Name: 分离和富集大鼠间质干细胞（MSCS）及衍生的干细胞分离单细胞集落 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习从大鼠股骨和胫骨中分离和富集间充质干细胞（MSCs）的方法，使用磁激活细胞分选和流式细胞术进行表面标志物分析，并通过克隆环获得单细胞集落衍生的干细胞。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（R01GM079688、R21RR024439 和 R21GM075838）、美国国家科学基金会（CBET 0941055）以及密歇根州立大学基金会的资助。

1. 大鼠MSCs的分离
间充质干细胞取自6至8周龄的Sprague-Dawley雌性大鼠，分离方法如前所述1, 2。分离得到的MSCs可贴附于塑料表面，并在体外培养中易于扩增。
<ol>
<li> 将动物放入麻醉室中，麻醉约五分钟。在麻醉过程中，观察其眨眼频率、呼吸频率和运动活动。一旦动物停止运动活动且眨眼频率变得稀少，立即将其从麻醉室中取出。</li>
<li> 将动物仰卧于手术台上，通过颈椎脱位法处死。剪下后肢的股骨和胫骨，去除皮肤和肌肉。</li>
<li> 将分离出的股骨和胫骨浸入70%异丙醇中数秒，随后转移至1× D-PBS中。</li>
<li> 在生物安全柜中，将股骨和胫骨转移至含有DMEM的10 cm培养皿中。用镊子夹住每根骨骼，用剪刀剪开两端。在3 ml注射器上安装22G针头，并吸入DMEM，将针头插入骨骼的一端开口，冲洗骨髓至50 ml离心管中。每根骨骼重复冲洗2~3次。待所有骨髓收集完毕后，重悬细胞，并将细胞悬液通过70 μm细胞筛网，以去除骨碎片和血细胞聚集体。</li>
<li> 在200 ×g、4°C条件下离心5分钟，吸弃上清液。将细胞重悬于25 ml MSC培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM）中。将10 ml细胞悬液接种至每个10 cm培养皿中，共接种两个培养皿。将培养皿置于37°C、5% CO2的培养箱中培养1~2周，每2~3天更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 大鼠MSCs的富集
已有多种表面蛋白被用于富集间充质干细胞（MSCs），包括CD54、CD90、CD73、CD105和CD2713-5。在本研究中，我们采用CD54和CD90作为标志物，通过磁性细胞分选技术富集间充质干细胞。
<ol>
<li> 当细胞生长至约80%融合度时，吸除培养基，每皿加入4~5 ml胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养皿放回培养箱，孵育约5分钟，使细胞脱落。细胞脱落后，加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液收集至15 ml离心管中，在200g、4°C条件下离心5分钟，沉淀细胞。</li>
<li> 以下步骤描述如何根据BD IMagnet细胞分离试剂盒说明书，利用两种表面标志物CD54和CD90富集间充质干细胞（MSCs）。将细胞沉淀重悬于细胞染色缓冲液（含3%热灭活FBS的1×D-PBS）中，浓度为2000万个细胞/ml。加入生物素标记的抗CD54抗体（每百万细胞0.25 μg）和生物素标记的抗CD90抗体（每百万细胞0.15 μg），轻轻混匀。冰上孵育15分钟后，用过量的1× BD IMag缓冲液洗涤标记后的细胞。在200g、4°C条件下离心5分钟，沉淀细胞。</li>
<li> 充分涡旋混匀BD IMag链霉亲和素磁珠，每1000万个细胞加入40 μl磁珠。将磁珠与标记后的细胞充分混合，并在6~12°C条件下孵育30分钟。此步骤使链霉亲和素磁珠结合至已与细胞表面蛋白CD54和CD90分别结合的生物素化抗CD54和抗CD90抗体上。</li>
<li> 在孵育期间，标记一个圆底试管用于收集阳性组分。孵育结束后，用1× BD IMag缓冲液将体积调整至细胞浓度为2000万个细胞/ml，并将标记后的细胞转移至用于收集阳性组分的试管中。将该试管置于BD IMagnet磁力架上，静置6分钟，然后在试管仍置于磁力架上的情况下，用玻璃巴斯德吸管小心移除上清液。</li>
<li> 从BD IMagnet磁力架上取下阳性组分试管，置于冰上。加入1 ml预冷的1× BD IMag缓冲液，轻轻混匀重悬细胞。将试管重新放回BD IMagnet磁力架上，静置2~4分钟。用新的玻璃巴斯德吸管移除上清液。重复上述洗涤步骤一次。</li>
<li> 从BD IMagnet磁力架上取下试管，将细胞重悬于完全培养基中，接种至一个75 cm2培养瓶用于细胞维持培养，另接种一个10 cm培养皿用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术验证表面标志物表达
通过流式细胞术分析验证所获得的细胞表达CD54和CD90。利用造血干细胞（HSC）标志物CD45确认间充质干细胞（MSCs）中已去除HSCs。
<ol>
<li> 当细胞融合度达到约80%时，使用胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并将细胞收集至15 ml离心管中。在4°C下以200g离心5分钟，收集细胞。</li>
<li> 吸除上清液，用1× D-PBS洗涤细胞一次。将细胞重悬于细胞染色缓冲液（含2% FBS和0.05%叠氮化钠的1× D-PBS）中，调整细胞浓度至500万~1000万个细胞/ml，并将细胞置于冰上保存。取100 μl细胞悬液分装至六个已标记的离心管中（1. 仅细胞；2. 同型对照IgG2a；3. 同型对照IgG1；4. CD45；5. CD54；6. CD90）。</li>
<li> 加入适当浓度的同型对照抗体和一抗（IgG2a和IgG1：每百万个细胞20 μl；CD45：每百万个细胞0.5 μg；CD54：每百万个细胞0.25 μg；CD90：每百万个细胞0.15 μg），在4°C孵育30分钟。</li>
<li> 用1× D-PBS洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于100 μl细胞染色缓冲液中。加入SA-PE（链霉亲和素-藻红蛋白，每百万个细胞使用0.15 μg），避光并在4°C孵育30分钟。</li>
<li> 用1× D-PBS将标记后的细胞洗涤两次。将细胞重悬于400 μl细胞染色缓冲液中，转移至流式管中，用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
4. 单克隆来源的间充质干细胞的分离
间充质干细胞（MSCs）是一类异质性细胞群体，由具有不同细胞形态、增殖速率以及分化能力的亚群组成6。然而，所有这些亚群均表达已知的MSC标志物，因此无法利用标志物来分离这些亚群。为此，我们采用克隆环法分离由单个细胞形成的克隆集落，从而获得不同的亚群。
<ol>
<li> 将细胞以每10 cm培养皿约50~100个细胞的密度接种，在37°C、5% CO2的培养箱中培养1~2周。在此期间，使用倒置显微镜观察分离良好的单个克隆。当克隆生长至足够大小（建议每个克隆细胞数超过100个）时，用记号笔在培养皿底部标记克隆位置。选择标记克隆时，应确保所选克隆周围无其他邻近克隆。</li>
<li> 吸除培养基，用1× D-PBS洗涤培养皿一次。用无菌镊子夹取无菌克隆环，轻轻放置于已标记的克隆周围。重复此操作，直至所有待选克隆均被克隆环包围。所选克隆之间应保持足够距离，确保每个克隆环内仅包含一个克隆。</li>
<li> 向每个克隆环内加入100 μl胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养皿放回培养箱中孵育约5分钟。5分钟后，在显微镜下观察细胞是否变圆。当细胞开始脱落时，加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性。用200 μl移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，并将细胞悬液转移至含有3 ml预温培养基的60 mm培养皿中。正确标记培养皿后放回培养箱继续培养，并在接下来的几天内追踪细胞形态变化。</li>
</ol>
5. 代表性结果
根据大鼠MSCs分离部分所述的实验方案，接种后次日应可见贴壁生长的MSCs。随着细胞持续增殖，汇合的细胞应呈现如图1A所示的形态。当细胞达到约80%汇合度时（图1B），可进行传代培养。传代过程中，使用胰蛋白酶-EDTA消化使细胞脱落，脱落的细胞体积较小且呈圆形，如图1C所示。
<img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="显示不同细胞密度的细胞培养显微镜图像；标为 A、B、C；比例尺为 100µm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 大鼠间充质干细胞的相差显微图像。（A）融合的间充质干细胞，大多数细胞呈纺锤形或星形。（B）约 80% 融合度的间充质干细胞。（C）胰蛋白酶消化后脱落的细胞体积较小且呈圆形。
通过磁性细胞分选富集间充质干细胞（MSCs）后，采用流式细胞术分析以验证其表面标志物的表达情况。若富集效果良好，细胞应对MSC标志物CD54和CD90呈阳性染色，而对造血干细胞（HSC）标志物CD45呈阴性染色（图2）。同型对照IgG2a和IgG1用作阴性对照。
<img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="流式细胞术图谱，显示荧光强度、CD标志物分析结果，包括CD45、CD54、CD90。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 间充质干细胞表面标志物的流式细胞术分析。 间充质干细胞使用抗IgG2a（同型对照1）、IgG1（同型对照2）、CD45、CD54和CD90抗体进行标记。间充质干细胞表达CD54和CD90，但不表达CD45。
当细胞以适当的单克隆密度接种时，菌落应由单个细胞形成。图3A展示了一个由单个细胞形成的菌落。随后可使用克隆环分离这些菌落，并将来自不同菌落的细胞分别进行培养。图3B和图3C分别代表来自两个独立菌落的细胞。来自菌落1的细胞呈纺锤形（图3B），而来自菌落2的细胞呈圆形（图3C）。
<img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="细胞培养比较；显微镜图像；A、B、C 样本条件，50μm 比例尺；实验" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 间充质干细胞及其单克隆来源细胞的集落形成。 在克隆密度下培养的间充质干细胞（MSCs）可形成独立的细胞集落。这些集落可通过克隆环分离，并可将来自不同集落的细胞分别进行培养。（A）间充质干细胞在克隆密度接种后形成的代表性集落。（B）来自一个集落的纺锤形细胞。（C）来自另一个集落的圆形细胞。

<ol><li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li>
<li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li>
<li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells%3A+from+basic+biology+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li>
<li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li>
<li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li>
</ol>

本方案描述了如何分离和富集间充质干细胞（MSCs），并包含一种分离单克隆来源细胞的方法。成功的分离、富集及克隆分离涉及多个关键步骤。从大鼠中进行细胞分离时，建议通过细胞筛网或类似孔径的无菌尼龙膜过滤，以去除血凝块和骨碎片。细胞接种过夜后，培养基中会漂浮大量死亡细胞，此时更换新鲜培养基可去除死细胞，从而促进贴壁细胞的生长。
本方案中的磁性细胞分选技术描述了如何进行阳性筛选，类似的操作流程也可用于进行阴性筛选。抗体的添加量可能有所不同，需进行优化以获得更佳的分选效果。细胞标记用于流式细胞术分析时同样需要优化。若标记后的样本不能立即进行流式细胞术分析，可用2%甲醛固定后延迟检测。然而，不建议长期保存样本，因为这往往会导致自发荧光增强，从而降低样本质量。
菌落分离的关键在于以合适的细胞密度进行接种（需通过实验优化确定）以及挑选周围无其他克隆的单个克隆。如果附近存在其他克隆，克隆环可能会覆盖邻近的克隆，导致所获得的细胞不再来源于单一克隆。将克隆环放置于克隆上方时，注意不要在培养皿表面滑动，否则克隆环底部的硅脂会覆盖细胞，阻碍胰蛋白酶...

<table><tbody><tr><td>1X D-PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记小鼠IgG2a</td><td>BD Biosciences</td><td>555572</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记小鼠IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>555747</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗大鼠CD54抗体</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL054B</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗大鼠CD90抗体</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL005B</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗大鼠CD45抗体</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL001B</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>圆底管</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>BD Biosciences</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>R&amp;D Systems</td><td>F0040</td><td></td></tr><tr><td>克隆环</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2059</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠间充质干细胞（mscs）的分离与富集及单克隆来源mscs的分离

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

间充质干细胞（MSCs）是一类成体干细胞，具有广阔的治疗应用前景。这些细胞可从骨髓中分离获得，并因其具有贴壁生长特性，可轻松与造血干细胞（HSCs）分离。本实验方案描述了如何从大鼠股骨和胫骨中分离MSCs。分离后的细胞进一步通过磁性细胞分选法，利用两种MSC表面标志物CD54和CD90进行富集。随后通过流式细胞术分析验证CD54和CD90表面标志物的表达。同时检测造血干细胞标志物CD45，以确认分选后的MSCs中是否已去除HSCs。MSCs在自然状态下具有较高的异质性，其中存在多种亚群，这些亚群在形态、增殖能力及分化潜能方面各不相同。这些亚群均表达已知的MSC标志物，但目前尚未发现可用于区分不同亚群的特异性标志物。因此，分离不同亚群的替代方法是使用克隆环分离单克隆来源的细胞。来源于单个克隆的细胞可分别进行培养和评估。

从大鼠股骨和胫骨中分离出MSCs，并通过磁性细胞分选进行富集。通过流式细胞术确认分选细胞表面标志物的表达。这些细胞还在克隆密度下培养以形成单个克隆，然后使用克隆环分离这些克隆。

大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离与富集及单克隆来源MSCs的分离

间充质干细胞（MSCs）是一类成体干细胞，具有作为治疗应用来源的广阔前景。这些细胞可从骨髓中分离获得，并且……

间充质干细胞（简称 MSCs）从一只六至八周龄的雌性大鼠体内分离，并在 10 厘米的培养皿中培养至约 80% 汇合度。为富集 MSCs，细胞首先用生物素偶联的一抗进行染色，随后加入链霉亲和素偶联的磁珠。标记后的细胞通过磁性激活细胞分选法被分离为两个组分：阴性组分和阳性组分。随后，采用流式细胞术分析以确认表面标志物的表达。最后，使用克隆环获得单克隆来源的间充质干细胞。大家好，我是来自密歇根州立大学化学工程与材料科学系Christina Chang实验室的Lee。今天我们将向您展示一种分离和富集chy干细胞以及获得单克隆来源细胞的方法。我们在实验室中采用该方法来研究红系干细胞的增殖与分化行为。现在就开始吧。将从一只6至8周龄的Sprague Dawley雌性大鼠中分离间充质干细胞（MSCs）。开始该操作时，切断已处死动物后肢的股骨和胫骨。去除皮肤和肌肉组织，将解剖出的股骨和胫骨浸入70%异丙醇中数秒钟，随后转移至一份X-D-P-B-S中。以下步骤应在生物安全柜中进行。首先，将股骨和胫骨转移至一个含有DMEM的10厘米培养皿中。然后，用镊子夹住每根骨骼，用剪刀剪开两端。将22号针头连接至3毫升注射器，并吸入DMEM培养基。将针头插入骨段的一端开口，冲洗骨髓至50毫升离心管中。每根骨在完全获取骨髓后重复此操作两到三次。重悬细胞，然后将细胞悬液通过70微米细胞筛，以去除骨碎片和血细胞聚集体。在4摄氏度下以200 ×g离心5分钟。通过抽吸去除上清液后，将细胞重悬于25毫升MSC培养基中接种。将10毫升细胞悬液分别加入两个10厘米的培养皿中。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养一至两周。当先前分离的大鼠MSCs达到约80%融合度时，吸除培养基，并向每个培养皿中加入四到五毫升胰蛋白酶EDTA。将培养皿放回培养箱，孵育约五分钟。为使细胞脱落，加入等量培养基以中和胰蛋白酶。收集细胞悬液至15毫升离心管中，在4 °C条件下于200 ×g离心五分钟。现在我们将通过两种表面标志物 CD54 和 CD90 来展示间充质干细胞（MSCs）的富集过程。使用 BD Biosciences 公司的 BD I 型细胞分离磁铁。首先，将细胞沉淀重悬于细胞染色缓冲液中，浓度为每毫升 2000 万个细胞。接下来，向细胞悬液中加入生物素标记的CD 54抗体和生物素标记的CD 90抗体，轻轻混匀后，置于冰上孵育15分钟。用过量的1× BD IMAG缓冲液洗涤标记的细胞。在4°C条件下，以200 ×g离心5分钟，沉淀标记的细胞。通过充分涡旋重悬BD IMAG链霉亲和素颗粒，然后每1000万细胞加入40 µL颗粒。将颗粒与标记的细胞充分混合，并在6至12摄氏度下孵育细胞30分钟。孵育期间，标记一个圆底试管用于收集阳性组分。孵育结束后，将标记体积调整至每毫升含2000万个细胞。使用一个 Expedia I mag 缓冲液。将标记的细胞转移至阳性组分收集管中。将阳性组分收集管置于 BDI 磁铁上，静置六分钟。然后，将仍置于BDI磁铁上的阳性组分管中的上清液用玻璃巴斯德吸管吸除。接着，将阳性组分管从BDI磁铁上取下并置于冰上。加入1毫升预冷的1× BDI磁珠缓冲液，通过轻柔混匀重悬细胞。将试管重新放回BDI磁铁上，静置2至4分钟。用新的玻璃巴斯德吸管移除上清液。按前述方法重复洗涤步骤。再重复一次。最后，用一支新的玻璃巴斯德移液管吸出上清液。然后将离心管从BDI磁铁架上取下。将细胞重悬于1毫升培养基中，并将细胞悬液转移至含有25毫升培养基种子的50毫升离心管中。使用1个75平方厘米的培养瓶维持细胞生长，另准备一个10厘米的培养皿用于流式细胞术。开始分离单克隆来源的间充质干细胞时，将细胞以每10厘米培养皿约50至100个细胞的密度接种，并在37°C、5% CO₂的培养箱中培养1至2周。在培养的1至2周期间，使用倒置显微镜观察分离良好的克隆。当克隆生长至足够大小（每个克隆超过100个细胞）时，用永久性记号笔在培养皿底部标记克隆位置。挑选待标记的菌落时，需确保其周围无其他邻近菌落。用镊子以一倍X-D-P-B-S缓冲液吸去培养基，并清洗培养皿一次。取一个无菌克隆环，轻轻将其置于标记菌落周围。 重复此步骤，直至每个标记的菌落上都放置了克隆环。向每个克隆环中加入 100 µL 胰蛋白酶 EDTA 溶液，并将培养皿放回培养箱。五分钟后，在显微镜下观察细胞，检查其是否变圆。当细胞脱落后，加入等量的培养基以中和胰蛋白酶活性。用200微升移液器混匀细胞悬液，并将其转移至含有3毫升预热培养基的60毫米培养皿中。标记培养皿，然后将其放回培养箱中，在分离后进行贴壁培养。接种后第二天应可见MSCs。随着细胞持续增殖，当细胞融合度达到约80%时，细胞应呈现本相差图像中所示的形态，即大多数细胞呈纺锤形或星形，此时适合进行传代培养。胰蛋白酶消化后，细胞应呈圆形并悬浮于培养基中。待间充质干细胞经磁性细胞分选富集后，需进行流式细胞术以验证其表面标志物的表达情况。若富集效果良好，细胞应对间充质干细胞标志物 CD54 和 CD90 呈阳性染色，而对造血干细胞标志物 CD45 呈阴性。同型对照 IgG2a 和 IgG1 用作阴性对照。当细胞以适当的单克隆密度接种时，克隆应由单个细胞增殖形成，如本示例所示。随后可使用克隆环分离各克隆，来自不同克隆的细胞可分别进行培养。在这两个示例中，源自一个克隆的细胞呈纺锤形，而源自另一个克隆的细胞呈圆形。我们已经向您展示了如何分离和富集随机及常见的干细胞，以及如何获得单克隆来源的细胞。在该操作过程中，需要注意在分离阶段去除血凝块和骨碎片；在富集过程中使用适量的抗体，并在克隆分离时准确标记已成功分离的克隆。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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生物学

分离和富集大鼠间质干细胞（MSCS）及衍生的干细胞分离单细胞集落

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从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞

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本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。...

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。...

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

本文介绍了一种结合全骨髓贴壁法与流式细胞术分选的方法，用于分离、培养、分选和鉴定大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞。...

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养

脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的一种潜在MSC来源。在本方案中，我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，随后采用一种简单、快速的方案，由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。...

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分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

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大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养技术

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小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

学习从大鼠股骨和胫骨中分离和富集间充质干细胞（MSCs）的方法，使用磁激活细胞分选和流式细胞术进行表面标志物分析，并通过克隆环获得单细胞集落衍生的干细胞。

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