使用宿主转移法对Xenopus oocytes进行受精

本实验的总体目标是获得来源于体外培养过程中经过操作的卵原细胞（OO细胞）的发育中胚胎。首先从一只雌性个体中分离出供体OO细胞，并在培养条件下对其进行所需的操作。实验的第二步是使用孕酮刺激这些卵细胞成熟，同时向潜在的受体雌性个体注射促性腺激素以诱导其产卵。

该实验步骤的第三步是用活体染料对供体细胞进行染色，并准备一只雌性个体作为宿主。实验的最后一步是通过手术将供体细胞转移到宿主体内体腔中，数小时后回收所转移的卵子并进行受精。最终获得由经过实验操作的供体细胞发育而来的正常分裂的胚胎。

细胞可以像正常胚胎一样被获取并进行分析。大家好，我是来自爱荷华大学的Doug Houston。今天我们在冷泉港实验室的Xap课程现场，向您展示如何进行宿主转移操作。

我们在实验室中采用此方法研究母源基因产物的作用，并确定其在早期胚胎发育中的功能。现在开始操作。在开始手术前，务必确保手术区域已消毒，并准备好新鲜培养基和无菌器械。

用持针器以所需方向夹住缝合针。将麻醉后的雌性青蛙仰卧放置在湿润的手术巾上。使用小型虹膜剪，在腹部下部中线侧方的皮肤上做一个一厘米长的切口。

不要切到腹肌。用镊子提起肌肉层及周围白色的筋膜。使用虹膜剪迅速地沿直线垂直剪开肌肉。

延长切口至一厘米，暴露卵巢。用镊子夹住卵巢，拉出一个叶瓣。用剪刀在体壁水平处将叶瓣剪下。

立即将组织放入含有卵母细胞培养基（OCM）的90毫米培养皿中，并在解剖显微镜下评估卵巢质量。可用镊子去除少量滤泡细胞。若滤泡细胞紧实且大小、颜色均一，则从青蛙体内取出所需量的卵巢组织，置于盛有OCM的90毫米培养皿中。

缝合切口。将缝合针插入切口外侧几毫米处，确保穿过肌肉和筋膜。使用镊子操作缝合针，注意不要将缝线尾端完全拉出。

使用间断缝合方法和外科方结关闭伤口。该技术在随附文本中有详细描述。对皮肤层重复进行缝合。

用去离子水冲洗雌性个体，并将其放入装有冷水的恢复桶中。手术完成后立即用剪刀将卵巢分割成小块。切开各个叶瓣，展平后切成边长约两厘米的方块。

用干净的培养基冲洗，并使用镊子将五到六块组织转移至新的90毫米OCM培养皿中，以分离单个细胞。首先将其中一块组织转移至盛有培养基的小型培养皿中，并置于解剖显微镜下观察。

使用钟表匠镊子手动选取三至500个卵母细胞。用第二把镊子夹住靠近基部的完全成熟第六期卵母细胞周围的结缔组织层。用第一把镊子夹住紧邻卵母细胞的卵巢组织。

轻轻拉动卵母细胞以撕开滤泡层。轻柔地将卵母细胞从组织中分离出来。去滤泡的卵母细胞无可见血管，且比具有完整滤泡的卵母细胞更柔软。

使用带有棉花塞的火焰抛光移液管，将 100 至 150 个细胞转移至含有 8 毫升 OCM 的 60 毫米培养皿中。将卵母细胞置于培养皿中，于 18 摄氏度保存。随后可根据需要，按照多种实验方案，对卵母细胞进行反义寡核苷酸或 mRNA 的显微注射，并在 18 摄氏度的培养箱中用 OCM 继续培养。

在进行移植前一晚分离卵母细胞后96小时内用于移植。将所需卵母细胞与孕酮共同孵育以促使其成熟，向含有卵母细胞的培养基中加入16微升浓度为1毫摩尔的孕酮，使终浓度达到2微摩尔。于同日晚上在18摄氏度条件下孵育10至12小时，对三至五只雌性个体每只注射1000单位人绒毛膜促性腺激素以诱导排卵。

在转移当天早晨，将雌性置于室温或18摄氏度下过夜。在解剖显微镜下检查，以确认培养的细胞已完成成熟。吸取活性染料，以超过10,000 ×g的转速离心五分钟。

为减少碎片产生的背景干扰，向每组实验卵母细胞中加入80微升适当的活体染料。在摇床上室温孵育15分钟。将染色的卵子转移至盛有新鲜o cm的90毫米培养皿中，轻轻旋转短暂冲洗。

制作一支用于转移细胞的移液管。使用金刚石笔在移液管锥形部分下方约两厘米处划痕，然后将其干净地折断。这样可制成一支内径为1.5毫米的移液管，其孔径略大于卵母细胞，足以容纳卵母细胞通过。

打磨针尖直至边缘光滑，但不要闭合针尖。卵母细胞移植。手术应尽快进行。

在一只麻醉的雌性个体上，按照之前的方法进行切口，该雌性应能产出高质量的卵。切口长度应为刚好能插入移植管内径所需的最小长度。移液器吸取的长度小于一厘米。

将实验用卵母细胞的培养皿轻轻晃动，使卵母细胞聚集于培养皿中央。用预先准备好的巴斯德吸管尽可能多地吸取卵母细胞。让卵母细胞沉降至吸管末端，以尽量减少转移至青蛙体内的液体量。

使用镊子夹住并提起一块肌肉和筋膜瓣。将移液管的尖端插入切口，缓慢使卵母细胞滴入体腔。重复此操作，直至所有卵母细胞均被转移。

不要松解肌层，以防止卵母细胞从切口溢出。用镊子夹住切口两侧并将其对合，使细胞沉入体腔内。开始缝合肌层和筋膜层，操作同前，并注意保持向上的张力，直至打完第一个结。

缝合皮肤。用去离子水冲洗青蛙，并按术前方式使其恢复。手术后两到三小时开始，青蛙应恢复正常产卵。

每隔半小时通过常规挤压收集卵子，直至雌性停止产卵，将收集的卵子置于培养皿中。加入4毫升用1倍XMMR配制的新鲜采集的精子悬液，室温孵育4分钟。用室温液体大量冲洗并洗涤卵子。

第一点：XMMR在室温下孵育，以允许其活化和切割。可在任意步骤使用半胱氨酸去除明胶代码。随后可根据颜色将转移的胚胎分选至不同的培养皿中，并像正常胚胎一样进行培养。

通常，超过三分之二的移植卵在受精后几分钟内会激活，动物极出现明显的皮层收缩。在大多数实验中，超过一半的移植卵会经历正常的第一次卵裂。有时，与宿主卵相比，卵裂可能会延迟约20分钟。

30%至60%的移植胚胎会正常发育至原肠胚阶段，并能存活至神经发育阶段之后。移植的胚胎在发育的多天内将保持其活性染料的颜色。未注射的对照细胞来源的胚胎将如预期般表现正常。

相比之下，由注射了β-catenin和反义寡核苷酸的卵母细胞发育而来的胚胎则会呈现出集中的外观。我们刚刚向您展示了如何获得在体外培养中经过操作的卵母细胞所发育的胚胎。

进行此操作时，重要的是要从健康的、完全成熟的供体卵母细胞开始，并使用卵子质量高的宿主雌性个体。此外，该方法的成功率通常与分离卵母细胞和实施手术的速度相关。因此，可能需要经过一定练习才能获得稳定一致的结果。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。