液相恢复GELFREE 8100分馏系统使用基于分子量分馏
December 3rd, 2009
影随行介绍GELFREE 8100分馏系统的使用，哪些分区复杂的蛋白质样品分子量的基础上，并恢复在液相组分。视频描述技术如何工作，如何使用它，并提供与分割牛的肝组织匀浆的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得到的数据，。
大家好，我是 Jay Harkins。我是 Protein Discovery 的一名研究科学家。今天，我将演示使用新型无凝胶 8， 100 分级分离系统实现基于高回收分子量的分级分离是多么容易。
使用无凝胶，每个通道最多可加载 1 mg 总蛋白，并在约 90 分钟内可重现地分离多达 8 个样品。因此，该系统包括仪器、一次性小柱和进行实验所需的所有缓冲液。那么让我们开始吧。
通过设置每个试管并标记最多 8 个 500 μL 试管来开始此过程。添加最多 1 毫克蛋白质样品，体积高达 112 μL。样品中蛋白质的量取决于样品的复杂程度。
对于更复杂的样品，例如用于本演示的组织匀浆，每个通道 150 至 200 μg 将产生最佳结果。接下来，加入 30 微升 5 x 样品缓冲液，该缓冲液在无凝胶小柱试剂盒中提供。向每个蛋白质样品中加入 8 微升 1 摩尔 DTT。
然后用水调整每个样品至最终体积为 150 μL。然后将样品瓶在 95 摄氏度下加热 5 分钟，使样品变性。在样品冷却的同时，让加热的样品冷却至室温。
从铝箔袋中取出 8， 100 凝胶小柱。取出并丢弃板密封剂。使用移液管从卡盒隔室中取出储存缓冲液。
如果要使用小柱的所有八个腔室，请倒置小柱以从隔室中排出储存缓冲液。接下来，将 8 毫升无凝胶电泳缓冲液添加到每个阳极缓冲液储液器中。向每个阴极缓冲液储液槽中加入 6 mL，并将 100 μL 移液到每个收集室中。
使用 8 通道 100 至 200 μL 移液器，取出并丢弃从阴极缓冲液储液槽流入样品上样室的任何缓冲液，并立即将样品上样至上样室。上样后，将小柱放入无凝胶 8， 100 分离站中。然后使用仪器触摸屏上易于编程的图形用户界面降低电极阵列并关闭盖子，转到可用的预编程方法列表。
通过按下方法按钮选择合适的方法。按下检索按钮并输入所需的预编程方法的编号 使用屏幕上的键盘按 ok。然后按应用按钮。
已应用的方法将出现在主屏幕的底部。每种预编程方法都由设定电压和基于时间的暂停组成，旨在分辨特定分子量范围内的蛋白质。选择适当的方法后，按下主屏幕上的频道按钮。
然后选择将在运行中使用的渠道。要选择所有八个通道，请按全选。然后按 done。
要返回主屏幕，请确保安全盖已关闭，并且屏幕底部的指示灯为绿色。现在按下开始键，在系统运行时开始实验，屏幕左侧框中显示的圆圈描述了每个通道的状态。绿色圆圈表示通道处于活动状态。
施加的电压和电流显示在通道状态圆圈的右侧。无凝胶 8， 100 将按方法中指定的间隔自动暂停以进行馏分收集。当仪器暂停以收集馏分时，将出现一个文本框，通知您已暂停，并且状态圆圈将变为黄色。
在墨盒内部，在阳极和阴极储液槽之间施加恒定电压。在这种电位下，蛋白质混合物被电泳驱动从装载室进入专门设计的精密铸件。凝胶蛋白首先在浓缩凝胶的尖锐条带内堆积，然后根据它们在分离凝胶中各自的分子量进行分离。
当蛋白质从凝胶中洗脱时，它们被捕获并浓缩在液相中。在收集室中无凝胶。然后，仪器将暂停。
根据预选的时间间隔，使用移液管收集馏分。然后再次施加电位以暗示结束捕获第二个感兴趣的分子量组分。然后重复此过程，直到收集到所有所需的馏分。
每个探针筒包含 8 个独立的电泳通道，因此用户可以根据需要运行任意数量的通道，并将未使用的通道保存以备后用。要去除馏分，请打开仪器的盖子，然后使用固有通道移液器。将每个收集室中的 150 微升液体转移到收集管或多孔板中。
去除馏分后，用无凝胶电泳缓冲液洗涤收集室两次，每通道添加 100 μL，并上下移液两次。洗涤后，将 100 μL 无凝胶电泳缓冲液加入收集室中。合上盖子并按下恢复按钮。
无凝胶 8， 100 将运行到下一个时间间隔。实验中剩余的总时间显示在屏幕右侧。按下显示时间框上方的按钮，可在剩余时间、已用时间和暂停时间之间切换。
收集完所有馏分后，可立即用于进一步的下游制备，例如等电聚焦或凝胶电泳，或使用液相色谱、质谱或免疫亲和法进行分析。在本演示中，将 8 个 200 μg 的蛋白质样品分成 12 个馏分，每个馏分共 96 个馏分。为了可视化牛肝匀浆样品中 12 个组分中每个组分的分级分离和等分结果，然后在标准 1D 凝胶上运行并进行银染。
如图所示，将蛋白质样品分离成 12 个不同的组分，分子量范围从 3.5 千道尔顿到 150 千道尔顿。此处显示的凝胶突出了无凝胶 8， 100 系统将大量蛋白质分离成不同分子量组分的能力。对于使用质谱法进行自上而下和自下而上的蛋白质组学以及需要单个纯化完整蛋白质分子量组分的免疫亲和实验，这是一个非常强大的工具。
很高兴向您展示使用无凝胶 8， 100 分离系统将样品可重现地分配为离散分子量馏分，并实现高液相回收率是多么容易。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本视频演示了GELFREE 8100分离系统，该系统根据分子量高效地分区复杂的蛋白质样品。该过程允许在液相中高效回收分数，便于进一步分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质分离
- 电泳
- 生化分析
背景
- GELFREE 8100系统是为高通量蛋白质分析而设计的。
- 它允许分离蛋白质而无需使用凝胶。
- 这种方法特别适用于复杂的样品，如组织均质物。
- 高效的分离可以增强下游应用。
研究目的
- 展示GELFREE 8100分离系统的功能。
- 展示系统的易用性和效率。
- 提供有关分离过程和结果数据的洞察。
使用的方法
- 用特定缓冲液制备蛋白质样品。
- 使用一次性滤芯进行分离。
- 基于分子量的电泳分离。
- 收集分数以进行进一步分析。
主要结果
- 成功将蛋白质样品分区为多个分数。
- 展示了分数收集的可重复性和效率。
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的视觉结果。
- 分析中立即进行下游应用的潜力。
结论
- GELFREE 8100系统提供了一种可靠的蛋白质分离方法。
- 它简化了蛋白质分析研究人员的工作流程。
- 该技术增强了分析复杂蛋白质混合物的能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
The GELFREE 8100 Fractionation System enables high-recovery, molecular weight-based protein separation in liquid phase, eliminating gel-dependent steps and improving reproducibility. This capability supports early discovery workflows by generating purified fractions for downstream proteomic analysis, reducing technical variability in target validation and assay development. Its multiplexed, cartridge-based design allows parallel processing of up to eight samples, enhancing throughput in lead identification and mechanistic de-risking efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein fractions across a broad molecular weight range.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible fractionation of complex samples like tissue homogenates.
- Predictive Value: Generates purified fractions that improve confidence in target engagement and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces liquid-phase fractions compatible with downstream assays such as mass spectrometry and immunoaffinity capture.
- Operational Value: Eliminates gel excision steps, increasing standardization and reducing hands-on time.
- Scalability: Enables preparation of standardized fraction libraries for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Fraction outputs maintain physiochemical properties, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Facilitates correlation of molecular weight-specific fractions with functional activity in disease-relevant systems.
- Portfolio Triage: Enables risk-adjusted advancement by isolating proteoforms for functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing fractionation outputs that feed into analytical and functional validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving complex mixtures into discrete molecular weight fractions.
- Screening: Generates assay-ready fractions with high recovery and reproducibility for compound screening.
- Analytics: Delivers quantitative, liquid-phase outputs suitable for LC-MS and western blot analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by preserving protein integrity for functional assays.
- Enterprise Reuse: Cartridge-based design allows unused channels to be stored for future runs, promoting resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high-fidelity molecular weight separation and reduced sample loss.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and elimination of gel-based variability.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable fractionation data and reduced technical failure rates.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of targets based on fraction-specific functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein sample preparation and electrophoretic separation principles.
- Dependent on access to the GELFREE 8100 instrument and proprietary cartridges and buffers.
- Necessitates standardized protocols for sample loading, voltage application, and fraction collection timing.
- Adaptation considerations for varying sample types (e.g., serum, cell lysates, tissue homogenates).
- Practical limitation: Fraction resolution is constrained by predefined time-based pauses in the method, requiring method optimization for novel mass ranges.
