大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离与富集及单克隆来源MSCs的分离

间充质干细胞（简称 MSCs）从一只六至八周龄的雌性大鼠体内分离，并在 10 厘米的培养皿中培养至约 80% 汇合度。为富集 MSCs，细胞首先用生物素偶联的一抗进行染色，随后加入链霉亲和素偶联的磁珠。标记后的细胞通过磁性激活细胞分选法被分离为两个组分：阴性组分和阳性组分。

随后，采用流式细胞术分析以确认表面标志物的表达。最后，使用克隆环获得单克隆来源的间充质干细胞。大家好，我是来自密歇根州立大学化学工程与材料科学系Christina Chang实验室的Lee。

今天我们将向您展示一种分离和富集chy干细胞以及获得单克隆来源细胞的方法。我们在实验室中采用该方法来研究红系干细胞的增殖与分化行为。现在就开始吧。

将从一只6至8周龄的Sprague Dawley雌性大鼠中分离间充质干细胞（MSCs）。开始该操作时，切断已处死动物后肢的股骨和胫骨。去除皮肤和肌肉组织，将解剖出的股骨和胫骨浸入70%异丙醇中数秒钟，随后转移至一份X-D-P-B-S中。

以下步骤应在生物安全柜中进行。首先，将股骨和胫骨转移至一个含有DMEM的10厘米培养皿中。然后，用镊子夹住每根骨骼，用剪刀剪开两端。

将22号针头连接至3毫升注射器，并吸入DMEM培养基。将针头插入骨段的一端开口，冲洗骨髓至50毫升离心管中。每根骨在完全获取骨髓后重复此操作两到三次。

重悬细胞，然后将细胞悬液通过70微米细胞筛，以去除骨碎片和血细胞聚集体。在4摄氏度下以200 ×g离心5分钟。通过抽吸去除上清液后，将细胞重悬于25毫升MSC培养基中接种。

将10毫升细胞悬液分别加入两个10厘米的培养皿中。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养一至两周。当先前分离的大鼠MSCs达到约80%融合度时，吸除培养基，并向每个培养皿中加入四到五毫升胰蛋白酶EDTA。

将培养皿放回培养箱，孵育约五分钟。为使细胞脱落，加入等量培养基以中和胰蛋白酶。收集细胞悬液至15毫升离心管中，在4 °C条件下于200 ×g离心五分钟。

现在我们将通过两种表面标志物 CD54 和 CD90 来展示间充质干细胞（MSCs）的富集过程。使用 BD Biosciences 公司的 BD I 型细胞分离磁铁。首先，将细胞沉淀重悬于细胞染色缓冲液中，浓度为每毫升 2000 万个细胞。

接下来，向细胞悬液中加入生物素标记的CD 54抗体和生物素标记的CD 90抗体，轻轻混匀后，置于冰上孵育15分钟。用过量的1× BD IMAG缓冲液洗涤标记的细胞。在4°C条件下，以200 ×g离心5分钟，沉淀标记的细胞。通过充分涡旋重悬BD IMAG链霉亲和素颗粒，然后每1000万细胞加入40 µL颗粒。

将颗粒与标记的细胞充分混合，并在6至12摄氏度下孵育细胞30分钟。孵育期间，标记一个圆底试管用于收集阳性组分。孵育结束后，将标记体积调整至每毫升含2000万个细胞。

使用一个 Expedia I mag 缓冲液。将标记的细胞转移至阳性组分收集管中。将阳性组分收集管置于 BDI 磁铁上，静置六分钟。

然后，将仍置于BDI磁铁上的阳性组分管中的上清液用玻璃巴斯德吸管吸除。接着，将阳性组分管从BDI磁铁上取下并置于冰上。加入1毫升预冷的1× BDI磁珠缓冲液，通过轻柔混匀重悬细胞。

将试管重新放回BDI磁铁上，静置2至4分钟。用新的玻璃巴斯德吸管移除上清液。按前述方法重复洗涤步骤。

再重复一次。最后，用一支新的玻璃巴斯德移液管吸出上清液。然后将离心管从BDI磁铁架上取下。

将细胞重悬于1毫升培养基中，并将细胞悬液转移至含有25毫升培养基种子的50毫升离心管中。使用1个75平方厘米的培养瓶维持细胞生长，另准备一个10厘米的培养皿用于流式细胞术。

开始分离单克隆来源的间充质干细胞时，将细胞以每10厘米培养皿约50至100个细胞的密度接种，并在37°C、5% CO₂的培养箱中培养1至2周。在培养的1至2周期间，使用倒置显微镜观察分离良好的克隆。当克隆生长至足够大小（每个克隆超过100个细胞）时，用永久性记号笔在培养皿底部标记克隆位置。

挑选待标记的菌落时，需确保其周围无其他邻近菌落。用镊子以一倍X-D-P-B-S缓冲液吸去培养基，并清洗培养皿一次。取一个无菌克隆环，轻轻将其置于标记菌落周围。

重复此步骤，直至每个标记的菌落上都放置了克隆环。向每个克隆环中加入 100 µL 胰蛋白酶 EDTA 溶液，并将培养皿放回培养箱。五分钟后，在显微镜下观察细胞，检查其是否变圆。

当细胞脱落后，加入等量的培养基以中和胰蛋白酶活性。用200微升移液器混匀细胞悬液，并将其转移至含有3毫升预热培养基的60毫米培养皿中。标记培养皿，然后将其放回培养箱中，在分离后进行贴壁培养。

接种后第二天应可见MSCs。随着细胞持续增殖，当细胞融合度达到约80%时，细胞应呈现本相差图像中所示的形态，即大多数细胞呈纺锤形或星形，此时适合进行传代培养。

胰蛋白酶消化后，细胞应呈圆形并悬浮于培养基中。待间充质干细胞经磁性细胞分选富集后，需进行流式细胞术以验证其表面标志物的表达情况。若富集效果良好，细胞应对间充质干细胞标志物 CD54 和 CD90 呈阳性染色，而对造血干细胞标志物 CD45 呈阴性。同型对照 IgG2a 和 IgG1 用作阴性对照。

当细胞以适当的单克隆密度接种时，克隆应由单个细胞增殖形成，如本示例所示。随后可使用克隆环分离各克隆，来自不同克隆的细胞可分别进行培养。在这两个示例中，源自一个克隆的细胞呈纺锤形，而源自另一个克隆的细胞呈圆形。

我们已经向您展示了如何分离和富集随机及常见的干细胞，以及如何获得单克隆来源的细胞。在该操作过程中，需要注意在分离阶段去除血凝块和骨碎片；在富集过程中使用适量的抗体，并在克隆分离时准确标记已成功分离的克隆。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。