Name: 施肥爪蟾卵母细胞使用主机传输方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解爪蟾卵母细胞宿主移植受精技术，通过分离供体卵母细胞、孕酮诱导成熟及手术移植至受体雌性体内，实现体外操作卵母细胞的体内受精与胚胎发育研究。

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作者感谢休斯顿实验室成员对本文稿的审阅。本研究由美国国立卫生研究院（GM083999）资助，授予 D.W.H.

1. 卵巢组织的手术切除
<ol class="lalpha">
	<li>准备新鲜批次的卵母细胞培养基（OCM；参见材料部分），根据实验规模准备400–800 mL。调节pH至7.6–7.8，直至酚红变为深红色（约加入5N NaOH六滴）。倒出少量培养基至另一试管中检测pH值，以避免pH电极污染培养基。OCM应储存于18°C，一周内使用完毕。</li>
	<li>选取3–5只雌性个体，将其中一只置于约2L缓冲麻醉液中（参见材料部分）。我们尽量避免使用在手术当天或前一天喂食过的蛙。在蛙逐渐进入麻醉状态的同时，用70%乙醇对手术区域进行消毒，并准备好手术器械。</li>
	<li>将手术器械在250°C的高温珠灭菌器中浸没20秒以完成灭菌。应准备以下器械：手术刀柄（#3）及刀片（#10或#11）、数对Dumont镊子、Bonn虹膜剪（弯型或直型）、Halsey或Olsen-Hegar显微持针器以及缝合线。将灭菌后的器械放置于无菌培养皿内或缝合线包装内部以维持无菌状态。开始前，将针夹持于持针器中并调整至合适方向。我们更偏好使用Olsen-Hegar持针器，因其手柄内置剪刀刃口，可在不更换器械的情况下修剪缝线。</li>
	<li>10分钟后检查是否达到外科麻醉深度。麻醉成功的蛙将停止活动，且对脚趾夹捏或翻转体位无反应。麻醉效果可持续约15分钟，足以完成全部手术操作。穿戴适当的手术防护装备，包括洁净手套（非乳胶）、实验服和外科口罩，具体选择依据个人习惯及所在机构的动物护理指南而定。</li>
	<li>关于无菌技术的说明：蛙类皮肤分泌物含有抗菌肽，通常可降低手术过程中污染的发生率，但仍应尽可能遵循无菌操作原则。可使用手术巾，但部分机构IACUC可能不要求，且实际益处有限。通常采用“尖端接触法”，即操作者的手仅接触器械尖端、缝线材料或切口部位。皮肤切开后可再次将器械放入珠灭菌器中灭菌，并在实验台上保留一个无菌区域用于放置器械（如培养皿或缝合线包装）。不同机构的要求可能存在显著差异，因此请务必遵循所在机构的指导方针，并在实施手术前接受适当培训。</li>
	<li>将蛙从麻醉液中取出，背位仰卧于湿润的手术擦拭布上。注意：可用稀释的聚维酮碘（1:20）或氯己定（0.75%）冲洗清洁皮肤。但应避免使用市售外科擦洗剂、肥皂及70%异丙醇，因其会损伤两栖动物娇嫩的皮肤。</li>
	<li>使用手术刀或小型虹膜剪，在腹部中线下方侧方位置做一小切口（1–1.5 cm）。同一蛙体上的后续切口应交替选择左右两侧，且彼此保持足够间距。切口方向可平行或垂直于中线。</li>
	<li>皮肤与腹肌切口应分两步进行。皮肤切开后，用镊子提起肌肉层及其周围白色的筋膜组织，然后在抬高的肌肉上做切口。使用剪刀垂直向下剪开，尽量一次快速完成切割，以暴露体腔并形成整齐的伤口边缘。若仅切断筋膜，其会回缩，增加缝合难度。提起肌肉有助于避免意外损伤内脏器官。同时，应尽量避免切断肌肉层中可见的淋巴心或血管。可用剪刀适当延长切口长度，以便卵巢组织顺利拉出。</li>
	<li>切开后卵巢应清晰可见。获取卵巢时，用镊子夹住并外翻卵巢组织。在贴近体壁处切除所需量的组织，并将其修剪整齐。切勿将组织重新塞入体腔，以免引发感染或其他并发症。</li>
	<li>立即在解剖显微镜下观察一小块卵巢组织，并剥离数个卵母细胞以检测其质量。卵母细胞应质地坚实，大小和色泽均匀一致。若质量合格，则取出所需量的卵巢组织并缝合切口。通常填满一个90 mm培养皿的量已足够大多数实验使用。若卵母细胞质量存疑，则先行缝合，更换另一只雌性个体重复操作。</li>
	<li>缝合切口时，应先缝合肌肉层和筋膜层。将针从切口外侧数毫米处进针，确保穿透筋膜层。仅缝合肌肉可能导致组织撕裂或缝线松脱。可用镊子辅助从切口对侧下方将针穿出。释放持针器后，从体外重新夹持针体，将缝线拉出，留出数英寸线尾，注意不要将整根线完全拉出。</li>
	<li>采用间断缝合法关闭伤口。我们使用基本的器械打结法制作外科方结（平结）。将缝线长端绕持针器一圈，用其夹住线尾并向自己方向拉过线环并收紧；再绕一圈并同法拉紧，但第二次拉动方向为远离自己；为增强牢固性，可再加第三道结（方向与第一道相同）。剪断缝线，留短小线尾，并在肌肉层距前一针数毫米处打下一针。小切口使用两针即可，大切口需三针。皮肤层缝合同理重复操作。基础缝合技术的视频演示可在YouTube上搜索“instrument tie”找到，虽有多种版本，但基本技术相同。</li>
	<li>用去离子水冲洗雌蛙体表，将其放入盛有冷水（18°C）的恢复桶中。在实验室期间，蛙类饲养于经Amquel处理以去除氯胺的自来水。每隔几分钟轻轻将蛙从水中提起，观察是否有吞咽动作或眼球突出等麻醉复苏迹象。</li>
	<li>注意：获取卵巢组织并非必须进行存活手术，尽管雌蛙在多次手术后仍可持续产出优质卵母细胞。实施存活手术还可减少实验动物使用数量。请务必遵循所在动物护理单位关于脊椎动物存活手术方法、术后护理与监测以及个体允许接受手术次数的相关规定。</li>
</ol>
2. 卵母细胞的培养与去滤泡
<ol class="lalpha">
	<li>手术结束后立即把卵巢分割成小块（约 2 cm2），每 90 mm 培养皿中放入 5–6 块，并用新鲜的 OCM 储存。将卵巢的各个叶切开，展平后切成方形小块。用干净的 OCM 冲洗这些组织块，然后放入培养皿中进行培养。展平并分割卵巢可延长其在体外培养中的存活时间，并使去滤泡操作更加容易。</li>
	<li>将一块卵巢组织转移至盛有 OCM 的小培养皿中，手动去滤泡 300–500 个卵母细胞。使用无菌的火焰抛光移液管转移卵母细胞。我们发现，使用带棉塞的移液管对最大限度减少培养污染至关重要。将卵母细胞以每组 100–150 个的形式储存在 8 mL OCM 中（置于 Falcon 1007 型中号培养皿），并在 18°C 下保存。经过练习后，通常可在 1–2 小时内完成足够数量的去滤泡操作。经胶原酶处理的卵母细胞不适合用于宿主移植，因其无法受精。</li>
	<li>去滤泡方法。我们使用钟表匠镊子（Dumont #4 或 #5，Fine Science Tools）进行去滤泡操作，基本方法参照 Smith et al.（1991）所述。用一只手（主用手）持一对镊子，夹住靠近滤泡与卵巢连接处（即柄部）的成熟 VI 期卵母细胞周围的卵泡膜结缔组织层；用另一对镊子夹住邻近第一对镊子位置的卵巢组织。轻轻横向撕开滤泡层，将卵母细胞从组织中轻柔地分离出来。成功去滤泡的卵母细胞比未去除滤泡层而直接拉出的卵母细胞更柔软，且无可见的血管结构。</li>
	<li>注意：操作镊子时必须保持极轻的夹持力度，仅使镊尖轻微接触即可。初学者常因用力过猛而导致卵母细胞连同完整的滤泡被拉出。应专门保留一对性能良好的镊子用于去滤泡操作，其尖端需精确闭合，且略钝于用于制备 Xenopus 胚胎外植体的镊子（见图 1）。</li>
	<li>我们通常使用孕酮对约 20 个卵母细胞进行成熟能力测试，若成熟率较低（室温下 6–7 小时后成熟率&lt;50%），则中止实验。</li>
	<li>至此，可根据实验需求对卵母细胞进行操作和培养，例如寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸或 mRNA 的显微注射。不同实验室的注射程序可能存在差异，此处不再详述。卵母细胞可在 OCM 中维持培养长达一周，但其健康状态通常会逐渐下降，因此建议在分离后 96 小时内用于移植实验。</li>
	<li>需注意，由于活性染料的使用限制，每只雌性个体最多只能移植五个到六组样本（包括对照组），请据此合理规划实验设计。</li>
</ol>
3. 卵母细胞成熟及潜在宿主雌性动物的刺激
<ol class="lalpha">
	<li>若进行寡核苷酸耗竭的挽救实验，需在寡核苷酸注射后约 24–48 小时注射 mRNA（通常为 50–300 pg RNA）。此时寡核苷酸已降解，不会影响注射的 mRNA。</li>
	<li>在进行移植的前一晚，向含 8 mL OCM 的培养皿中的卵母细胞加入 16 μL 孕酮工作液（1 mM 溶于乙醇），使孕酮终浓度约为 2 μM。于 18°C 培养 10–12 小时，以促进卵母细胞成熟。</li>
	<li>每只雌蛙注射 1000 单位 hCG，共注射 3–5 只，以诱导产卵。实验结果表明，若卵母细胞成熟处理与 hCG 注射时间相近，约在移植入宿主前 12 小时进行（例如晚上 10 点至次日上午 10 点），效果更佳。将雌蛙于室温或 18°C 过夜孵育。</li>
</ol>
4. 卵母细胞的准备与活体染料染色
<ol class="lalpha">
	<li>在移植当天早晨，预留约 45–60 分钟用于准备和执行操作。此时，成熟的卵母细胞可冷冻保存，以便后续分析 mRNA 沉默效率或蛋白表达水平。同时，检查卵母细胞是否发生感染，并确认成熟率良好（&gt;50%）。受感染的卵母细胞无法受精。将活性染料（试剂）解冻，并以最高速度离心 5 分钟。</li>
	<li>通过向卵母细胞培养皿中加入 80 μL 相应的活性染料，对不同实验组进行染色，并在摇床上孵育 15 分钟。在此期间，选择一只宿主雌性并开始麻醉。选择正常缓慢产卵或经轻微挤压即可大量排卵的蛙。宿主所产卵应具有较高质量。避免选用产出卵串或破碎卵的雌性。</li>
	<li>将染色后的卵转移至盛有新鲜 OCM 的大培养皿中，轻轻旋转洗涤片刻，随后放置一旁，待移植时使用。</li>
	<li>准备一支无菌巴斯德吸管，其内径应刚好能容纳一个卵母细胞（约 1.5 mm），用于卵母细胞移植。使用金刚石笔在吸管上划痕后折断，再进行火焰抛光，使边缘光滑，注意避免熔化导致管口封闭。</li>
</ol>
5. 进行卵母细胞移植
<ol class="lalpha">
	<li>卵母细胞移植采用与第一部分所述相同的手术步骤，只是不摘除卵巢，而是用移液管将经处理的卵母细胞引入体腔。理想情况下，移植操作应尽快完成，切口应尽可能小。</li>
	<li>按照第一部分所述方法对宿主雌性进行麻醉，并准备手术器械。按照第一部分所述制作切口。切口可以更小，但必须足够大以容纳移植移液管的管腔（图2A）。</li>
	<li>进行卵母细胞移植时，用镊子夹住并提起一块肌肉和筋膜瓣，使用上述制备好的巴斯德移液管将实验用卵母细胞导入。轻轻旋转盛有卵母细胞的培养皿，使其聚集于中央，尽可能多地吸取卵母细胞。让卵母细胞沉降至移液管末端，以防止吸入过多液体，然后将移液管尖端插入切口，缓慢释放卵母细胞，使其缓缓流入体腔（图2B）。重复此步骤，直至所有卵母细胞均被转移。在整个操作过程中，切勿松开肌肉层，直到开始缝合为止，否则卵母细胞会从切口溢出。</li>
	<li>完成卵母细胞转移后，用镊子夹住切口两侧并将其对合，使卵母细胞沉入体腔内。按照前述方法开始缝合，注意在打第一个结之前始终保持对肌肉和筋膜向上的张力（图2C）。这可防止卵母细胞被挤出，并有助于切口边缘均匀愈合。在肌肉/筋膜层再加一针缝合，然后缝合皮肤。</li>
	<li>用去离子水冲洗雌蛙，将其放入盛有冷却（18°C）且经Amquel处理过的水的恢复桶中。按上述方法监测其从麻醉中恢复的情况。术后她应能正常产卵。</li>
	<li>按照常规方法获取雄性青蛙的睾丸。将睾丸保存在OCM或L15培养基中，待用时取出。我们在进行移植受精实验时更倾向于使用新鲜的睾丸组织。</li>
</ol>
6. 卵母细胞的回收与 体外 受精
<ol class="lalpha">
	<li>腹腔纤毛会将移植的卵子（以及宿主正常的体腔卵）驱动至体腔前部的输卵管开口处。移植后2-3小时即可通过常规挤压回收有色卵子。每隔约半小时可收集一次卵子，直至雌蛙停止产卵。</li>
	<li>在精子悬浮液（约4 mL 1x MMR）中受精4分钟。用0.1x MMR大量冲洗并换液。卵子应正常激活，并在受精后约1.5-2小时开始卵裂。移植的卵子通常比宿主卵子稍晚开始卵裂。</li>
	<li>常规使用半胱氨酸去除胶状膜，并将胚胎分拣至不同的培养皿中。此步骤可根据实验需求在任意阶段进行。通常在4细胞期左右最容易识别不同颜色，而在晚期囊胚阶段最难分辨。将卵子以低密度（&lt; 每个中等培养皿50个）在洁净的0.1x MMR中培养。此后可对胚胎进行常规处理和操作。</li>
	<li>将青蛙送回动物饲养设施，并在接下来的几天内监测是否出现并发症。</li>
	<li>替代受精方法：在高盐缓冲液中产卵
	<ol class="lroman">
		<li>青蛙从麻醉状态恢复后，将其放入约1 L的高盐MMR（1.2x）中。让雌蛙在缓冲液中产卵约4-6小时。挤出剩余卵子，弃去1.2x MMR，将有色卵子分拣至洁净培养皿中，并尽可能去除所有液体。</li>
		<li>用0.3x MMR充分洗涤，然后在最小体积的0.3x MMR/精子悬浮液中受精，直至卵子激活（10分钟）。随后用0.1x MMR淹没并按上述方法培养。若需要大量处于相同发育阶段的卵子，或手动挤卵可能损伤供体卵母细胞时，此方法尤为适用。</li>
</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+in+vitro%3A+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li>
<li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li>
<li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+Xdazl%2C+a+germ+plasm-localized+RNA%2C+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li>
<li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+mother+can+help%3A+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li>
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<li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li>
<li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+and+oocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li>
<li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability%2C+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li>
<li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+beta-catenin+establishes+a+%27dorsal+signal%27+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li>
<li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li>
<li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuck%2C+MV+%22A+comparative+methods+approach+to+the+study+of+oocytes+and+embryos%22">A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos</a>. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).</li>
</ol>

动物实验严格按照爱荷华大学IACUC委员会制定的指南和规定进行。

成功的转移将导致受精及正常的卵裂 &gt; 50%的卵母细胞（图3）。通常，移植的卵母细胞中有30–60%可存活至神经胚阶段。我们通常每个实验组移植75–150个卵母细胞，足以获得用于多种分析（原位杂交、RT-PCR）以及表型观察的胚胎数量。显著增加移植卵母细胞数量似乎并不能明显提高收获率。此外，为确保至少部分胚胎能够通过原肠胚形成阶段，每组至少应移植30个卵母细胞。在本方案所述的浓度和条件下，活体染料通常不会对胚胎产生影响，尽管在某些情况下染料可能具有不良效应。经典研究表明，中性红在强钨光源照射下具有光毒性。最近，Mir和Heasman（2008）报道，若在低温条件下孵育，俾斯麦褐可能对胚胎产生一定毒性作用。采取基本预防措施，例如避免过度染色卵母细胞，以及避免温度和光照的极端条件，即可消除活体染料产生副作用的可能性。
影响该方法成败的最重要因素是供体卵母细胞和受体雌性的质量。目前尚无绝对可靠的方法来判断某一批卵母细胞是否能良好受精。应避免使用萎缩性卵母细胞比例较高的卵巢。此外，我们发现血管化程度较高的卵巢受精效果较差，这可能表明正在发生组织重吸收。卵母细胞应尽可能保持在18°C...

<table><tbody><tr><td colspan="4">溶液与配方：</td></tr><tr><td colspan="4">OCM（卵母细胞培养基；改良自Wylie） &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 1996)</td></tr><tr><td>70% Leibovitz&amp;rsquo;含L-谷氨酰胺的L-15培养基（s L-15 medium）</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA；第五组分）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418-50g</td><td></td></tr><tr><td>1× 青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0781</td><td></td></tr><tr><td>用 5N NaOH 调节 pH 至 7.6–7.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>每周新鲜配制，储存于18&amp;#x00B0;C.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10X MMR（Marc&amp;rsquo;改良型林格液&amp;rsquo;s 溶液；Zuck &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 1998)</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mM HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>调节pH至7.6-7.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4°C 下保存&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">麻醉溶液</td></tr><tr><td>1 g/L 3-氨基苯甲酸乙酯（MS222）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>0.7 g/L 碳酸氢钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>在经Amquel处理的水中溶解</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>每周新鲜配制</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">孕酮储备液</td></tr><tr><td>10 mM 孕酮（Sigma P-0130）溶于100%乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用100%乙醇稀释至1 mM，配制500倍储备液/工作液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20℃保存&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">活体染料（改良自 Heasman） &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 1991)</td></tr><tr><td>蓝色：0.1% 尼罗蓝A</td><td>Aldrich</td><td>121479-5G</td><td></td></tr><tr><td>红色：0.25% 中性红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6634</td><td></td></tr><tr><td>棕色：1% 比斯马克棕</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-2759</td><td></td></tr><tr><td>绿色（80 &amp;mu;l 蓝色 + 80 &amp;mu;l 棕色),</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mauve（80 &amp;mu;l 蓝色 + 80 &amp;mu;红色。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>第六种颜色，橙色（80 &amp;mu;l 红+ 80 &amp;mu;l 棕色）也可使用，但通常难以与棕色区分。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">蓝色、红色和棕色储备液在50 ml离心管中用去离子水配制，室温下摇动孵育20分钟，随后在临床离心机中离心。上清液分装至微量离心管中，于-20 ℃保存。&amp;#x00B0;C.</td></tr></tbody></table>

使用宿主转移法对xenopus oocytes进行受精

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

研究母源遗传分子对脊椎动物早期发育的贡献，常常受限于产生母源效应突变动物所需的时间和高昂成本。此外，在Xenopus和斑马鱼等生物中，许多用于过表达或抑制基因功能的技术难以有效靶向关键的母源信号通路，例如Wnt信号通路。在Xenopus中，通过在体外培养卵母细胞并对其进行基因功能操控，随后使其受精，可在一定程度上缓解这些问题。具体而言，从供体卵巢组织中人工去除滤泡细胞获得卵母细胞，在培养过程中按需进行注射或处理，然后用孕酮刺激以诱导其成熟。接着，将这些卵母细胞植入排卵宿主雌蛙的体腔内，它们会经由宿主的输卵管转运，并获得受精所必需的修饰和胶状包被。随后可将获得的胚胎培养至目标发育阶段，并分析任何实验干预所产生的效应。这种宿主转移方法在揭示早期发育基本机制方面已表现出极高有效性，并提供了其他任何脊椎动物模型系统所不具备的广泛实验可能性。

通过宿主转移法使Xenopus oocytes受精的操作步骤。

使用宿主转移法对Xenopus oocytes进行受精

研究母源遗传分子对脊椎动物早期发育的贡献常常受到所需时间和费用的限制，……

本实验的总体目标是获得来源于体外培养过程中经过操作的卵原细胞（OO细胞）的发育中胚胎。首先从一只雌性个体中分离出供体OO细胞，并在培养条件下对其进行所需的操作。实验的第二步是使用孕酮刺激这些卵细胞成熟，同时向潜在的受体雌性个体注射促性腺激素以诱导其产卵。该实验步骤的第三步是用活体染料对供体细胞进行染色，并准备一只雌性个体作为宿主。实验的最后一步是通过手术将供体细胞转移到宿主体内体腔中，数小时后回收所转移的卵子并进行受精。最终获得由经过实验操作的供体细胞发育而来的正常分裂的胚胎。细胞可以像正常胚胎一样被获取并进行分析。大家好，我是来自爱荷华大学的Doug Houston。今天我们在冷泉港实验室的Xap课程现场，向您展示如何进行宿主转移操作。我们在实验室中采用此方法研究母源基因产物的作用，并确定其在早期胚胎发育中的功能。现在开始操作。在开始手术前，务必确保手术区域已消毒，并准备好新鲜培养基和无菌器械。用持针器以所需方向夹住缝合针。将麻醉后的雌性青蛙仰卧放置在湿润的手术巾上。使用小型虹膜剪，在腹部下部中线侧方的皮肤上做一个一厘米长的切口。不要切到腹肌。用镊子提起肌肉层及周围白色的筋膜。使用虹膜剪迅速地沿直线垂直剪开肌肉。延长切口至一厘米，暴露卵巢。用镊子夹住卵巢，拉出一个叶瓣。用剪刀在体壁水平处将叶瓣剪下。立即将组织放入含有卵母细胞培养基（OCM）的90毫米培养皿中，并在解剖显微镜下评估卵巢质量。可用镊子去除少量滤泡细胞。若滤泡细胞紧实且大小、颜色均一，则从青蛙体内取出所需量的卵巢组织，置于盛有OCM的90毫米培养皿中。缝合切口。将缝合针插入切口外侧几毫米处，确保穿过肌肉和筋膜。使用镊子操作缝合针，注意不要将缝线尾端完全拉出。使用间断缝合方法和外科方结关闭伤口。该技术在随附文本中有详细描述。对皮肤层重复进行缝合。用去离子水冲洗雌性个体，并将其放入装有冷水的恢复桶中。手术完成后立即用剪刀将卵巢分割成小块。切开各个叶瓣，展平后切成边长约两厘米的方块。用干净的培养基冲洗，并使用镊子将五到六块组织转移至新的90毫米OCM培养皿中，以分离单个细胞。首先将其中一块组织转移至盛有培养基的小型培养皿中，并置于解剖显微镜下观察。使用钟表匠镊子手动选取三至500个卵母细胞。用第二把镊子夹住靠近基部的完全成熟第六期卵母细胞周围的结缔组织层。用第一把镊子夹住紧邻卵母细胞的卵巢组织。轻轻拉动卵母细胞以撕开滤泡层。轻柔地将卵母细胞从组织中分离出来。去滤泡的卵母细胞无可见血管，且比具有完整滤泡的卵母细胞更柔软。使用带有棉花塞的火焰抛光移液管，将 100 至 150 个细胞转移至含有 8 毫升 OCM 的 60 毫米培养皿中。将卵母细胞置于培养皿中，于 18 摄氏度保存。随后可根据需要，按照多种实验方案，对卵母细胞进行反义寡核苷酸或 mRNA 的显微注射，并在 18 摄氏度的培养箱中用 OCM 继续培养。在进行移植前一晚分离卵母细胞后96小时内用于移植。将所需卵母细胞与孕酮共同孵育以促使其成熟，向含有卵母细胞的培养基中加入16微升浓度为1毫摩尔的孕酮，使终浓度达到2微摩尔。于同日晚上在18摄氏度条件下孵育10至12小时，对三至五只雌性个体每只注射1000单位人绒毛膜促性腺激素以诱导排卵。在转移当天早晨，将雌性置于室温或18摄氏度下过夜。在解剖显微镜下检查，以确认培养的细胞已完成成熟。吸取活性染料，以超过10,000 ×g的转速离心五分钟。为减少碎片产生的背景干扰，向每组实验卵母细胞中加入80微升适当的活体染料。在摇床上室温孵育15分钟。将染色的卵子转移至盛有新鲜o cm的90毫米培养皿中，轻轻旋转短暂冲洗。制作一支用于转移细胞的移液管。使用金刚石笔在移液管锥形部分下方约两厘米处划痕，然后将其干净地折断。这样可制成一支内径为1.5毫米的移液管，其孔径略大于卵母细胞，足以容纳卵母细胞通过。打磨针尖直至边缘光滑，但不要闭合针尖。卵母细胞移植。手术应尽快进行。在一只麻醉的雌性个体上，按照之前的方法进行切口，该雌性应能产出高质量的卵。切口长度应为刚好能插入移植管内径所需的最小长度。移液器吸取的长度小于一厘米。将实验用卵母细胞的培养皿轻轻晃动，使卵母细胞聚集于培养皿中央。用预先准备好的巴斯德吸管尽可能多地吸取卵母细胞。让卵母细胞沉降至吸管末端，以尽量减少转移至青蛙体内的液体量。使用镊子夹住并提起一块肌肉和筋膜瓣。将移液管的尖端插入切口，缓慢使卵母细胞滴入体腔。重复此操作，直至所有卵母细胞均被转移。 不要松解肌层，以防止卵母细胞从切口溢出。用镊子夹住切口两侧并将其对合，使细胞沉入体腔内。开始缝合肌层和筋膜层，操作同前，并注意保持向上的张力，直至打完第一个结。缝合皮肤。用去离子水冲洗青蛙，并按术前方式使其恢复。手术后两到三小时开始，青蛙应恢复正常产卵。每隔半小时通过常规挤压收集卵子，直至雌性停止产卵，将收集的卵子置于培养皿中。加入4毫升用1倍XMMR配制的新鲜采集的精子悬液，室温孵育4分钟。用室温液体大量冲洗并洗涤卵子。第一点：XMMR在室温下孵育，以允许其活化和切割。可在任意步骤使用半胱氨酸去除明胶代码。随后可根据颜色将转移的胚胎分选至不同的培养皿中，并像正常胚胎一样进行培养。通常，超过三分之二的移植卵在受精后几分钟内会激活，动物极出现明显的皮层收缩。在大多数实验中，超过一半的移植卵会经历正常的第一次卵裂。有时，与宿主卵相比，卵裂可能会延迟约20分钟。30%至60%的移植胚胎会正常发育至原肠胚阶段，并能存活至神经发育阶段之后。移植的胚胎在发育的多天内将保持其活性染料的颜色。未注射的对照细胞来源的胚胎将如预期般表现正常。相比之下，由注射了β-catenin和反义寡核苷酸的卵母细胞发育而来的胚胎则会呈现出集中的外观。我们刚刚向您展示了如何获得在体外培养中经过操作的卵母细胞所发育的胚胎。进行此操作时，重要的是要从健康的、完全成熟的供体卵母细胞开始，并使用卵子质量高的宿主雌性个体。此外，该方法的成功率通常与分离卵母细胞和实施手术的速度相关。因此，可能需要经过一定练习才能获得稳定一致的结果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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