乳腺上皮移植操作步骤

本视频演示了获取记忆的实验操作步骤。分离上皮组织，清除记忆脂肪垫，并将外源性上皮组织移植到三周龄小鼠体内以研究记忆发育过程。在该阶段，记忆上皮树的生长局限于乳头周围区域，而脂肪垫中几乎不含记忆上皮组织。随着小鼠的发育成熟，上皮树逐渐向脂肪垫内延伸生长。

到七周龄时，上皮导管树已延伸至整个脂肪垫。若在三周龄时移除含有上皮的小部分脂肪垫，内源性上皮将无法重新占据该脂肪垫，此时该脂肪垫被称为“已清除”，并在成年后仍保持清除状态。然而，移植的供体上皮组织或上皮细胞则具有潜力在已清除的宿主脂肪垫中重新建立并延伸出完整的导管树。

脂肪垫。随后可利用组织学方法监测从转基因或实验动物移植的组织中记忆发育的进展。大家好，我叫Joseph Jerry，来自马萨诸塞大学兽医与动物科学系。

大家好，我叫 Karen Dunphy。我在 Jerry 实验室工作。今天我们要进行乳腺上皮移植实验。

我们采用此方法研究记忆性肿瘤发生的分子与细胞基础，并建立乳腺癌模型。现在开始操作。移植过程的第一步是从供体小鼠中获取记忆性上皮组织。

首先用70%乙醇清洗一只刚处死的雌性小鼠，注意不要刺破腹腔的SRU膜。从耻骨到胸骨沿正中矢状面切开皮肤，然后从耻骨处的初始切口向每条后肢方向各做一斜切口。

使用弯头镊子夹住SRUs的膜结构，然后使用直齿镊夹住皮肤的切缘，小心地将体壁从S cs膜结构上剥离。

为了暴露附着于体壁下侧的第四对腹股沟记忆腺，需在记忆腺内寻找位于三条显著血管交汇处的淋巴结，该淋巴结可在脂肪垫中触诊为一个致密的结节。用眼科剪的尖端剪除淋巴结周围脂肪组织。然后用食指从皮肤表皮侧施加压力，使淋巴结从脂肪垫中隆起，将其夹取分离。

用一把弯镊子丢弃淋巴结。现在，在固定皮肤边缘的同时，用弯镊子的弯曲边缘夹住脂肪垫，沿脂肪垫的方向朝小鼠背部逐渐将其从体壁剥离，完整地取出整个脂肪垫。

将记忆腺置于无菌塑料切块板上，加入少量培养基，约200 µL，以保持腺体表面湿润。然后用新的剃刀片将腺体切成约1毫米大小的组织块。将切碎的腺体均分为四份。

然后使用镊子将冻存液均匀分装至四个冻存管中。将冻存管放入装有250毫升异丙醇的Nalgene细胞冻存盒外室中。随后将该冻存盒置于-70°C环境中保存24小时。

24小时后，将冷冻保存的记忆片段小管转移至液氮中，待需要进行移植时取出。每支冻存管中含有足量的记忆腺片段，可用于移植到四至八只宿主小鼠的去脂肪垫中。通过脚趾夹捏法确认三周龄宿主小鼠的麻醉深度后，将小鼠仰卧位牢固固定于手术台上，四肢伸展，使其腹部绷紧。

术前应皮下注射镇痛药布比卡因或丁丙诺啡。使用镊子以酒精和含碘消毒剂清洁手术区域。在骨盆上方几毫米处夹住皮肤，并将其从腹部提起。

小心地剪开皮肤，确保最初的切口不要过于靠近尿道，以免伤口夹的放置影响小鼠排尿。接下来，注意不要刺破SRU的膜组织，从耻骨向胸骨方向沿正中矢状面切开皮肤。

从最初的切口开始，沿中线向骨盆两侧的后肢方向，斜向切开皮肤。使用弯头镊子轻轻夹住腹壁的塞尔奥斯膜。然后用组织镊子夹住皮肤的切缘，将体壁从塞尔奥斯膜上轻轻拉开。

为了暴露第四腹股沟记忆腺，需先辨认第四记忆腺。辨认第五记忆腺，烧灼乳头结节及其通向该结节的两条动脉。分离第四和第五腺体，随后烧灼第五腺体的边缘。

接下来，使用剪刀在淋巴结腹侧的脂肪垫处横向剪开，以分离第四乳腺的脂肪垫。用弯头镊子牢固地夹住脂肪垫的腹侧部分，并将其从腹壁拉开。建议将切除的组织夹在两张标记好的载玻片之间，整体压紧，并置于car noise固定液中固定。

随后可对组织进行染色、封片，并评估切缘是否干净。用镊子清除脂肪垫切除区域周围残留的所有记忆腺组织。此时，动物已准备好进行组织或细胞移植。

可将新鲜或速冻的供体上皮组织移植到已清除的脂肪垫中。此外，也可移植永生化的记忆上皮细胞系、记忆肿瘤细胞系或原代细胞。有关细胞制备的详细信息，请参见随附的上皮组织片段移植书面实验方案。已制备。

本视频首先解冻一支上皮组织的冻存管，并将组织碎片转移至含有新鲜培养基的培养皿中。使用剪刀将受体小鼠去脂垫上皮组织剪出一个囊袋，以稀释DMSO。然后用镊子将一毫米大小的供体上皮组织放入该囊袋中。

如有必要，用组织镊夹住切口使其闭合，并撤出针镊，以保持组织位置不变。抓住皮肤对侧边缘，用镊子将其对合。

将它们从腹腔的腹侧体膜提起，并用伤口夹闭合。使用两个夹子闭合正中矢状切口，每个斜切口各用一个夹子。如有需要，避免阻塞尿道。

使用缝线闭合正中矢状切口与斜切口交汇处的皮肤缺损。将小鼠放回笼中，并将笼子置于加热灯下，直至小鼠苏醒。伤口夹应在两周后移除。

以下幻灯片展示了在清除摄食垫并移植上皮后，宿主记忆腺体中可能观察到的代表性图像。此图像显示的是从三周龄小鼠中分离出的内源性记忆上皮。在腺体清除操作中，应注意切割边缘的清晰边界。每次操作后均应制备类似此例的完整组织样本，以评估边界是否已完全清除。

此图像显示小鼠在清除处理七周后的透明化脂肪垫。请注意，整个脂肪垫中均无记忆细胞、上皮组织、血红素和黏蛋白。在清除处理七周后对透明化脂肪垫进行染色，也证明腺体中缺乏记忆上皮细胞。

展示了一例来自10周龄小鼠的供体记忆上皮移植到清除脂肪垫后的代表性整体标本。请注意，移植的上皮形成了正常的上皮导管树状结构、血色素和腺泡。对清除脂肪垫和记忆上皮的染色。

同龄时期的上皮移植显示了外源性上皮正常生成导管结构的能力。此处经透明化处理的脂肪垫经血蛋白和阿辛染色后，显示移植的上皮已发展为记忆性肿瘤。我们刚刚向您展示了如何获取乳腺上皮组织并进行乳腺上皮移植。

进行此操作时，重要的是要记住切断第四和第五腺体之间的连接，以烧灼淋巴结和乳头，并彻底清除内源性上皮组织的所有残留。必须确保内源性上皮组织不可能生长进入已清除的脂肪垫。此外，建议对切除的乳腺组织整体进行检查，以确认切缘是否干净。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。