Name: 检索小鼠卵母细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学习从Peromyscus雌性小鼠中分离卵母细胞和早期胚胎的详细方法。该方案通过解剖生殖道、向输卵管漏斗部注射FHM培养基，实现高效回收细胞，适用于基因表达和转基因研究。

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我要感谢来自鹿鼠遗传种质中心的 Mike Dewey，感谢他的帮助、耐心和专业知识。

胚胎/卵母细胞采集
<ol>
<li>在获取胚胎/卵母细胞前至少两小时，将 KSOM 置于 37ºC 的 CO2 培养箱中，同时将 FHM 从 -20°C 解冻。使用一个带有三个凹形浅孔的玻璃培养皿，在培养箱中盛放 KSOM 液滴。为防止脱水，将 KSOM 和培养皿置于带盖容器中，容器底部盛有水。该装置可在不使用矿物油的情况下防止蒸发。 </li>
<li>将排卵雌性个体的输卵管置于 FHM 培养基中。为确保正确的方向性并保持漏斗部完整，需连同输卵管及一小段子宫一并切取部分卵巢组织。使用钝头的 30 号针头，将其插入漏斗部，以将胚胎/卵母细胞从输卵管中推出。必须通过漏斗部获取胚胎，因为输卵管管径过细，针头无法通过。若漏斗部受损，则必须将输卵管切开或用手挤压排出胚胎。 </li>
<li>通过将显微镜聚焦于已沉降至培养皿底部的脂滴，可在 FHM 培养基中找到胚胎/卵母细胞。胚胎/卵母细胞的分离可在 20 倍镜下进行，因其视野范围较高倍镜更大。胚胎/卵母细胞外观呈圆形脂滴状，周围有一圈清晰的光环。使用经拉制的玻璃毛细管并通过口吸移液的方式，将胚胎/卵母细胞转移至 KSOM 中进行培养和后续操作。</li>
</ol>
卵母细胞采集操作步骤
准备
<ol>
<li>解冻 FHM 并准备 kSOM。</li>
<li>提前几小时将 kSOM 放入取卵容器中，并置于底部盛有水的吸头盒内，放入 CO2 培养箱中。</li>
<li>将笼子带到实验室，处死用于取卵的雌鼠。</li>
<li>切除输卵管时需小心，应保留部分卵巢和部分子宫组织，以确保不切断输卵管的一部分。</li>
<li>将组织置于盛有 FHM 培养基的小培养皿中。</li>
<li>再倒入几份 FHM 培养基至其他培养皿中，用于后续冲洗操作。</li>
</ol>
&nbsp;
冲洗
<ol>
<li>使用连接至带螺旋末端的1 ml注射器的冲洗针（30号钝头）。</li>
<li>一次取一条输卵管，使用针头插入残留卵巢附近部位的漏斗部。若漏斗部已受损无法使用，则用两把镊子夹住输卵管的一端，再用另一把镊子轻轻挤压，如同挤牙膏一般，将其中的胚胎挤出。 注意：这会在培养皿中产生大量碎屑，因为会带出许多组织，因此之后你可能需要使用另一个培养皿。 </li>
<li>观察胚胎时，将显微镜对焦于脂肪组织碎片，寻找周围具有清晰环状结构的圆形“脂肪碎片”。 注意：胚胎的外观与脂肪相同，因此&nbsp;可能难以发现。胚胎会沉到底部，因此应仔细检查底部。 </li>
<li>对受体雌性小鼠进行阴道涂片检查。在此阶段，它们应处于假孕状态。</li>
</ol>

本文演示了从小型鹿鼠（Peromyscus）中获取经促排卵处理（超数排卵）后的卵母细胞。由于超数排卵可获得数量更多的卵母细胞，因此相较于自然动情周期更为常用。然而，在利用此类卵母细胞或胚胎进行研究时，必须谨慎解释实验结果，因为诱导排卵所使用的激素以及体外培养过程均可能对结果产生影响。

确认动情期后，将雌性动物实施安乐死，并回收输卵管以及少量卵巢组织。保留的小部分卵巢可作为识别漏斗部位置的标记。漏斗部紧邻卵巢，通常穿过一层薄薄的组织突出。在该组织的另一侧，输卵管其余部分呈盘绕状，并最终通向阴道。最佳的卵母细胞采集方法是将液体从漏斗部推入，以冲出卵母细胞。此方向是必要的，因为在阴道与输卵管交界处存在一个单向瓣膜。若将卵母细胞反向通过该瓣膜，可能会对其造成损伤。

将一根30号钝端针插入漏斗部。钝端针可与漏斗部开口匹配，但无法插入输卵管管腔。因此，在解剖或取卵过程中必须小心操作，避免损伤漏斗部。若漏斗部受损，可通过镊子挤压输卵管管壁，使滞留的卵母细胞排出。 

假...

<table><tbody><tr><td>冲洗针</td><td>工具</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G 钝头</td></tr><tr><td>镊子（2个）</td><td>工具</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>动物</td><td>Peromyscus遗传种质中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>工具</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>FHM HEPES缓冲培养基</td><td>试剂</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>KSOM胚胎培养液（5×10 mL）</td><td>试剂</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>口吸移液管</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>由玻璃毛细管拉制并连接橡胶管</td></tr><tr><td>卵母细胞培养皿</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>带凹陷小孔的玻璃容器</td></tr></tbody></table>

小鼠卵母细胞的获取

Retrieval of Mouse Oocytes

迄今为止，仅有少数研究报道了成功操控鹿鼠属胚胎发育或生殖生物学的方法。我们正与鹿鼠遗传种质中心（http://stkctr.biol.sc.edu）合作，系统表征建立该研究体系所需的关键技术差异。其中一项主要目标是优化卵母细胞和早期胚胎的获取方法。

本方案阐述了从小鼠输卵管中提取卵母细胞或早期受精胚胎的技术。正确识别漏斗部并将钝端针头插入其中，是成功执行该操作的关键。

迄今为止，仅有少数研究报道了成功操控鹿鼠属胚胎发生或生殖生物学的方法。结合鹿鼠属……

我叫Amanda dli。我来自加利福尼亚大学欧文分校Paul Verana博士的实验室。今天我将向您展示卵母细胞采集的操作流程。这需要将输精管从雌性体内分离出来。一旦分离出输精管，我们将通过输精管注入FHM培养基，随后细胞应从子宫中排出。操作完成后，我们将在培养基中分离这些细胞，并将其用于后续实验。除了分离卵母细胞外，您可能还想通过该程序在特定时间点分离胚胎。您可能希望以视频形式观看该操作的一个原因是，输卵管的不同部分可能非常难以辨认。在本视频中，我将指出漏斗部，即您将注入FHM培养基的位置。您将使用的解剖工具包括两把尖头镊子和一把尖头剪刀。从雌性个体取出的卵巢管将置于FHM培养基中，该培养基位于一个35毫米的组织培养皿内。卵子将通过连接在1毫升注射器上的30毫米钝头针管吸取，同时使用一把尖头镊子固定uc。FHM 是一种用于收集细胞的保存液。如果细胞受精，将使用 KSOM 培养基，使其在培养箱中生长。一旦从输卵管中取出卵子和胚胎，我们将使用由毛细管拉制而成的玻璃转移移液管，连接一段软管，通过口吸方式将卵子或胚胎移入保存液中。使用玻璃凹形培养皿来盛放胚胎和卵子。可将它们分别置于每个凹形圆圈内，使其位于独立且易于识别的位置，便于寻找。将此培养皿放入容器中，即可在不使用油的情况下置于CO2培养箱内。根据所使用的培养基，在FHM培养基或KSOM培养基上方，将水加入底部，关闭阀门后液体即停留在原位。使用70%乙醇以防止毛发进入操作区域。我们将在腹部区域做一个小切口，并切开腹腔。我们将扩大切口以暴露腹腔区域。一旦完成切口以暴露子宫，顺便将肠管移开，此时子宫即位于下方。子宫呈Y形，它们剧烈旋转并牵动部分子宫组织。当切断时，输卵管看起来像意大利面。我将尝试取一部分输卵管。我会取输卵管以及部分被脂肪包裹的卵巢。另一侧将被处理。此时，再次夹取卵巢或子宫。在这里夹取子宫，在固定点下方进行剪切。此时可找到输卵管。我将取一部分OV卵巢带回去。然后将其放入培养基中。子宫仍在收缩。子宫由平滑肌构成，因此即使它已脱离机体，神经元仍会持续放电。此处显示的是子宫。虽然卵巢管看起来像意大利面，且卵巢位于其上方，但实际上卵巢管并未与卵巢相连。尽管此时我们仅展示了卵巢的一部分，但我的优势手是右手，我用右手持握30号钝端针头。我将该针头用作镊子以分离输卵管。一旦完成分离，我便将钝端针头插入输卵管并注入少量液体，液体将从子宫中流出。我的左手持握锐利的镊子。该镊子用于分离腓骨并固定所有组织。腓骨呈喇叭状，在此处被分离出来。我的针尖位于腓骨内，正穿过组织层。好的。为了确保已分离出所有的胚胎和卵子，我喜欢像挤牙膏一样挤压子宫。当你聚焦于脂肪垫时，应寻找那些看起来完全对称的脂肪滴状物。就在那条长的脂肪下方偏左的位置有一个，那是一个单独的卵。接下来，我将用移液管吸取这个卵，将其放入更多的保存液中，以便我们能够分离出卵本身。今天我向您展示了如何从雌性生殖道中分离细胞。此外，我还向您介绍了输卵管的不同结构，特别是漏斗部，这是唯一可以注入FHM培养基的结构。使用30号针头进行操作。通过该技术，我已分离出细胞以及雌性生殖道中存在过的任何胚胎。我可将这些样本用于基因表达研究或转基因实验。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

检索小鼠卵母细胞

卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。...

小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

本视频介绍了从新获取的小鼠卵巢中分离窦状卵泡卵母细胞的方法。这些窦状卵泡卵母细胞可用于进一步的表征和发育研究。...

小鼠窦卵泡卵母细胞分离：从新鲜获取的小鼠卵巢中分离窦卵泡卵母细胞的方法

本文介绍了一种通过特异性siRNA介导的mRNA耗竭，随后进行免疫荧光分析，以评估小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体组装与结构的实验方案。该方案适用于 体外...

通过siRNA介导的沉默技术评估小鼠卵母细胞中的减数分裂纺锤体

本文介绍了一种基于核仁组织对小鼠窦状卵泡卵母细胞进行表征的实验方案。...

基于核仁染色质结构的小鼠窦卵泡卵母细胞的分离与鉴定

已知哺乳动物的卵子发生过程容易出错，尤其是由于染色体错误分离所致。本文描述了小鼠减数分裂前期、中期I和中期II阶段卵母细胞的染色质铺展制备方法。这些基础技术可用于研究哺乳动物卵子发生过程中染色质结合蛋白及染色体形态的变化。...

从前期到第二次减数分裂中期的小鼠卵母细胞发育分析用染色质铺展制备方法

本文介绍了一种优化的实验方案，利用近红外飞秒激光在小鼠卵母细胞第一次减数分裂中期实现细胞质微管组织中心的去除。...

小鼠卵母细胞胞质微管组织中心的多光子激光消融

染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。...

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

本方案提供了一个实验框架，用于记录细胞骨架对小鼠卵母细胞系统中细胞核形态以及内部无膜细胞器的物理影响。该框架可适用于其他细胞类型和研究背景。...

跨空间尺度捕捉小鼠卵母细胞核由细胞骨架介导的扰动

本方案描述了以下操作步骤 体外 小鼠卵母细胞的成熟， 体外...

小鼠卵母细胞体外成熟、受精及植入前胚胎培养

本视频及实验方案旨在帮助学习核移植技术。...

细胞核移植至小鼠卵母细胞

学习从Peromyscus雌性小鼠中分离卵母细胞和早期胚胎的详细方法。该方案通过解剖生殖道、向输卵管漏斗部注射FHM培养基，实现高效回收细胞，适用于基因表达和转基因研究。

小鼠卵母细胞的获取

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