Name: 鼠标采用的空气相Electroolfactogram录制的嗅觉感官神经元响应分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-02T17:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学习使用空气相电嗅图技术记录小鼠嗅觉上皮神经元的电生理反应。该方法通过计算机控制的嗅探刺激和信号放大系统，实现对嗅觉感官神经元响应的实时监测与分析。

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感谢约翰斯·霍普金斯大学生物学系Hattar Kuruvilla Zhao三联实验室的宋一君博士及各位成员提供的建议与帮助。本研究由美国国立卫生研究院基金项目DC007395和DC009946资助。

第1部分：EOG记录装置设置
记录装置由记录电极、参考电极、送气管、标本台和解剖显微镜组成，所有部件均固定在法拉第笼内的防震台面上。使用显微操作器来定位电极和送气管。持续的气流在通过送气管输送至标本之前，先经过蒸馏水鼓泡以增加湿度。使用一个直径为60 mm、内含6–8 mm深Sylgard填充物的培养皿作为标本的固定平台。在该固定培养皿的Sylgard中挖出一个井状结构和一条通道，用于通过改良Ringer溶液将参考电极与标本实现电连接。
记录电极和参考电极连接至放大器。来自放大器的信号被传送至数字化仪，然后传送到计算机。可使用诸如Axograph或pClamp等软件来控制刺激方案、记录信号以及对反应进行后续分析。在放大器之后连接示波器，可在放置记录电极及进行EOG记录时，便于实时监测电位变化。
气味刺激的递送由Picospritzer控制，该设备与用于信号采集的同一台计算机相连。Picospritzer的气压设定为10 psi。一个空气罐和调压阀可同时为气浮台和Picospritzer供气。另需第二个空气罐和调压阀为加湿气流提供空气，因为后者需要较低的压力和较大的气流量。在递送气味刺激前，先将Picospritzer的输出端连接至气味瓶，再将气味瓶连接至气体递送管。
第二部分：制备电极
记录电极为一根镀氯化银的银丝，置于拉制的玻璃毛细管内，毛细管中充满改良的林格氏液（135 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1.5 mM MgCl2、10 mM HEPES，pH 7.4，过滤除菌）。参比电极为一根镀氯化银的银丝。
<ol>
 <li>将银丝安装到电极 holder 中。用于记录电极时，银丝应从电极 holder 末端伸出 1 至 2 厘米。参考电极可保留更长的银丝。</li>
 <li>为在银丝上形成 AgCl 涂层，将银丝置于 0.1 M NaCl 溶液中，并将电极 holder 连接到 1.5–9 V 直流电源的正极。电源的负极应与 0.1 M NaCl 溶液电连接。氯化反应持续进行 10 分钟。在将电极安装到记录装置之前，短暂接触记录电极与参考电极，以平衡两者之间的静电荷。</li>
 <li>使用微电极拉制仪拉制玻璃毛细管。毛细管尖端的开口直径应约为 5–10 微米。</li>
 <li>使用金刚石笔在毛细管钝端刻划并折断，使其长度比银丝长约 2 厘米。用丁烷火炬对截断端进行火焰抛光。</li>
 <li>在改良林格液中熔化 0.5% 琼脂糖。使用移液管吸取少量熔融的琼脂糖溶液，注入电极尖端。</li>
 <li>用改良林格液填充拉制好的毛细管至约一半长度（可使用加热并拉制成细长末端的注射器完成此操作）。轻轻弹击毛细管以去除任何气泡。将填充好的电极储存于储存瓶中，瓶底保留少量改良林格液，直至使用前。待组织样本准备就绪并可进行记录时，将填充好的毛细管套在记录电极的银丝上。</li>
</ol>
第3部分：制备气味溶液
戊酸乙酯和庚醛能够引发较强的反应，因此是作为EOG刺激物的良好选择。
<ol>
 <li>在微量离心管中，用二甲基亚砜（DMSO）配制气味物质的一系列稀释液。作为剂量-反应曲线的起始点，配制从 5 M 到 5 × 10-6 M 的 10 倍梯度稀释液。每天新鲜配制稀释液。</li>
 <li>将 DMSO 中的稀释储备液取 100 μL 加入含硅胶塞的 2 盎司瓶中，再加入 4.9 mL 水，进一步稀释 50 倍。让溶液在瓶中平衡至少 30 分钟。注意：每个瓶中气味物质的气相浓度未知，但会随液相中气味物质浓度的变化而变化。</li>
 <li>将两根 18 号针头插入硅胶塞中，作为进气口和出气口。当瓶子不使用时，应将端口堵塞。</li>
</ol>
第4部分：记录EOG并分析数据
<ol>
 <li>通过 CO2 安乐死或麻醉过量后断头处死一只小鼠。去除覆盖颅骨的皮肤，并沿中线将头部纵向剖开成两半。</li>
 <li>将其中一半头部内侧朝上固定在固定皿上。小心移除鼻中隔以暴露鼻甲。</li>
 <li>将带有固定组织的皿置于记录台上。调整台的位置，使鼻甲上的记录位置位于显微镜正下方中心。</li>
 <li>打开气罐，向鼻甲表面输送加湿空气。将送气管放置在距离记录位置约 10 mm 处。流速约为 600 mL/min。</li>
 <li>将放大器设置为直流模式（交流放大会在 EOG 信号中引入伪迹），低通滤波器设为 1 kHz，增益设为 100 倍。</li>
 <li>将记录电极和参考电极安装在显微操作器上。</li>
 <li>将参考电极插入固定皿的槽中，并用改良的林格液覆盖，使其与组织形成电连接。</li>
 <li>小心将记录电极缓慢下降至鼻甲 IIb 或 III 的表面。电极应仅轻微接触嗅觉上皮表面！当电极接触上皮（即形成闭合电路）时，示波器上将出现一条平直的基线。</li>
 <li>将气味剂瓶连接至送气管的侧端口。</li>
 <li>在计算机上启动刺激程序。数据采集的采样率应为 2 kHz 或更高。软件将触发一次气味脉冲并开始记录。</li>
 <li>典型的刺激程序可包括持续 100 毫秒的单次脉冲、间隔 1 秒的成对 100 毫秒脉冲，或持续 10 秒的持续脉冲。</li>
 <li>各刺激程序之间应留出一定时间，以尽量减少组织的适应性反应。对于浓度不超过 10-3 M 的乙酸戊酯和庚醛液体，间隔 1 分钟即可；浓度更高时，应间隔 5 分钟。在施加高浓度气味剂后（如完成剂量-反应曲线末尾），残留气味可能仍存在于管道中。在继续使用其他组织样本前，应用 95% 乙醇清洗送气管并晾干。</li>
 <li>Axograph 软件提供用于测量 EOG 信号关键参数的工具。这些参数包括反应幅度、潜伏期、达峰时间以及终止过程的时间常数。在进一步分析前，可对记录曲线进行 25 Hz 的数字滤波处理。</li>
</ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="电生理实验装置示意图，用于记录气味反应的EOG信号；包含示波器和图形。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 1"> 图1. EOG分析参数。EOG的多个参数特别适用于小鼠间反应的比较，包括反应幅度、潜伏期（刺激施加到反应开始之间的时间）、上升时间（反应起始至达到峰值的时间）、达峰时间（从刺激开始到反应达到峰值的时间）以及终止时间常数（τ，通过将反应衰减相拟合为单指数方程确定）。在比较潜伏期、上升时间和终止时间常数等动力学参数时，建议在分析前先对反应的峰值幅度进行归一化处理。
<img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="电嗅觉图反应；浓度-反应曲线；EOG 图像；乙酸戊酯分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 2"> 图2. 不同刺激方案下的典型电嗅觉图（EOG）信号。 （a）小鼠在不同浓度乙酸戊酯刺激下产生的EOG信号示例。图中顶部的黑线表示气味刺激的时间和持续时长。图例中的浓度为液体溶液的浓度。（b）来自五只小鼠的剂量-反应关系平均结果。误差线表示95%置信区间。在极高气味浓度下，通常可观察到峰值振幅下降。（c）对双脉冲刺激产生反应的EOG信号示例。一次短暂的气味脉冲可引发持续数秒的适应现象。（d）对持续10秒气味刺激产生反应的EOG信号示例。在持续气味呈现期间，EOG表现出脱敏现象。

<ol><li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).</li>
<li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroolfactogram%3A+a+review+of+its+history+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
<li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+in+G%28olf%29+are+anosmic%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li>
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</ol>

小鼠的饲养和处死方法均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。

采用本方案所述的实验装置，嗅觉上皮表面的气味刺激在不同组织样本之间将保持一致，从而允许在野生型与突变型小鼠之间进行比较，即使确切的气味剂浓度和动态变化尚不明确。多种因素，尤其是记录位置和加湿空气的流速，会导致EOG信号的变异。为尽量减少变异，应从同一鼻甲的相似位置进行记录。这可以通过始终从头部同一侧记录，并在不同组织样本之间保持显微镜、气味递送管和微操作器在气浮台上的位置不变来轻松实现。此外，组织样本在解剖后应立即置于加湿的气流中，以防止组织过度干燥。
在小鼠上进行EOG记录时，也可使用液体灌注装置作用于制备好的小鼠鼻甲7, 14, 15，或保持头部完整，将电极插入鼻甲上方钻出的小孔中16, 17。每种EOG记录方法均有其优势：如本方案所述，对组织标本进行气相记录所需准备最少，操作最为简便；使用液体灌注装置的记录方式便于应用药理学试剂，但许多气味分子的疏水性质会增加气味递送的难度；最后，保持头部完整的记录方式可用于“人工嗅吸”实验，但相较于完全暴露鼻甲的情况，电极放置更为困难。

<table><tbody><tr><td>空气输送管</td><td>设备</td><td>定制</td><td></td><td>可使用带T型接头的1 mL注射器筒体作为替代品</td></tr><tr><td>气浮台</td><td>设备</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>设备</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>计算机与数据采集软件</td><td>设备</td><td>Apple Macintosh 上的 Axograph 4.9.2</td><td></td><td>适用于 Mac OS X 和 Windows 的 Axograph 更新版本可从 http://axographx.com/ 获取。</td></tr><tr><td>丁烷喷灯</td><td>设备</td><td></td><td></td><td>使用 cr&amp;#232;me br&amp;#251;l&amp;#232;e 喷灯效果良好</td></tr><tr><td>数字转换器</td><td>设备</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>设备</td><td>Scienscope</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>设备</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>磁性固定装置（12 mm）</td><td>设备</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>设备</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>微量移液管拉制仪</td><td>设备</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>设备</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>设备</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>设备</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>样品台</td><td>设备</td><td>定制</td><td></td><td>可使用任何小型固体物体来抬高固定皿。用油泥固定培养皿。</td></tr><tr><td>18号针头</td><td>材料</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>2盎司玻璃瓶</td><td>材料</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>材料</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>16D号硅胶塞</td><td>材料</td><td>Chemware</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>材料</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>材料</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>可从 World Precision Instruments 购得</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>乙酸戊酯</td><td>试剂</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>庚醛</td><td>试剂</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>试剂</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>流量计</td><td>设备</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

利用气相电嗅觉图记录分析小鼠嗅觉感觉神经元的反应

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

动物依赖嗅觉完成许多关键行为，例如寻找食物来源、躲避捕食者以及识别同种个体以进行交配和其他社会互动。电嗅图（EOG）记录是一种在嗅觉上皮水平评估嗅觉功能的信息丰富、操作简便且可靠的方法。自1956年Ottoson在青蛙中首次描述EOG以来1，EOG记录已被广泛应用于多种脊椎动物，包括蝾螈、兔子、大鼠、小鼠和人类（参见Scott和Scott-Johnson于2002年的综述，参考文献2）。近年来小鼠基因修饰技术的进步，重新激发了人们对记录EOG以进行基因敲除和基因敲入小鼠嗅觉功能生理表征的兴趣。EOG记录已成功用于证明嗅觉信号转导组分的核心作用3-8，并最近用于表征某些调控机制对嗅觉感觉神经元（OSN）反应的贡献9-12。
气味分子的检测发生在嗅觉上皮表面嗅觉感觉神经元（OSNs）的纤毛上，在此处信号转导级联反应导致离子通道开放，产生流入纤毛的电流，从而使膜发生去极化13。嗅觉上皮电图（EOG）是指在气味分子刺激下，于嗅觉上皮表面细胞外记录到的负电位，其来源于记录区域内各个有反应的OSNs所引起电位变化的总和2。因此，通过比较EOG的振幅和动力学特征，可获得有关基因修饰及其他实验干预如何影响OSNs对气味分子反应背后分子信号通路的重要信息。
本文介绍了一种在小鼠嗅甲组织标本上进行的气相EOG记录方法。简言之，在处死小鼠后，沿正中矢状面将头部切开并移除鼻中隔，以暴露嗅甲。随后将嗅甲组织标本置于记录装置中，并将记录电极放置于内侧嗅甲之一的嗅上皮表面。参考电极通过缓冲液与组织形成电学连接。持续向嗅上皮表面吹入湿润的气流以保持组织湿润。将气味剂溶液的蒸气脉冲注入湿润气流中以刺激嗅上皮。记录产生的反应信号并进行数字化，以供后续分析。

电嗅图（EOG）记录是一种在嗅觉上皮水平评估嗅觉功能的可靠、易于实施且信息丰富的检测方法。本方案描述了记录装置的搭建、小鼠组织样本的制备、数据采集以及基本的数据分析方法。

动物依赖嗅觉完成许多关键行为，例如寻找食物来源、躲避捕食者以及识别同种个体以进行交配和……

将嗅上皮组织样本置于培养皿中，并放入湿润的气流环境中。在解剖显微镜下，通过缓冲液将参考电极与组织进行电学连接，记录电极则放置在嗅上皮表面。通过将计算机控制的气味剂气流送入加湿空气中，该气流将气味剂输送至嗅觉上皮，从而刺激嗅觉上皮。EOG信号经放大器和数字化仪传输至记录用计算机。大家好，我是来自约翰斯·霍普金斯大学生物学系XO卫生实验室的Catherine Ciar。今天我们将向您展示一种从小鼠记录电嗅觉图（electro olfactogram）的方法。我们在实验室中使用该方法来研究嗅觉感觉神经元对气味的反应。现在就开始吧。记录装置由记录电极、参考电极、空气输送管、样品台和解剖显微镜组成，所有部件均固定在法拉第笼内的气浮台上。使用显微操作器将电极置于空气输送管中。持续的气流在通过空气输送管并流经样品之前，先经过蒸馏水鼓泡以增加湿度。使用一个直径为60毫米的培养皿作为标本的固定平台，其中装有6至8毫米高的石蜡以适应标本。在固定用培养皿的石蜡中挖出一个井和一个通道。通过改良的林格氏液，为参比电极与标本之间的电连接提供通路。将记录电极和参考电极连接至放大器。来自放大器的信号被传送至数字化仪，然后传送到计算机。使用XI Graph软件来控制刺激方案、记录信号并分析反应。在放置记录电极时，放大器后连接示波器以实时监测电位。在进行眼电图（EOG）记录期间，气味刺激的递送由皮升喷雾器控制，该喷雾器在递送气味刺激前连接至用于信号采集的同一台计算机。将皮升级喷雾器的输出端连接至装有液态气味物质的气味瓶，再将气味瓶连接至送气管。接下来，我们来看如何为记录实验准备电极。记录电极是填充有改良林格溶液的拉制玻璃毛细管中的氯化银丝。参考电极为氯化银丝。通过将银丝安装到电极夹持器中，开始制备两种电极。对于记录电极，应使一到两厘米长的导线从电极 holder 末端伸出。参考电极可留出更长的导线。为添加氯化银涂层，将导线置于 0.1 摩尔的氯化钠溶液中，并将电极 holder 连接到 1.5 至 9 伏直流电源的正极。电源的负极应与0.1摩尔的氯化钠溶液进行电连接。让反应中的氯化物作用10分钟，以平衡记录电极与参比电极之间的任何静电荷。在将电极安装到记录装置上之前，短暂地将电极相互接触一下。接下来，使用显微移液器拉制仪拉制一根玻璃毛细管。毛细管尖端的开口直径应约为5至10微米。使用金刚石笔在毛细管钝端划痕并折断，使其长度比银丝长约2厘米。使用丁烷喷灯对切割端进行火焰抛光，然后在改良的林格溶液中熔化0.5%琼脂糖。使用已加热并拉制成细长末端的注射器，通过移液管将少量熔融的琼脂糖溶液吸入电极尖端。将拉制好的毛细管填充至约一半长度。使用改良林格溶液，轻轻弹击毛细管以排除任何气泡。将装填好的电极存放在储存瓶中，瓶底保留少量改良林格溶液，直至准备使用。一旦组织样本制备完成并准备记录，将装填好的毛细管安装至记录电极导线上，使电极处于就绪状态。让我们先进行一项记录实验，以开始准备用于记录的组织。去除已处死小鼠颅骨表面的皮肤，并沿中线将头部纵向切开，取其中一半头部，内侧朝上固定于固定皿中。小心移除鼻中隔，以暴露鼻甲结构。将载有组织的培养皿放置在记录台上。调整台的位置，使鼻甲上的记录位置位于显微镜下中心。现在打开气罐，以约600毫升/分钟的流速向鼻甲表面输送加湿空气。将气流输送管放置在距离记录位置约10毫米处。将放大器设置为直流（DC）模式，因为交流（AC）放大会在EOG信号中引入伪迹。使用1 kHz的低通滤波器和100倍的增益进行信号采集。现在将记录电极和参考电极安装到显微操作器上。将参考电极缓慢放入记录皿的孔中，并用改良的任氏液覆盖，使其与组织形成电学连接。小心地将记录电极缓慢下降至下鼻甲二B区或三区的表面。电极应轻轻接触嗅上皮表面。当电极与上皮接触时，示波器上将出现一条平直的基线。此时，将装有气味物质的瓶子连接到计算机端空气输送管的侧端口上。启动刺激程序。数据采集的采样率应为每秒两千赫兹或更高。软件将触发气味脉冲并开始记录。典型的刺激方案可能包括持续100毫秒的单次脉冲配对，两个100毫秒的脉冲之间间隔1秒，或持续10秒的连续脉冲。为尽量减少适应现象，在施加高浓度气味后，两次刺激方案之间应间隔1至5分钟。残留气味可能仍存在于管路中，因此在继续处理其他组织样本前，需用95%乙醇清洗空气管路并晾干。Axo graft 软件提供了用于测量 EOG 信号关键参数的工具。这些参数包括反应幅度、潜伏期、达峰时间以及终止的时间常数。EOG 的多个参数特别适用于小鼠间归一化反应的比较，包括反应幅度、上升潜伏期、达峰时间以及终止的时间常数。图中显示了小鼠在受到浓度递增的液体乙酸戊酯刺激时嗅球（OG）的反应。顶部的黑线表示气味刺激的时间和持续时间。此处我们看到的是来自五只小鼠的剂量反应关系，误差线为95%置信区间。在气味浓度非常高时，通常会观察到峰值幅度的下降。图中显示的是对成对脉冲刺激的电嗅图（EOG）反应，单次短暂的气味刺激可引起持续数秒的适应现象。此处展示的是对持续10秒气味刺激所产生的电嗅图（EOG）反应。EOG 显示在持续呈递气味分子时会出现脱敏现象。我们刚刚向您展示了如何从小鼠记录电极因子图。进行此操作时，重要的是要记住将电极放置在上皮表面，而不要将电极插入表面以下。始终从头部的同一侧进行记录，并避免对实验装置进行任何改动，以尽量减少变异；保持组织湿润，但不要有液滴积聚。解剖后立即将组织置于湿润的空气中，可使组织保持最佳记录状态。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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