Name: 在甲醇酵母表达的重组蛋白毕赤酵母 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学习在毕赤酵母中表达重组蛋白的完整实验流程，包括电转化感受态细胞制备、载体转化、DNA纯化验证及Western blot检测。该方法适用于多种重组蛋白的高效表达与功能研究。

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感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大卫生研究院（CIHR）对本工作的支持。M.T. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化研究中心（CMDE）提供的博士后奖学金支持。

在甲醇酵母Pichia pastoris中表达重组蛋白
在开始本方案之前，您应已将目标基因正确地克隆至P. pastoris 父载体中的阅读框内，并对载体进行测序，以确认目标基因已正确插入。
第一步：制备电转感受态酵母细胞、质粒线性化及转化至 P. pastoris
进行此步骤时，您需要准备好以下培养基和培养板：
<ul>
 <li>YPDS 平板</li>
 <li>600 mL YPD 培养基</li>
 <li>预冷的无菌水</li>
 <li>1 M 山梨醇</li>
 <li>Amicon Ultra-4 离心过滤装置</li>
 <li>Microcon YM-30 离心过滤单元</li>
 <li>0.2 cm 电穿孔比色皿</li>
 <li>15 mL 无菌玻璃试管</li>
 <li>无菌玻璃巴斯德吸管</li>
 <li>含 Zeocin 的 YPDS 平板</li>
</ul>
第1部分：电转感受态酵母细胞的制备
<ol>
	<li>在计划进行转化的四天前，将 P. pastoris 细胞划线接种于不含 Zeocin 的 YPDS 平板上，并在 30°C 下培养 1–2 天，直至形成单菌落。</li>
	<li>在计划进行转化的两天前，将 5 ml 的 P. pastoris 菌株接种于 50 ml Falcon 管中的 YPD 培养基中，在 30°C 下过夜培养。将 Falcon 管放入三角瓶中固定，置于摇床中培养。</li>
	<li>在转化前一天，将 0.25 ml 过夜培养物接种至 2 升三角瓶中的 500 ml 新鲜 YPD 培养基中，再次于 30°C 摇床中过夜培养，使菌液 OD600 达到 1.3–1.5。 
 注意：在分光光度计上测量前应稀释样品，以获得准确结果。</li>
	<li>在转化当天，准备好冰冻的无菌水和 1 M 山梨醇溶液。在 4°C 下以 1500 × g 离心 5 分钟收集细胞。用 500 ml 冰冻的无菌水重悬沉淀。</li>
	<li>再次按照步骤 4 的条件离心细胞。用 250 ml 冰冻的无菌水重悬沉淀。</li>
	<li>再次按照步骤 4 的条件离心细胞。用 20 ml 冰冻的 1 M 山梨醇溶液重悬沉淀。</li>
	<li>再次按照步骤 4 的条件离心细胞。将沉淀重悬于 1 ml 冰冻的 1 M 山梨醇溶液中，终体积约为 1.5 ml。将细胞置于冰上或 4°C 保存，直至后续使用。 
 注意：我们制备的电转感受态细胞量通常多于实际需要量，并将其分装为每管 80 μl，置于微量离心管中于 -80 °C 保存。储存的细胞在一个月内使用完毕。</li>
</ol>
第2部分：pPICZαA 载体的线性化与浓度测定
为了进行转化，通过限制性酶切将含有目的基因的载体线性化。我们使用 PmeI 酶，也可使用其他限制性酶切位点。必须确保插入片段中不含用于载体线性化的限制性酶切位点。将DNA转化至 P. pastoris 时，需要将5-20 μg的线性化DNA溶于5-10 μl无菌水中。
同时将不含插入片段的普通载体线性化、浓缩，并转入 P. pastoris 中。不含插入片段的亲本载体可用于检测胞内本底表达水平，作为对照，有助于解释表达结果。
<ol>
	<li>将所有试剂在冰上解冻，混合以下试剂，并短暂离心使液体全部沉至管底，轻弹管壁后再次离心：
<ul>
 <li>x μl 无菌水</li>
 <li>5.0 μl 10X NEBuffer 4</li>
 <li>0.5 μl 100X BSA</li>
 <li>最多 2 μg 载体 DNA（~ 100 ng/μl）</li>
 <li>2.0 μl PmeI 酶混合液</li>
 </ul>
 → 总反应体积为 50 μl 注意：为获得足量的线性化载体 DNA，需在多个独立离心管中分别配制上述混合液 3 或 4 份，随后在使用 Amicon Ultra 离心浓缩装置浓缩消化后的 DNA 时将各管溶液合并。</li>
	<li>在 37°C 下孵育 3 小时，随后在 65°C 下加热 20 分钟以灭活酶混合液。</li>
	<li>在此期间，用 1 mL Milli-Q 水预冲洗 Amicon Ultra-4 离心滤膜装置，以 4000 × g 离心 6–8 分钟，弃去滤过液。 注意：滤膜一旦润湿后切勿使其干燥。若预冲洗后暂不使用该装置，应保持滤膜上有水，直至使用前再弃去。</li>
	<li>将第 2 步中热灭活后的溶液转移至已预冲洗的 Amicon 离心滤膜装置中，以 4000 × g 离心 6–8 分钟，弃去滤过液。 注意：若已制备多份线性化反应液，应将所有溶液合并至同一个 Amicon 离心滤膜装置中。</li>
	<li>离心至 Amicon 滤膜上溶液体积减少至约 100 ~ 150 μl。将上一步中空离心管用 1.5 mL 无菌水润洗，然后将此水加入 Amicon 滤膜装置中，混匀后重复离心步骤。再用 1.5 mL 无菌水洗涤一次，再次弃去滤过液。最终体积浓缩至约 150 μl。洗涤步骤可去除缓冲液中残留的盐分，防止电穿孔时发生电弧现象。 注意：我们使用摆动桶转子进行离心；可将盖好的 Amicon 离心滤膜装置放入 50 mL Falcon 管中固定位置。即使经过长时间离心，Amicon 滤膜装置仍会保留约 50 μl 溶液在滤膜上。</li>
	<li>为进一步浓缩 DNA 样品，将 Amicon 滤膜装置中剩余的 DNA 溶液转移至已预冲洗的 Microcon YM-30 离心滤膜装置中，并用额外 50 μl 无菌水冲洗 Amicon 管以回收全部 DNA。在微量离心机中以 10,000 × g 离心 Microcon 离心滤膜装置，直至滤膜表面仍轻微覆盖液体为止。仅短时间离心，并每隔一分钟检查滤膜上剩余液体量。当液体量极少时即停止离心。为回收 DNA 溶液，将滤膜装置倒置放入新的微量离心管中，在第二次离心步骤中以 1000 × g 离心 3 分钟。最终总体积不应超过 10–15 μl，否则 DNA 可能因过于稀释而影响转化效率。 注意：切勿离心过久，避免滤膜完全干燥，以防样品损失。若滤膜已干燥，可加入 10–15 μl 无菌水至膜表面，轻轻晃动 30 秒，然后按上述方法回收 DNA。</li>
</ol>
第3部分：通过电穿孔法将外源基因转化至P. pastoris
<ol>
	<li>含有目的片段的线性化且浓缩的 pPICZαA DNA 现已准备好用于转化电转感受态的 P. pastoris 细胞（参见步骤 I，第 2 部分）。在转化前约 15 分钟，准备好以下试剂和设备：取一个微量离心管加入 1 mL 冰上预冷的 1 M 山梨醇；将一个 0.2 cm 电穿孔杯置于冰上；标记一个无菌的 15 mL 玻璃试管，并准备好一支无菌玻璃巴斯德吸管。</li>
	<li>将步骤 I 第 2.7 步中 80 μl 的细胞转移至预冷的 0.2 cm 电穿孔杯中。加入步骤 I 第 3.6 步中浓缩的线性化 pPICZαA DNA 溶液，并通过在电穿孔杯中左右移动移液器吸头来混匀。
	 注意：加入 DNA 时，仅将移液器按至第一档。在将 DNA 与细胞混匀后，将移液器按至第二档，然后缓慢从电穿孔杯中取出。</li>
	<li>将装有细胞的电穿孔杯置于冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>用纸巾擦拭电穿孔杯外壁，然后根据所用电穿孔仪制造商推荐的酵母（Saccharomyces cerevisiae）参数进行电击。
	 注意：我们使用 Bio-Rad GenePulser，设置如下：
	<ul>
		<li>充电电压 (V)：1500；</li>
		<li>电容 (μF)：25；</li>
		<li>电阻 (Ω)：200。</li>
	</ul>
	使用 0.2 cm 电穿孔杯时，该程序产生的脉冲时长约 ~10 ms，电场强度约为 ~7500 V/cm。</li>
	<li>立即向电穿孔杯中加入 1 mL 冰冷的 1 M 山梨醇。使用无菌玻璃巴斯德吸管将杯内液体转移至无菌 15 mL 试管中。</li>
	<li>将试管在 30°C 下静置孵育 1.5 小时，不振荡。</li>
	<li>在四个含有 100 μg/mL Zeocin 的标记 YPDS 平板上各加入 5–7 颗无菌玻璃珠。从 15 mL 玻璃试管中取 250 μl 电穿孔混合液涂布于每个平板上。水平轻摇平板使细胞均匀分布。让平板静置干燥 15 分钟，然后通过倒置平板去除琼脂表面的玻璃珠。
	 注意：我们使用 100 μg/mL Zeocin 对 GS115 Pichia 菌株的转化子进行筛选。若使用其他 Pichia 菌株，筛选条件可能有所不同。</li>
	<li>将平板倒置，在 30°C 下培养 2 至 3 天，直至菌落形成。用黑色塑料袋包裹平板，以防止光敏性的 Zeocin 降解。平板中抗生素浓度过低可能导致假阳性克隆的出现。</li>
	<li>菌落形成后，挑选 12 个菌落，并通过在含有 100 μg/mL Zeocin 的新鲜 YPDS 平板上划线接种进行纯化。</li>
</ol>
第二步：蛋白质表达 Pichia pastoris
进行此步骤时，您需要准备好以下培养基、培养皿和试剂：
<ul>
 <li>BMGY 培养基</li>
 <li>甘油，已灭菌</li>
 <li>BMMY 培养基</li>
 <li>甲醇，已灭菌</li>
 <li>EPICENTRE 酵母 DNA 纯化试剂盒</li>
</ul>
您还需要以下烧瓶：
<ul>
 <li>250 mL 锥形瓶，已灭菌</li>
 <li>1 L 带挡板锥形瓶，已灭菌</li>
 <li>200 mL 烧杯，已灭菌</li>
</ul>
第1部分：Pichia pastoris中的蛋白质表达
以下所有步骤同样适用于转化后的对照载体（无插入片段）。
<ol>
	<li>从纯化后的平板上挑取单个菌落 毕赤酵母 步骤I，第3.9部分中的菌落，接种于25 mL BMGY培养基中，使用无菌250 mL三角瓶。置于30 °C，250 rpm振荡培养。 30°C 在摇床培养箱（250-300 rpm）中振荡培养，直至菌液达到指定的OD值600 2-6（约16-18小时）。 注意：在分光光度计上测量前，请先稀释样品，以获得准确结果。细胞将处于对数生长期。</li>
	<li>当细胞达到适当的 OD 时600 制备甘油菌种保存液。转移 800 μl 将25 mL细胞培养物转移至一个2 mL Corning冻存管中，并加入 200 μl 无菌甘油。将甘油菌种保存液冷冻并置于 -80°C.</li>
	<li>用于酵母DNA纯化时，取25 mL细胞培养液中的1.5 mL转移至微量离心管中。在室温下以1300 × g离心1分钟收集细胞。这些细胞用于分析 Pichia 整合子用于再次验证目的基因是否已整合到 毕赤酵母 基因组（参见步骤 II，第2部分）。将细胞沉淀物保存在 4°C 直至进一步分析。</li>
	<li>将剩余的25 mL培养物转移至50 mL Falcon离心管中，在室温下以3000 × g离心5分钟收集细胞。弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上以去除残留培养基。为洗涤细胞沉淀，用20 mL BMMY重悬沉淀，以去除残留的BMGY培养基，因为BMGY培养基中的甘油可能抑制后续的表达。再次在室温下以3000 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重悬细胞沉淀至 OD600 在BMMY培养基中诱导表达至OD600为1.0（约100-200 mL），并将菌液转移至1升挡板摇瓶中。用200 mL烧杯覆盖瓶口，放回培养箱继续培养 30°C. 注意：温度不得超过 30°C如果您的培养箱温度波动，将温度设定在 28°C充分的通气也是甲醇诱导过程中实现高效表达的重要参数（诱导表达时，培养液体积切勿超过 &gt; 总体积的10-30%）。我们强烈推荐使用带挡板的摇瓶，因为其可向培养基中引入更多氧气。</li>
	<li>每24小时添加灭菌的纯甲醇，使甲醇终浓度为0.5%，以维持诱导。</li>
	<li>在诱导表达开始后的特定时间点，取1 mL培养物转移至1.5 mL微量离心管中。室温下以1300 × g离心2.5分钟。将上清液转移至另一支1.5 mL微量离心管中。将上清液和菌体沉淀保存于-80°C 直至进一步分析。将分析不同时间点的样品，以确定诱导后蛋白表达的最佳时间 period。 注：我们选择6 h、12 h、24 h、36 h和48 h作为取样时间点。可进一步培养至4天。不同表达蛋白的最适时间点有所不同。</li>
	<li>通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和蛋白质印迹法（本方案未描述）分析上清液和细胞沉淀中的蛋白质表达。</li>
</ol>
第2部分：酵母DNA纯化及PCR分析 毕赤酵母 整合子
在BMGY培养基中对Pichia菌株进行酵母DNA纯化所需的全部试剂均包含在EPICENTRE公司的MasterPure Yeast DNA Purification Kit中。 注意：该分析为附加步骤，用于检测目的基因是否已整合至Pichia基因组中。使用从BMGY培养物中取样的1.5 mL样品（参见步骤II，第1.3部分）离心后获得的细胞沉淀进行后续操作。
按照Epicentre MasterPure酵母DNA纯化试剂盒说明书操作，使用酵母DNA和插入片段特异性引物进行PCR扩增。取3 μl PCR产物，在含有1 μl溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。在其中一个泳道中加入1 Kb+ DNA分子量标记，以判断插入片段的大小，并使用凝胶成像系统观察DNA条带。
可通过蛋白质印迹分析检测重组蛋白。可使用金属离子负载树脂进行His标签蛋白纯化（本方案中未描述该步骤）。
附录，配方列表
步骤一：
<ol>
	<li>YPD 培养基： 制备 600 mL YPD 培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基），将 5 g 酵母提取物和 12 g 蛋白胨溶解于 540 mL 水中。在液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。 同时，准备 70 mL 20% 葡萄糖溶液，并在使用前经滤膜除菌。 待高压灭菌后的溶液冷却至约 60°C，加入 60 mL 滤膜除菌的 20% 葡萄糖溶液。</li>
	<li>YPDS（含 Zeocin）平板： 制备 500 mL YPDS + Zeocin 琼脂培养基（含山梨醇的酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基），将 5 g 酵母提取物、91.1 g 山梨醇和 10 g 蛋白胨溶解于 450 mL 水中。加入 10 g 琼脂和一个磁力搅拌子，在液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。 同时，准备 60 mL 20% 葡萄糖溶液，并在使用前经滤膜除菌。 待高压灭菌后的溶液冷却至约 60°C，加入 50 mL 滤膜除菌的 20% 葡萄糖溶液。 在加入抗生素之前，先倾注若干平板以制备不含 Zeocin 的 YPDS 平板。然后从 100 mg/mL 的储备液中加入 500 μL Zeocin，使琼脂中的终浓度为 100 μg/mL。加入抗生素时需在磁力搅拌器上搅拌，并继续搅拌约额外 2 分钟以确保均匀混合。 将培养基倒入培养皿中，并用黑色塑料膜覆盖。将平板置于实验台面上过夜晾干。含 Zeocin 的 YPD 平板储存于 4°C，保质期为一至两周。 注意：使用塑料膜覆盖是必要的，因为 Zeocin 对光敏感。</li>
</ol>
步骤二：
<ol>
	<li>BMGY（缓冲甘油复合培养基）和 BMMY（缓冲甲醇复合培养基）： 分别将 8 g 酵母提取物和 16 g 蛋白胨溶解于 560 mL 水中。液体循环条件下高压灭菌 20 分钟。 在此期间，配制以下溶液：
<ul>
 <li>1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0：</li>
</ul>
取 24 mL 1 M K2HPO4 与 156 mL 1 M KH2PO4 混合，确认 pH = 6.0（若需调节 pH，使用磷酸或 KOH）。过滤除菌，室温保存。该溶液保质期超过一年。
<ul>
 <li>10X YNB（含硫酸铵、不含氨基酸的 13.4% 酵母氮源基础）： </li>
</ul>
将 26.8 g 不含氨基酸但含硫酸铵的酵母氮源基础（YNB）溶解于 200 mL 水中，过滤除菌。加热溶液以使 YNB 完全溶解。4°C 保存。该溶液保质期约为一年。注意：也可使用 3.4 g 不含硫酸铵和氨基酸的 YNB，并额外加入 10 g 硫酸铵。
<ul>
 <li>500X B（0.02% 生物素）： </li>
</ul>
将 10 mg 生物素溶解于 50 mL 水中，过滤除菌。4°C 保存。该溶液保质期约为一年。
<ul>
 <li>10X M（5% 甲醇）： </li>
</ul>
将 5 mL 甲醇与 95 mL 水混合，过滤除菌，4°C 保存。该溶液保质期约为两个月。
<ul>
 <li>10X GY（10% 甘油）</li>
</ul>
将 10 mL 甘油与 90 mL 水混合，过滤除菌。室温保存。该溶液保质期超过一年。 待高压灭菌的溶液冷却至室温后，加入以下成分并充分混匀：
<ul>
 <li>80 mL 1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0； </li>
 <li>80 mL 10X YNB</li>
 <li>0.16 mL 500X B</li>
 <li>80 mL 10X GY</li>
</ul>
配制 BMMY 时，加入 80 mL 10X M 代替甘油。 
培养基于 4°C 保存。该溶液保质期约为两个月。</li></ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1862/1862fig1.jpg" alt="凝胶电泳结果，DNA分离分析，带条带的泳道，分子量标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 该蛋白免疫印迹图像显示了表达24小时后的四种蛋白（标记为1605、0537、1228和1682）。用于免疫印迹的抗体为c-myc-HRP抗体。第二泳道（标记为N）为阴性对照，加样内容为未表达重组蛋白的细胞上清液，这些细胞因转化了空载体（原始载体）而不表达目标蛋白。

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

利用甲基营养型酵母进行蛋白质表达 Pichia pastoris 作为一种宿主系统在本方案中进行了描述。该蛋白可根据所使用的克隆载体分泌至培养基中。重组蛋白的分泌可简化后续纯化步骤。然而，所示条件可能需要针对不同蛋白的表达进行优化，条件及表达时间的改变可能会提高蛋白表达水平。本方案所用载体具有以下特征： c-myc 表位以及针对该表位的抗体均可购得。这使得研究人员能够分析目前尚无可用抗体的蛋白质。亲本载体上的His标签特性可实现蛋白质在金属螯合树脂上的纯化，且已有针对该载体His标签区域的抗体可供使用。
如本实验方案所述，在Pichia pastoris中进行蛋白表达是一个多步骤的过程，需要周密的规划和准备。完成所有步骤需要两到三周的时间（不包括目的基因表达载体的克隆时间）。成功转化P. pastoris的基础在于使用具有高转化效率的感受态酵母细胞，以及能够整合到酵母基因组中的线性化表达载体。Western blot分析和His标签纯化可用于检测重组蛋白的表达水平，是完成本方案后需进一步进行的后续实验步骤。

在甲醇酵母 pichia pastoris 中表达重组蛋白

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

在微生物真核宿主Pichia pastoris中进行蛋白表达，可在一种快速且易于使用的表达系统中大量生产重组蛋白。
作为一种单细胞微生物，P. pastoris 易于操作，可在廉价培养基上以高细胞密度快速生长。作为真核生物，P. pastoris 能够执行许多高等真核细胞所进行的翻译后修饰，所获得的重组蛋白可发生蛋白质折叠、蛋白水解加工、二硫键形成以及糖基化[1]。
作为一种甲基营养型酵母，P. pastoris 能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。醇氧化酶基因 AOX1 的强启动子受到严格调控，并可被甲醇诱导，常用于目的基因的表达。因此，通过向培养基中添加甲醇即可诱导外源蛋白的表达[2; 3]。
另一个重要优势是利用信号序列将外源蛋白靶向巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）的分泌途径，从而实现重组蛋白向培养基中的分泌。由于酵母自身向培养基分泌的内源性蛋白水平极低，且培养基中无外源添加蛋白，因此异源蛋白在培养基总蛋白中占主导地位，有利于后续的蛋白纯化步骤[3; 4]。
此处使用的载体（pPICZαA）包含AOX1启动子，可用于严格调控并在甲醇诱导下表达目的基因；含有α因子分泌信号，以实现重组蛋白的分泌；含有Zeocin抗性基因，可用于在E. coli和Pichia中进行筛选；以及一个C端肽段，该肽段包含c-myc表位和多聚组氨酸（6xHis）标签，用于重组蛋白的检测与纯化。我们还展示了利用特异性Anti-myc-HRP抗体对重组蛋白进行的Western印迹分析，该抗体可识别原始载体上的c-myc表位。

本方案描述了利用甲醇酵母Pichia pastoris进行蛋白表达的方法。同时包括电转感受态酵母细胞的制备、将含有目的基因的载体转化至P. pastoris以及酵母DNA的纯化。最后步骤包括蛋白质的Western印迹分析和蛋白纯化。

在甲醇酵母 Pichia pastoris 中表达重组蛋白

在微生物真核宿主毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行蛋白表达，可实现快速、高效地大量生产重组蛋白。

以下方案描述了使用甲基营养型酵母毕赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）进行蛋白表达的过程。内容包括电转感受态酵母细胞的制备，以及将含有目的基因的载体转化进入PPAs，随后进行酵母DNA纯化以检测目的基因是否正确整合到酵母基因组中。最后，我们将进行重组蛋白的表达。大家好，我是玛丽亚，来自不列颠哥伦比亚大学微生物学与免疫学系霍尔姆实验室。我叫马库斯，也来自霍尔姆实验室。今天我们将向您展示一种在TRO酵母PQ.Past故事中表达重组蛋白的实验方法。我们在实验室中采用此方法研究来自未被充分开发的微生物的蛋白质，这些微生物的环境DNA已被提取并存档，同时构建了宏基因组文库。现在让我们开始操作。在甲基营养型酵母毕赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）中表达重组蛋白时，需要将您感兴趣的基因按正确阅读框克隆至PPA载体中。在本实验中，我们使用载体 PPICZαA。该载体含有 AOX1 启动子，可用于严格调控甲醇诱导的目的基因表达；含有 α 因子分泌信号，可促进重组蛋白的分泌；含有 zeocin 抗性基因，可用于大肠杆菌和毕赤酵母（Pichia pastoris）中的筛选；还含有一个 C 末端肽段，其中包括 c-myc 表位和多聚组氨酸标签，用于重组蛋白的检测与纯化。在转化前，需通过限制性酶切对含有目的基因的载体进行线性化处理。我们使用 PME I 酶进行酶切，但也可选用其他限制性酶切位点，前提是目的基因片段中不含有该酶的识别位点。为了获得足量的线性化载体DNA，需在不同的离心管中设置三到四个50微升的限制性酶切反应体系。酶切完成后，将所有反应液合并，并浓缩您的构建产物。使用AmCon离心过滤装置和MicroCon离心过滤装置，您需要将五至二十微克的线性化DNA浓缩至五至十微升无菌水中，用于转化PPA dous。为制备电转化感受态PPA dous，在计划进行转化前四天，将细胞划线接种于不含SN的A-Y-P-D-S平板上，于30摄氏度培养一至两天，直至转化前两天形成单菌落。在50毫升Falcon管中，将5毫升PPA或菌株接种于YPD培养基中，于30摄氏度培养过夜。转化前一天，将Falcon管放入锥形瓶中，固定于摇床。取0.25毫升过夜培养物接种至2升锥形瓶中的500毫升新鲜YPD培养基中。在30摄氏度摇床中过夜培养，使OD600达到1.3至1.5。转化当天，准备好冰、冷的无菌水和1摩尔山梨醇。在4摄氏度下以1500 ×g离心细胞5分钟。离心后，用500毫升冰上预冷的无菌水重悬沉淀。根据离心管的容量，可能需要将体积分装至两个独立的离心管中，或进行多次离心。再次离心细胞，并用250毫升冰上预冷的无菌水重悬沉淀。根据离心管的容量，可将不同的细胞沉淀合并至一个离心管中。在重新悬浮沉淀时，再次离心并重悬细胞。用20毫升冰上预冷的1摩尔山梨醇溶液重悬细胞，转移至50毫升离心管中，然后离心。经过最后一次离心后，将沉淀重悬于1毫升预冷的1摩尔山梨醇溶液中，终体积约为1.5毫升。将重悬的细胞分装至微量离心管中，置于冰上或4摄氏度保存，直至用于转化。在将浓缩的线性化构建体转化至PPA stor细胞之前，准备好以下试剂和设备。取一个微量离心管，加入一毫升一摩尔的山梨醇，置于冰上。将0.2厘米的电穿孔杯放在冰上。标记一个无菌的15毫升玻璃管，并准备好一支无菌的玻璃移液管。将80微升预先制备的电转感受态细胞转移至冰冻的0.2厘米电穿孔杯中。将血浆DNA溶液加入细胞中，通过左右移动移液器枪头混匀。在电穿孔杯中进行电穿孔。将电穿孔杯与细胞置于冰上孵育五分钟。接下来，用纸巾擦拭电穿孔杯的外侧，并根据您所使用的特定电穿孔仪器制造商推荐的酿酒酵母参数对细胞进行电击。本演示中使用 BioRad 基因脉冲仪，设置条件如下：充电电压为 1500 伏，电容为 25 微法，电击后立即接入 200 欧姆的电阻。加入1毫升冰上预冷的1摩尔山梨醇溶液至小瓶中。使用无菌玻璃巴斯德吸管将小瓶内容物转移至无菌的15毫升离心管中。在30°C条件下静置孵育1.5小时，不摇动。1.5 小时后，电穿孔细胞即可进行铺板。向四个标记好的含有 100 微克/毫升 Zain 的 YPTS 平板中各加入 5 到 10 颗无菌玻璃珠。取 250 微升电穿孔液进行涂布。在每块平板上混匀，并水平振荡平板以使细胞均匀分布。将平板静置干燥15分钟，然后通过倒置平板从农杆菌中去除珠子。用黑色塑料膜包裹平板，以防止光敏性Zain降解，并将平板倒置于30摄氏度培养2至3天，直至菌落形成。挑选12个菌落。通过将克隆划线接种于含有100微克/毫升玉米醇溶蛋白的全新YPDS平板上进行纯化。为制备用于蛋白表达的PPA细胞，从纯化的毕赤酵母菌落中挑取单个菌落，接种于25毫升VMGY培养基中，培养基置于无菌的250毫升锥形瓶内，在30°C摇床培养箱中培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD 600）达到2至6。当细胞达到合适的 OD 600 时，制备细胞的甘油菌种用于保存。将 800 微升的细胞培养物转移至一个 2 毫升的冻存管中，并加入 200 微升灭菌甘油。将甘油菌种保存于 -80 摄氏度。此外，将1.5毫升细胞培养物转移至微量离心管中。在室温下以1300 ×g离心1分钟收集细胞。将沉淀物保存在4°C条件下。这些细胞将用于酵母DNA纯化，通过使用插入片段特异性引物对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以确认目的基因已整合到毕赤酵母基因组中。将剩余的25毫升培养物转移至50毫升Falcon管中，在室温下以3000 ×g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，将管倒置于纸巾上以去除残留的培养基。用20毫升BMMY培养基重悬细胞沉淀，通过涡旋振荡或反复吹打使其悬浮，然后离心。将细胞悬浮液再次重悬，弃去上清后，用涡旋振荡或吹打将细胞沉淀重悬于BMMY培养基中，调节至OD600为1.0。加入培养基以诱导表达。将培养物转移至一个1升带挡板的锥形瓶中，并用200毫升的透气封口膜覆盖瓶口。我们强烈推荐使用带挡板的烧瓶，因为它们能向培养物中引入更多的氧气。为在甲醇诱导期间实现高效的蛋白表达，将烧瓶置于培养箱中，在30摄氏度下继续培养。如果培养箱的温度存在波动，必须确保温度不超过30摄氏度。将温度设定为28摄氏度。在表达开始后的特定时间点，每隔24小时加入灭菌的纯甲醇，使甲醇终浓度为0.5%，以维持诱导。取1毫升培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在1300 ×g 条件下离心2.5分钟。在室温下，将上清液转移至另一个1.5毫升微量离心管中。将上清液和细胞沉淀在 -80 摄氏度下保存，直至进一步分析。将分析来自不同时间点的样品，以确定诱导后蛋白表达的最佳时间。接下来展示使用 PIA Pastis 作为宿主系统成功表达重组蛋白的一些代表性结果。该蛋白质印迹图像显示了表达24小时后的四种表达蛋白。免疫印迹所用的抗体为抗小鼠HRP抗体。第二泳道为阴性对照，加样内容为未表达重组蛋白的细胞上清液，这些细胞因转化了空载体而无法表达重组蛋白。我们刚刚向您展示了如何使用真核宿主PQ.Plus表达重组蛋白。进行该实验时，重要的是要对您的构建体进行测序，以确认目的基因已正确克隆并处于正确的阅读框内，并且在开始实验前准备好所有培养板和试剂。此外，您需要准备足量的线性化质粒，以便在甲醇诱导蛋白表达前获得大量转化子。务必充分洗涤细胞沉淀，以去除任何可能抑制蛋白表达的甘油残留。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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在甲醇酵母 Pichia pastoris 中表达重组蛋白

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