在甲醇酵母 Pichia pastoris 中表达重组蛋白

以下方案描述了使用甲基营养型酵母毕赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）进行蛋白表达的过程。内容包括电转感受态酵母细胞的制备，以及将含有目的基因的载体转化进入PPAs，随后进行酵母DNA纯化以检测目的基因是否正确整合到酵母基因组中。最后，我们将进行重组蛋白的表达。

大家好，我是玛丽亚，来自不列颠哥伦比亚大学微生物学与免疫学系霍尔姆实验室。我叫马库斯，也来自霍尔姆实验室。今天我们将向您展示一种在TRO酵母PQ.Past故事中表达重组蛋白的实验方法。

我们在实验室中采用此方法研究来自未被充分开发的微生物的蛋白质，这些微生物的环境DNA已被提取并存档，同时构建了宏基因组文库。现在让我们开始操作。在甲基营养型酵母毕赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）中表达重组蛋白时，需要将您感兴趣的基因按正确阅读框克隆至PPA载体中。

在本实验中，我们使用载体 PPICZαA。该载体含有 AOX1 启动子，可用于严格调控甲醇诱导的目的基因表达；含有 α 因子分泌信号，可促进重组蛋白的分泌；含有 zeocin 抗性基因，可用于大肠杆菌和毕赤酵母（Pichia pastoris）中的筛选；还含有一个 C 末端肽段，其中包括 c-myc 表位和多聚组氨酸标签，用于重组蛋白的检测与纯化。在转化前，需通过限制性酶切对含有目的基因的载体进行线性化处理。我们使用 PME I 酶进行酶切，但也可选用其他限制性酶切位点，前提是目的基因片段中不含有该酶的识别位点。

为了获得足量的线性化载体DNA，需在不同的离心管中设置三到四个50微升的限制性酶切反应体系。酶切完成后，将所有反应液合并，并浓缩您的构建产物。使用AmCon离心过滤装置和MicroCon离心过滤装置，您需要将五至二十微克的线性化DNA浓缩至五至十微升无菌水中，用于转化PPA dous。为制备电转化感受态PPA dous，在计划进行转化前四天，将细胞划线接种于不含SN的A-Y-P-D-S平板上，于30摄氏度培养一至两天，直至转化前两天形成单菌落。

在50毫升Falcon管中，将5毫升PPA或菌株接种于YPD培养基中，于30摄氏度培养过夜。转化前一天，将Falcon管放入锥形瓶中，固定于摇床。取0.25毫升过夜培养物接种至2升锥形瓶中的500毫升新鲜YPD培养基中。

在30摄氏度摇床中过夜培养，使OD600达到1.3至1.5。转化当天，准备好冰、冷的无菌水和1摩尔山梨醇。在4摄氏度下以1500 ×g离心细胞5分钟。

离心后，用500毫升冰上预冷的无菌水重悬沉淀。根据离心管的容量，可能需要将体积分装至两个独立的离心管中，或进行多次离心。再次离心细胞，并用250毫升冰上预冷的无菌水重悬沉淀。

根据离心管的容量，可将不同的细胞沉淀合并至一个离心管中。在重新悬浮沉淀时，再次离心并重悬细胞。用20毫升冰上预冷的1摩尔山梨醇溶液重悬细胞，转移至50毫升离心管中，然后离心。

经过最后一次离心后，将沉淀重悬于1毫升预冷的1摩尔山梨醇溶液中，终体积约为1.5毫升。将重悬的细胞分装至微量离心管中，置于冰上或4摄氏度保存，直至用于转化。在将浓缩的线性化构建体转化至PPA stor细胞之前，准备好以下试剂和设备。

取一个微量离心管，加入一毫升一摩尔的山梨醇，置于冰上。将0.2厘米的电穿孔杯放在冰上。

标记一个无菌的15毫升玻璃管，并准备好一支无菌的玻璃移液管。将80微升预先制备的电转感受态细胞转移至冰冻的0.2厘米电穿孔杯中。

将血浆DNA溶液加入细胞中，通过左右移动移液器枪头混匀。在电穿孔杯中进行电穿孔。将电穿孔杯与细胞置于冰上孵育五分钟。

接下来，用纸巾擦拭电穿孔杯的外侧，并根据您所使用的特定电穿孔仪器制造商推荐的酿酒酵母参数对细胞进行电击。本演示中使用 BioRad 基因脉冲仪，设置条件如下：充电电压为 1500 伏，电容为 25 微法，电击后立即接入 200 欧姆的电阻。

加入1毫升冰上预冷的1摩尔山梨醇溶液至小瓶中。使用无菌玻璃巴斯德吸管将小瓶内容物转移至无菌的15毫升离心管中。在30°C条件下静置孵育1.5小时，不摇动。

1.5 小时后，电穿孔细胞即可进行铺板。向四个标记好的含有 100 微克/毫升 Zain 的 YPTS 平板中各加入 5 到 10 颗无菌玻璃珠。取 250 微升电穿孔液进行涂布。

在每块平板上混匀，并水平振荡平板以使细胞均匀分布。将平板静置干燥15分钟，然后通过倒置平板从农杆菌中去除珠子。用黑色塑料膜包裹平板，以防止光敏性Zain降解，并将平板倒置于30摄氏度培养2至3天，直至菌落形成。

挑选12个菌落。通过将克隆划线接种于含有100微克/毫升玉米醇溶蛋白的全新YPDS平板上进行纯化。为制备用于蛋白表达的PPA细胞，从纯化的毕赤酵母菌落中挑取单个菌落，接种于25毫升VMGY培养基中，培养基置于无菌的250毫升锥形瓶内，在30°C摇床培养箱中培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD 600）达到2至6。

当细胞达到合适的 OD 600 时，制备细胞的甘油菌种用于保存。将 800 微升的细胞培养物转移至一个 2 毫升的冻存管中，并加入 200 微升灭菌甘油。将甘油菌种保存于 -80 摄氏度。

此外，将1.5毫升细胞培养物转移至微量离心管中。在室温下以1300 ×g离心1分钟收集细胞。将沉淀物保存在4°C条件下。

这些细胞将用于酵母DNA纯化，通过使用插入片段特异性引物对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以确认目的基因已整合到毕赤酵母基因组中。将剩余的25毫升培养物转移至50毫升Falcon管中，在室温下以3000 ×g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，将管倒置于纸巾上以去除残留的培养基。用20毫升BMMY培养基重悬细胞沉淀，通过涡旋振荡或反复吹打使其悬浮，然后离心。

将细胞悬浮液再次重悬，弃去上清后，用涡旋振荡或吹打将细胞沉淀重悬于BMMY培养基中，调节至OD600为1.0。加入培养基以诱导表达。将培养物转移至一个1升带挡板的锥形瓶中，并用200毫升的透气封口膜覆盖瓶口。

我们强烈推荐使用带挡板的烧瓶，因为它们能向培养物中引入更多的氧气。为在甲醇诱导期间实现高效的蛋白表达，将烧瓶置于培养箱中，在30摄氏度下继续培养。如果培养箱的温度存在波动，必须确保温度不超过30摄氏度。

将温度设定为28摄氏度。在表达开始后的特定时间点，每隔24小时加入灭菌的纯甲醇，使甲醇终浓度为0.5%，以维持诱导。取1毫升培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在1300 ×g 条件下离心2.5分钟。在室温下，将上清液转移至另一个1.5毫升微量离心管中。

将上清液和细胞沉淀在 -80 摄氏度下保存，直至进一步分析。将分析来自不同时间点的样品，以确定诱导后蛋白表达的最佳时间。接下来展示使用 PIA Pastis 作为宿主系统成功表达重组蛋白的一些代表性结果。

该蛋白质印迹图像显示了表达24小时后的四种表达蛋白。免疫印迹所用的抗体为抗小鼠HRP抗体。第二泳道为阴性对照，加样内容为未表达重组蛋白的细胞上清液，这些细胞因转化了空载体而无法表达重组蛋白。

我们刚刚向您展示了如何使用真核宿主PQ.Plus表达重组蛋白。进行该实验时，重要的是要对您的构建体进行测序，以确认目的基因已正确克隆并处于正确的阅读框内，并且在开始实验前准备好所有培养板和试剂。此外，您需要准备足量的线性化质粒，以便在甲醇诱导蛋白表达前获得大量转化子。务必充分洗涤细胞沉淀，以去除任何可能抑制蛋白表达的甘油残留。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。