使用 GELFREE 8100 分离系统进行基于分子量的液相回收分离
2009年12月3日
配套视频介绍了GELFREE 8100分离系统，该系统可根据分子量对复杂的蛋白质样品进行分离，并以液相形式回收各组分。视频阐述了该技术的工作原理、使用方法，并提供了实验结果，包括对分馏后的牛肝匀浆进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的数据。
大家好，我叫 Jay Harkins，是 Protein Discovery 的一名科研人员。今天我将演示如何轻松使用新型无凝胶 8, 100 分离系统，实现基于分子量的高回收率分级分离。
使用无凝胶系统，每个通道最多可上样一毫克总蛋白，并可在约90分钟内重复性地分离多达八个样品。该系统包含仪器、一次性色谱柱以及进行实验所需的所有缓冲液。现在让我们开始操作。
开始此操作时，准备并标记最多八个 500 微升离心管，每管中加入最多 1 毫克的蛋白质样品，体积不超过 112 微升。样品中蛋白质的含量取决于样品的复杂程度。
对于更复杂的样品，例如本演示中使用的组织匀浆，每个通道加入 150 至 200 微克蛋白可获得最佳结果。接下来，向每个蛋白样品中加入 30 微升 5× 样品缓冲液（该缓冲液由凝胶自由上样试剂盒提供）。然后向每个蛋白样品中加入 8 微升 1 摩尔的 DTT。
然后用水将每个样品调整至终体积为150 µL。随后将离心管在95 °C下加热5分钟以使样品变性。在样品冷却期间，使其自然冷却至室温。
从铝箔袋中取出无凝胶 8, 100 羧酸盒。移除并丢弃板封膜。使用移液器从羧酸盒的各个腔室中移除保存缓冲液。
如果将使用芯片的所有八个腔室，则将芯片倒置，以排空各腔室中的保存缓冲液。随后，向每个阳极缓冲液储液槽中加入8毫升无凝胶运行缓冲液。向每个阴极缓冲液储液槽中加入6毫升缓冲液，并向每个收集腔室中移液100微升。
使用八通道100至200微升移液器，移除并弃去从阴极缓冲液储液池流入样品加样室的任何缓冲液，然后立即向加样室中加入样品。样品加样完成后，将试剂盒放入无凝胶8通道100分离系统中。然后降低电极阵列，并通过仪器触摸屏上的图形化用户界面关闭盖子；在界面中进入可用的预设程序方法列表。
按下方法按钮以选择适当的方法。按下检索按钮，然后使用屏幕上的小键盘输入所需预设方法的编号，再按下确定。然后按下应用按钮。
已应用的方法将显示在主屏幕底部。每个预设程序均由特定的电压设置和基于时间的暂停步骤组成，旨在分离特定分子量范围内的蛋白质。选择合适的方法后，请按下主屏幕上的通道按钮。
然后选择运行中将使用的通道。要选择全部八个通道，请按“全选”，然后按“完成”。
要返回主界面，请确保安全盖已关闭，且屏幕底部的指示灯为绿色。此时按下“开始”按钮以启动实验。系统运行时，屏幕左侧方框内显示的圆形图标表示各通道的状态。绿色圆形表示该通道处于激活状态。
施加的电压和电流显示在通道状态圆圈的右侧。Gel Free 8, 100 将根据方法中设定的时间间隔自动暂停，以便收集组分。当仪器暂停以收集组分时，会出现一个文本框提示暂停已发生，同时状态圆圈将变为黄色。
在上样室中，向阳极和阴极储液槽之间施加恒定电压。在此电位作用下，蛋白质混合物通过电泳驱动从上样室进入特制的精密凝胶。蛋白质首先在浓缩胶中聚集形成一条清晰的条带，然后在分离胶中根据各自的分子量进行分离。
当蛋白质从凝胶中洗脱时，它们会在液相中被捕获并浓缩。在收集室中，凝胶被去除。随后，仪器暂停运行。
根据预设的时间间隔，使用移液器收集相应的组分。然后再次施加电势，以排除并截留第二个目标分子量组分。此过程重复进行，直至收集完所有目标组分。
每个试剂盒包含八条独立的电泳通道，用户可根据需要使用相应数量的通道，并将未使用的通道保留至以后使用。要移出组分，请打开仪器盖子，然后使用内置的通道移液器。将每个收集室中的150微升液体转移至收集管或微量孔板中。
去除各组分后，使用无胶运行缓冲液清洗收集室两次，每次每通道加入100微升，并上下吹打两次。清洗后，向收集室中重新加入100微升无胶运行缓冲液。盖上盖子，按下继续按钮。
游离凝胶 8、100 将持续运行至下一个时间间隔。实验剩余的总时间显示在屏幕右侧。按下显示时间的方框上方的按钮，可在剩余时间、已用时间和暂停时间之间切换。
所有组分收集完毕后，可立即用于后续的下游制备，例如等电聚焦或凝胶电泳，或用于液相色谱、质谱或免疫亲和分析。在本实验中，将8个各含200微克蛋白质的样品分别分馏为12个组分，共得到96个组分。为直观展示分馏结果，取自牛肝匀浆样品的每份12个组分各取等分试样，通过标准的一维凝胶电泳分离并进行银染。
如图所示，蛋白质样品被分离为12个不同的组分，其分子量范围从3.5千道尔顿到150千道尔顿。本图所示凝胶展示了无凝胶8、100系统将大量蛋白质分离为不同分子量组分的能力。该技术是一种极为强大的工具，适用于基于质谱的自上而下和自下而上蛋白质组学研究，以及需要单一纯化的完整蛋白质分子量组分的免疫亲和实验。
很高兴向您展示如何轻松使用无凝胶 8,100 分级系统，将您的样品可重复地分离为不同的分子量组分，并实现高液体相回收率。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。
概述
本视频展示了GELFREE 8100分离系统，该系统可根据分子量高效分离复杂的蛋白质样品。该过程可实现液相中高回收率的组分收集，便于后续分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质分级分离
- 电泳
- 生物化学分析
背景
- GELFREE 8100 系统专为高通量蛋白质分析而设计。
- 该系统能够在不使用凝胶的情况下实现蛋白质的分离。
- 此方法对于组织匀浆等复杂样品尤为适用。
- 高效的组分分离可显著提升下游应用的效果。
研究目的
- 展示 GELFREE 8100 分离系统 的功能。
- 演示该系统的操作简便性与高效性。
- 提供对分离过程及所得数据的深入理解。
使用的方法
- 使用特定缓冲液制备蛋白质样品。
- 使用一次性色谱柱进行组分分离。
- 基于分子量的电泳分离。
- 收集各组分以用于进一步分析。
主要结果
- 成功将蛋白质样品分离为多个组分。
- 在组分收集过程中表现出良好的可重复性和高效性。
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的可视化结果。
- 可直接用于后续分析应用，具有较大潜力。
结论
- GELFREE 8100 系统提供了一种可靠的蛋白质分级分离方法。
- 它简化了研究人员在蛋白质分析中的工作流程。
- 该技术增强了对复杂蛋白质混合物的分析能力。
常见问题
行业重要性概述
GELFREE 8100 分离系统可在液相中实现高回收率、基于分子量的蛋白质分离，消除对凝胶依赖的步骤，提高实验重复性。该功能通过为下游蛋白质组学分析提供纯化的蛋白组分，支持早期发现研究工作流程，降低靶点验证和检测方法开发中的技术变异性。其多重化、基于 cartridge 的设计可平行处理多达八个样本，提升先导化合物鉴定和作用机制去风险化工作的通量。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离宽分子量范围内的完整蛋白质组分，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过对组织匀浆等复杂样品进行可重复的分级分离，支持生物学风险降低。
- 预测价值：生成纯化的组分，提高对靶点结合和通路分析的信心。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：产生适用于质谱分析和免疫亲和捕获等下游检测的液相组分。
- 操作价值：省去胶内切胶步骤，提高标准化程度并减少人工操作时间。
- 可扩展性：可制备用于筛选实验的标准化组分文库。
转化与临床前研究
- 转化连续性：组分输出物保持理化特性，支持在临床前模型中进行生物标志物的比对。
- 机制去风险化：促进在与疾病相关的系统中，将特定分子量的组分与功能活性相关联。
- 项目优先级筛选：通过分离蛋白质异构体以进行功能验证，实现基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该系统适用于从假设验证到先导物鉴定的整个发现流程，可提供用于分析和功能验证工作流程的组分输出。
- Discovery Biology：通过将复杂混合物分离为离散的分子量组分，支持假设验证。
- Screening：生成适用于化合物筛选的高回收率、高重复性的即用型组分。
- Analytics：提供适用于液相色谱-质谱（LC-MS）和蛋白质印迹（western blot）分析的定量液相输出。
- Translational Research：通过保持蛋白质完整性以用于功能分析，连接发现研究与临床前研究。
- Enterprise Reuse：基于 cartridge 的设计允许将未使用的通道储存起来用于后续运行，提高资源利用效率。
运营与企业影响
- 科学价值：通过高保真分子量分离和减少样品损失，实现可预测的置信度。
- 操作价值：标准化、可重复性，以及消除基于凝胶的变异性。
- 战略价值：通过可靠的分馏数据和降低技术失败率，改善决策判断（通过/不通过）。
- 项目影响：基于特定组分的功能数据，实现靶点的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备蛋白质样品制备和电泳分离原理方面的专业知识。
- 依赖于对 GELFREE 8100 仪器以及专用 cartridges 和缓冲液的获取。
- 需要标准化的样品上样、电压施加和组分收集时间的实验流程。
- 针对不同样品类型（如血清、细胞裂解液、组织匀浆）需进行方法适应性调整。
- 实际限制：组分分辨率受限于方法中预设的基于时间的暂停步骤，针对新的分子质量范围需优化实验方法。
