAGE 凝胶电泳结果、蛋白质条带、分子量标记物、蛋白质分离。" border="0" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1. 使用 GELFREE 分离系统分离牛肝匀浆中的蛋白质。 每个150 μL组分取6 μL上样，在一维SDS-PAGE凝胶上电泳并进行银染。同时按指示上样了分子量（MW）标准蛋白。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1842/1842fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。

<ol><li>Tran, J. C., Doucette, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Size+Separation+of+Intact+Proteins+in+Solution+Phase+for+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem.%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Size Separation of Intact Proteins in Solution Phase for Mass Spectrometry.</a> Anal Chem.. , (2009).</li>
</ol>

本文作者受雇于 Protein Discovery，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

GELFREE 8100 分离系统提供了一种快速、简便且可重复的方法，用于将复杂的蛋白质样品按分子量大小分离为不同的组分。这种新型的分离方法无需进行条带或斑点切割，可在90分钟内实现宽分子量范围内蛋白质的分离。该方法能够加载相对大量的样品，并以液相回收各组分，特别适用于低丰度蛋白质的分离与分析，而这些蛋白质通常较难被检测。所得的各组分可广泛应用于多种实验技术，如液相色谱-质谱联用（LC-MS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）以及免疫印迹（immunoblotting）。

使用 gelfree 8100 分离系统进行基于分子量的液相回收分离

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

GELFREE 8100 分离系统是一种新型蛋白质分离系统，旨在基于分子量进行分离时最大化蛋白质回收率。该系统由一次性使用的、可容纳8个样品的 cartridges 和一台台式 GELFREE 分离仪组成。在分离过程中，阳极和阴极储液槽之间施加恒定电压，每种蛋白质混合物通过电泳作用从加样室进入特制的凝胶柱。蛋白质首先在浓缩胶中富集形成一条紧密条带，随后在分离胶中根据各自的电泳迁移率进行分离。当蛋白质从凝胶柱中洗脱时，它们被捕获并富集在收集室的液相中，完全脱离凝胶。随后，仪器在特定时间间隔暂停，使用移液器收集各组分。此过程重复进行，直至收集到所有目标组分。若在 cartridge 上运行的样品少于8个，未使用的加样室可在后续分离中继续使用。
该新型技术可同时快速、简便地分离多达8种复杂的蛋白质混合物，相较于以往可用的分级分离方法具有多项优势。该系统每个通道可对最多1 mg的总蛋白进行分级，每根色谱柱总计可处理8 mg蛋白。在广泛的分子质量范围内，完整蛋白质可根据其分子量进行分离，同时保留分析物重要的理化性质。液相捕获技术可实现高回收率，且无需进行条带或斑点切割，从而使分级过程具有高度的可重复性1。

配套视频介绍了GELFREE 8100分离系统，该系统可根据分子量对复杂的蛋白质样品进行分离，并以液相形式回收各组分。视频阐述了该技术的工作原理、使用方法，并提供了实验结果，包括对分馏后的牛肝匀浆进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的数据。

使用 GELFREE 8100 分离系统进行基于分子量的液相回收分离

GELFREE 8100 分离系统是一种新型蛋白质分离系统，旨在基于分子量分离过程中最大限度地提高蛋白质回收率……

大家好，我叫 Jay Harkins，是 Protein Discovery 的一名科研人员。今天我将演示如何轻松使用新型无凝胶 8, 100 分离系统，实现基于分子量的高回收率分级分离。使用无凝胶系统，每个通道最多可上样一毫克总蛋白，并可在约90分钟内重复性地分离多达八个样品。该系统包含仪器、一次性色谱柱以及进行实验所需的所有缓冲液。现在让我们开始操作。开始此操作时，准备并标记最多八个 500 微升离心管，每管中加入最多 1 毫克的蛋白质样品，体积不超过 112 微升。样品中蛋白质的含量取决于样品的复杂程度。对于更复杂的样品，例如本演示中使用的组织匀浆，每个通道加入 150 至 200 微克蛋白可获得最佳结果。接下来，向每个蛋白样品中加入 30 微升 5× 样品缓冲液（该缓冲液由凝胶自由上样试剂盒提供）。然后向每个蛋白样品中加入 8 微升 1 摩尔的 DTT。然后用水将每个样品调整至终体积为150 µL。随后将离心管在95 °C下加热5分钟以使样品变性。在样品冷却期间，使其自然冷却至室温。从铝箔袋中取出无凝胶 8, 100 羧酸盒。移除并丢弃板封膜。使用移液器从羧酸盒的各个腔室中移除保存缓冲液。如果将使用芯片的所有八个腔室，则将芯片倒置，以排空各腔室中的保存缓冲液。随后，向每个阳极缓冲液储液槽中加入8毫升无凝胶运行缓冲液。向每个阴极缓冲液储液槽中加入6毫升缓冲液，并向每个收集腔室中移液100微升。使用八通道100至200微升移液器，移除并弃去从阴极缓冲液储液池流入样品加样室的任何缓冲液，然后立即向加样室中加入样品。样品加样完成后，将试剂盒放入无凝胶8通道100分离系统中。然后降低电极阵列，并通过仪器触摸屏上的图形化用户界面关闭盖子；在界面中进入可用的预设程序方法列表。按下方法按钮以选择适当的方法。按下检索按钮，然后使用屏幕上的小键盘输入所需预设方法的编号，再按下确定。然后按下应用按钮。已应用的方法将显示在主屏幕底部。每个预设程序均由特定的电压设置和基于时间的暂停步骤组成，旨在分离特定分子量范围内的蛋白质。选择合适的方法后，请按下主屏幕上的通道按钮。然后选择运行中将使用的通道。要选择全部八个通道，请按“全选”，然后按“完成”。要返回主界面，请确保安全盖已关闭，且屏幕底部的指示灯为绿色。此时按下“开始”按钮以启动实验。系统运行时，屏幕左侧方框内显示的圆形图标表示各通道的状态。绿色圆形表示该通道处于激活状态。施加的电压和电流显示在通道状态圆圈的右侧。Gel Free 8, 100 将根据方法中设定的时间间隔自动暂停，以便收集组分。当仪器暂停以收集组分时，会出现一个文本框提示暂停已发生，同时状态圆圈将变为黄色。在上样室中，向阳极和阴极储液槽之间施加恒定电压。在此电位作用下，蛋白质混合物通过电泳驱动从上样室进入特制的精密凝胶。蛋白质首先在浓缩胶中聚集形成一条清晰的条带，然后在分离胶中根据各自的分子量进行分离。当蛋白质从凝胶中洗脱时，它们会在液相中被捕获并浓缩。在收集室中，凝胶被去除。随后，仪器暂停运行。根据预设的时间间隔，使用移液器收集相应的组分。然后再次施加电势，以排除并截留第二个目标分子量组分。此过程重复进行，直至收集完所有目标组分。每个试剂盒包含八条独立的电泳通道，用户可根据需要使用相应数量的通道，并将未使用的通道保留至以后使用。要移出组分，请打开仪器盖子，然后使用内置的通道移液器。将每个收集室中的150微升液体转移至收集管或微量孔板中。去除各组分后，使用无胶运行缓冲液清洗收集室两次，每次每通道加入100微升，并上下吹打两次。清洗后，向收集室中重新加入100微升无胶运行缓冲液。盖上盖子，按下继续按钮。游离凝胶 8、100 将持续运行至下一个时间间隔。实验剩余的总时间显示在屏幕右侧。按下显示时间的方框上方的按钮，可在剩余时间、已用时间和暂停时间之间切换。所有组分收集完毕后，可立即用于后续的下游制备，例如等电聚焦或凝胶电泳，或用于液相色谱、质谱或免疫亲和分析。在本实验中，将8个各含200微克蛋白质的样品分别分馏为12个组分，共得到96个组分。为直观展示分馏结果，取自牛肝匀浆样品的每份12个组分各取等分试样，通过标准的一维凝胶电泳分离并进行银染。如图所示，蛋白质样品被分离为12个不同的组分，其分子量范围从3.5千道尔顿到150千道尔顿。本图所示凝胶展示了无凝胶8、100系统将大量蛋白质分离为不同分子量组分的能力。该技术是一种极为强大的工具，适用于基于质谱的自上而下和自下而上蛋白质组学研究，以及需要单一纯化的完整蛋白质分子量组分的免疫亲和实验。很高兴向您展示如何轻松使用无凝胶 8,100 分级系统，将您的样品可重复地分离为不同的分子量组分，并实现高液体相回收率。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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液相恢复GELFREE 8100分馏系统使用基于分子量分馏

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