2010年11月2日
对施肥的程序爪蟾卵母细胞
该程序的总体目标是获得来自在培养中纵的 OO 位点的发育胚胎。这是通过首先从一只雌性中分离供体 oo 位点并在培养中根据需要对其进行作来实现的。该程序的第二步是使用黄体酮刺激这些细胞成熟,并向潜在的宿主雌性注射促性腺激素以刺激产卵。
该程序的第三步是对具有重要联系的供体细胞进行染色,并准备一只雌性作为宿主。手术的最后一步是通过手术将供体细胞转移到宿主的体腔,几个小时后恢复转移的卵子并使其受精。最终,通常分裂来自实验纵的供体的胚胎。
可以像正常胚胎一样获得和分析细胞。大家好,我是来自爱荷华大学的 Doug Houston。今天,我们在 Cold Spring Harbor Xap 课程中向您展示如何执行主机转移程序。
我们在实验室中使用该程序来研究母体基因产物的作用并确定在早期 zap 发育中的作用。那么让我们开始吧。在开始手术之前,请确保手术区域已经过消毒,并准备好新鲜培养基和无菌工具。
将缝合针按所需方向夹在持针器中。将一只麻醉的雌性青蛙仰卧在潮湿的手术湿巾上。使用小虹膜剪刀,在腹部下部的皮肤上切开一厘米,靠近中线。
不要割伤腹部肌肉。使用镊子提起肌肉层和周围的白色筋膜。使用虹膜剪刀快速快速地直接穿过肌肉。
将切口延长至 1 厘米,露出卵巢。用镊子抓住卵巢并拉出一个叶。用剪刀在体壁水平处修剪叶。
将组织放入含有卵母细胞培养基或 OCM 的 90 毫米培养皿中,立即在解剖显微镜下评估卵巢质量。一些细胞可以用镊子落叶。如果细胞坚硬且大小和颜色均匀,则从青蛙中取出所需量的卵巢组织,并放入 OCM 的 90 毫米培养皿中。
闭合切口。将针头插入切口外侧几毫米处,确保穿过肌肉和筋膜。使用镊子作针头,注意不要将缝合线的尾部完全拉过。
用简单的间断缝合模式闭合伤口,外科医生打方结。该技术在随附的文本中有详细描述。用皮肤层重复缝合。
用去离子水冲洗掉雌性,然后将她放入装满冷水的回收桶中。完成手术后,立即用剪刀细分卵巢。切开单个裂片,将其压平并切成两厘米见方的块。
用干净的培养基冲洗并使用镊子。将 5 到 6 块转移到新鲜的 90 毫米 OCM 培养皿中以分离单个细胞。首先将一块转移到一小块培养基中,然后带到解剖显微镜中。
使用制表师的镊子手动吃掉 3 到 500 个卵母细胞。用第二对镊子抓住原液附近完全生长的第六阶段细胞周围的结缔组织层。用第一对 bps 抓住与卵母细胞相邻的卵巢。
轻轻拉过卵母细胞以撕开卵泡层。轻轻地成功地从组织中梳理出细胞。落叶细胞没有可见的血管,并且比卵泡完整的细胞更松软。
使用棉塞火焰抛光移液器将 100 至 150 个细胞的组转移到含有 8 毫升 OCM 的 60 毫米培养皿中。将卵母细胞储存在 18 摄氏度的培养皿中。现在,可以根据任意数量的方案根据需要用反义寡核苷酸或 mRNA 显微注射卵母细胞,然后在 18 摄氏度培养箱中的 OCM 中培养。
在进行转移前一天晚上,在分离后 96 小时内使用卵母细胞进行转移。将必要的细胞与黄体酮一起孵育,使其在 16 微升 1 毫摩尔黄体酮中成熟到含有细胞的培养基中,最终浓度为 2 微摩尔。当晚在 18 摄氏度下孵育 10 至 12 小时,每只青蛙向 3 至 5 只雌性注射 1000 单位的人绒毛膜促性腺激素,以诱导产卵。
在转移的早晨,将雌性在室温或 18 摄氏度下过夜。在解剖镜下检查以确保培养的细胞已经成熟。去掉重要的染料,以大于 10, 000 Gs 的离心力旋转 5 分钟。
为了减少碎片的背景,向每个卵母细胞实验组中添加 80 微升适当的活性染料。在摇床上室温孵育 15 分钟。将有色鸡蛋转移到一个 90 毫米的新鲜 o cm 培养皿中,短暂旋转以清洗。
制作用于转移细胞的移液器。使用金刚石铅笔在锥形部分下方约 2 厘米处划线,然后将其干净利落地折断。这应该创建一个孔径为 1.5 毫米的移液器,其大小刚好足以容纳卵母细胞火灾。
抛光尖端,直到边缘光滑,不要关闭尖端。卵母细胞移植。应尽快进行手术。
像以前一样,在产下优质卵子的麻醉雌性身上做一个切口。该切口应是刚好适合转移孔所需的最小长度。移液管小于 1 厘米。
旋转实验卵母细胞培养皿,将它们收集在培养皿的中心。使用准备好的牧场移液器吸取尽可能多的水。让卵母细胞沉降到移液管的末端,以尽量减少转移到青蛙身上的液体量。
使用镊子抓住并抬高一块肌肉和筋膜。将移液器的尖端插入切口,慢慢让细胞滴入体腔。重复该过程,直到所有卵母细胞都已转移。
不要松开肌肉层,以防止卵母细胞从切口溢出。用镊子抓住切口的两侧并将它们放在一起,让细胞沉淀到体腔中。像以前一样开始缝合肌肉和筋膜层,注意保持向上的张力,直到第一个结打结。
缝合皮肤。用去离子水冲洗青蛙,让她像以前一样恢复。青蛙应在手术后两到三个小时开始正常产卵。
每半小时通过正常挤压来回收鸡蛋,直到雌性停止产卵到一盘收集的鸡蛋。在一个 XMMR 中加入 4 毫升新鲜采集的精子悬浮液,并在室温下孵育 4 分钟。在室温下冲洗并彻底冲洗鸡蛋。
第 1 点 XMMR 在室温下孵育以允许激活和切割。在任何位置使用半胱氨酸去除果冻代码。然后,可以根据颜色将移植的胚胎分类到单独的培养皿中,并像正常胚胎一样培养。
通常,超过三分之二的转移卵子会在受精后几分钟内激活,在动物极点显示出强烈的皮质收缩。在大多数实验中,超过一半的转移卵子将经历正常的第一次卵裂。有时,相对于我们手中的宿主卵,卵裂会延迟 20 分钟左右。
30% 到 60% 的移植胚胎正常进入胃光状态,并将存活到神经阶段。移植的胚胎将在发育多天后保持其重要的染料颜色。来自 unin 注射的对照细胞的胚胎将如预期的那样看起来正常。
相比之下。例如,来自注射 β catine 和反义寡核苷酸的卵母细胞衍生的胚胎将具有集中的外观。我们刚刚向您展示了如何从培养物中作的细胞中获得胚胎。
执行此程序时,重要的是从健康、完全成熟的供体卵母细胞开始,并使用具有高质量卵子的宿主雌性。此外,该方法的成功往往与您分离卵母细胞和进行手术的速度相关。因此,在获得一致的结果之前,可能需要一些练习。
就是这样。感谢您的观看,祝您的实验好运。
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本程序概述了使用宿主转移法对非洲爪蛙卵母细胞进行受精。它包括分离供体卵母细胞,刺激成熟,并将其转移到宿主中进行受精。
The host transfer method for fertilizing Xenopus oocytes enables precise manipulation and analysis of maternal gene function in vertebrate development, overcoming limitations of traditional genetic models. This approach supports mechanistic de-risking and target validation by allowing direct assessment of gene perturbations in early embryogenesis. Its flexibility and efficiency make it a valuable tool for discovery-stage R&D and translational research pipelines.
This method integrates into the early discovery and target validation stages, bridging in vitro manipulation with in vivo developmental analysis in Xenopus embryos.