Name: 组织者和动物极植从非洲爪蟾胚胎和装配一个细胞粘附实验的剖析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: 学习从非洲爪蟾胚胎中解剖动物极和背唇组织，并在钙镁条件下进行细胞粘附实验。该方法可用于研究细胞迁移、形态变化及粘附分子在发育生物学中的作用。

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准备黏附腔（注射/解剖前一天）
黏附实验腔室
如果使用的是传统复式显微镜（光学系统位于载物台上方），则需要制作一个低高度的黏附腔，步骤如下。如果使用倒置光学显微镜，则可直接使用“NUNC Lab-Tek 带腔室的盖玻片”，&nbsp;并跳过步骤 #1 - 2。
<ol>
<li>将一个“按压密封硅绝缘体”贴附到 40 × 24 mm 的盖玻片上。在洁净台面上用力按压绝缘体使其牢固粘附于盖玻片，并从另一侧检查，确保绝缘体完全贴合且无任何气泡。 </li>
<li>可选步骤：将粘附室放入带有 Whatman 滤纸的玻璃培养皿中，使用干热循环高压灭菌法进行灭菌，随后冷却至室温。</li>
</ol>
包被腔室
<ol>
<li>使用经 Sigmacoat 处理的黄色枪头，将 200 µL 工作浓度的钙黏蛋白溶液（10 mg/mL）或纤连蛋白溶液（20 mg/mL）滴加至灭菌后的黏附腔中央。室温孵育 4 小时。 </li>
<li>吸出钙黏蛋白或纤连蛋白溶液，并转移至 1.5 mL 离心管中。该溶液可在接下来的两周内重复使用。 </li>
<li>加入 500 µL 含 4% BSA 的 1× MBS-H 溶液以封闭黏附腔。室温孵育 1 小时。 </li>
<li>吸除 BSA 溶液，用 500 µL 1× MBS-H 溶液洗涤黏附腔两次。第二次洗涤后，吸出大部分 MBS-H 溶液（不要完全吸干），并将黏附腔置于密封容器中，4 °C 保存。该黏附腔可在接下来的 2–3 天内使用。</li>
</ol>
动物帽外植体的解剖与解离
<ol>
<li>将已注射的胚胎孵育在0.1x MBS-H中，该溶液由经高压灭菌的1x MBS-H稀释而来，因为未经高压灭菌的培养基有时可能携带少量微生物，会干扰动物帽细胞的解离。 </li>
<li>使用60 mm培养皿制备1x Barth's琼脂糖平板和CMF-MBS琼脂糖平板，数量至少与样本数相同。向1x Barth's平板中加入高压灭菌的1x MBS-H。对于CMF-MBS平板，每皿加入10 ml CMF-MBS。 </li>
<li>当胚胎发育至8.5期时，在1x Barth's平板中开始分离动物帽组织。每个样本通常取10–15个外植体即可满足实验需求。 </li>
<li>将动物帽外植体转移至CMF-MBS平板中，在45–60分钟内孵育，直至外植体完全解离。每隔15分钟轻轻振荡一次，有助于促进解离过程。</li>
</ol>
细胞黏附实验
<ol>
<li>接种细胞：向上述步骤中准备好的黏附腔内加入500 ml的1× MBS-H，&nbsp;粘附实验小室的制备及小室包被。使用P200移液器配合经sigma涂层处理并剪去末端的黄色吸头，将解离的动物帽细胞从CMF-MBS培养板转移至粘附实验小室中。 </li>
<li>可选： 如果可能，小心吸去约三分之二至一半的培养基，避免细胞暴露于空气中。加入大致等量的新鲜 MBS-H，以确保培养基中含有足够的 Ca2+ 和 Mg2+. </li>
<li>室温孵育45至90分钟。期间定期观察细胞，以确认其是否已贴附于培养容器底部表面。 </li>
<li>现在可以在显微镜下拍摄细胞的图像。 </li>
<li>将粘附室置于网格载玻片上，使粘附室的一个角与网格载玻片的角对齐。在多个不同的网格中计数并记录粘附细胞的数量。 </li>
<li>将1升MBS-H倒入一个大型塑料桶中（例如Tupperware等）。轻轻将黏附载玻片室置于桶底，在50–60 rpm的低速条件下于旋转摇床上旋转5分钟。 </li>
<li>将粘附室放回网格载玻片上，使粘附室的同一角落与网格载玻片的相应角落对齐，操作方式与之前一致&nbsp;在本节第5步，即细胞黏附实验中，计数在清洗前已计数过的同一网格中仍保持附着的细胞数量。计算清洗后仍保持附着的细胞百分比。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>改良巴思法&amp;rsquo;s 培养基：1 L 配方：5.14 g NaCl，75 mg KCl，0.2 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0.2 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;38 g HEPES（游离酸），用 NaOH 调节 pH 至 7.4，高压灭菌。</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>这是 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;无MBS-H版本。500 mL配方：2.57 g NaCl，37.5 mg KCl，0.1 g NaHCO₃&lt;sub&gt;3/3&gt; 1.19 g HEPES（游离酸），用 NaOH 调节 pH 至 7.4，高压灭菌。</td></tr><tr><td>1% 琼脂糖/1x Barth 溶液&amp;rsquo;平板</td><td></td><td></td><td></td><td>与样本数量相同</td></tr><tr><td>1% 琼脂糖/CMF-MBS 平板</td><td></td><td></td><td></td><td>与样本数量相同</td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白/Fc嵌合体 </td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>将0.1 mg固体E-cadherin溶于100 μl含40%甘油的1× MBS-H缓冲液中，配制成100倍母液（1.0 mg/ml）。储存于 &amp;#8211;20 &amp;deg;C. 使用前，用1× MBS-H缓冲液进行100倍稀释，配制成10 μg/ml的工作液。每个样品需要200 μl该工作液。</td></tr><tr><td>纤连蛋白，0.1% 溶液 </td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>该预配溶液可用作50倍浓缩液。用1x MBS-H稀释50倍以制备20 &amp;mu;g/mL 工作液，使用前配制。你需要 200 &amp;mu;每份样品使用该工作溶液 L。我不建议使用固态纤连蛋白，因为在制备储存液时，很难将其溶解至 0.1% 的浓度。尽管预制成的 0.1% 溶液成本较高，但更有利于获得稳定一致的实验结果。</td></tr><tr><td>4% BSA /MBS-H</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>BSA：分子生物学级第V组分</td></tr><tr><td>Sigmacoated 黄色吸头 </td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 号盖玻片</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm × 24 mm 或 60 mm × 24 mm</td></tr><tr><td>按压密封硅绝缘体</td><td>工具</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2.5 mm 深度 × 20 mm 直径</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek 培养皿式载玻片</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 个孔/载玻片</td></tr><tr><td>网格载玻片</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>或用于细胞计数的Finder网格</td></tr></tbody></table>

非洲爪蟾胚胎的组织者与动物极外植体解剖及细胞黏附实验的构建

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

本视频演示了从非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中制备组织中心区和动物极外植体的技术，包括使用眉刀——一种由眉毛制成的专用解剖工具。同时提供了黏附力检测实验的方案，用于检测组织中心区或动物极细胞表面是否存在对正常发育至关重要的关键黏附分子。

大家好，我叫Sochi Agata。我是加州大学欧文分校发育与细胞生物学系Ken Cho博士实验室的一名博士后科学家。今天我将演示从非洲爪蟾XUS胚胎中分离动物帽外胚层以及进行黏附实验的方法。该方法可用于研究从非洲爪蟾胚胎中分离的组织来源细胞的细胞黏附特性和细胞形态。本实验步骤包括从非洲爪蟾胚胎中解剖特定组织，将其置于无钙无镁的培养基中进行细胞解离，随后将解离后的细胞转移至含有钙和镁的环境，并接种于包被有细胞黏附分子的载玻片表面。通过该方法，可观察并研究所分离细胞的生物学行为，包括细胞迁移及黏附特性。好的，整个胚胎解剖和黏附实验操作中，我首先使用特制的进口工具。这是一份不含钙镁离子的1×缓冲液，含有1%琼脂糖并已喷洒处理。而就在这里，另一份1×缓冲液，含有1%琼脂糖并已喷洒处理，用于胚胎的解剖操作。然后这是一种解剖用的特殊解剖工具，不同于镊子。这被称为眉刀，名字很奇怪，但实际上它确实是用从你脸上拔下的眉毛制成的，然后将其粘在移液管的尖端上。而这里的另一种工具称为毛丝环，即用毛发在移液器尖端绕成一个环状结构。这次实验我没有使用这种工具，但有些人更倾向于使用毛丝环而非眼球刀来进行黏附实验。我使用的是硅橡胶绝缘材料，将其粘附在载玻片顶部，以构建黏附反应实验腔室。首先从胚胎中取出卵壳膜。此部分即为卵壳膜。然后解剖动物极上皮。这是动物实验项目，您不需要它。将胚胎翻转过来，您会看到这里清晰的背唇结构。它非常漂亮。然后取眼球刀，贴住背唇一侧，另一侧也贴住，接着在背唇下方将这块组织切下。此组织块包含我的诱导组织及周围的真皮。将其翻转，从内部诱导组织中剥离出腹部部分。好的。没关系，我可能破坏了真皮部分，但这并不重要。所以没问题。右侧的这块是诱导组织者测量样本。我刚刚移到了培养皿较干净的一侧。右侧的组织者小块是胚胎组织者部分，这是完整的胚胎。现在你可以看到组织者小块的大小究竟如何。这可用于提取表达组织者区域的某些因子，或在文库中制备组织者cDNA，或研究迁移的外胚层组织中的发育谱系。在解剖动物极帽之前，必须先确定正确的发育时期。我们使用第8期的囊胚胚胎。现在我们在此视图中可以看到处于三个不同发育阶段的胚胎。左侧的两个胚胎为七期囊胚，中间的两个胚胎为八期，而右侧的两个胚胎则接近九期晚期囊胚。我们倾向于观察并使用第8期胚胎，因为此时在动物极可以清楚地看到每个囊胚之间的明显差异。第8期胚胎在细胞大小和解剖操作便利性之间提供了良好的平衡。相比之下，第7期胚胎的动物极细胞过大且数量过少，而第9期胚胎的细胞则过小，且动物极外胚层组织比第8期更薄，不利于操作。这样你可能无法获得足够数量的细胞。首先，将镊子贴到胚胎的一侧，将绒毛膜从胚胎上取出。这是绒毛膜。然后从胚胎中解剖出动物极的中心部分。好的，这是一个非常理想的组织块。左侧是已解剖出的动物帽外胚层，右侧是胚胎的其余部分。这个组织块的用途是，例如，在胚胎发育早期将某些物质（如 Porto 基因构建体）注射到胚胎的动物极，随后在后期将该组织块分离出来，用于 Porto 检测，例如反向检测实验。现在，我将通过移植并转移组织者（organizer）x 外胚层（explan）来研究细胞黏附实验。为此，我需要用含钙离子的机制三培养基对组织者 x 外胚层进行解离。因此，我正在将诱导组织块从这个普通的培养皿转移到无钙镁的培养基培养皿中。但在操作时，即使你的手法非常熟练，使用普通的移液器仍有可能对胚胎造成损伤。因此，我通常的做法是使用P200移液器配合黄色枪头进行操作。这个黄色吸头先前已用特定的化学编码进行处理，以防止细胞黏附在吸头内壁上。此外，我用剪刀将吸头尖端剪去一部分，使吸头变得钝化并具有较大的孔径，从而最大限度地降低损伤DX外植体的风险。好的，现在你在视野中看到的是两个组织者外植体，我将把这两个组织块从当前的常规培养皿转移到无钙机制的培养基培养皿中。缓慢吸出这些组织块，并转移至无钙镁培养基中。现在来看一下，这是它们在初始状态下的形态，而接下来它们将几乎解离至单细胞水平。目前，这些有序的外植体已置于无钙镁培养基中，我将在此无钙镁培养基中孵育一小时，以使其充分解离为单细胞，以便进行后续的细胞形态或行为研究。经过一小时的孵育后，细胞——即这些有序的外植体，应已实现解离。它们状况良好。现在请观察显微镜及其视野下的图像。是的，看起来非常清晰。现在，我正在研究细胞在成像载玻片腔室中的行为，该腔室通过钙黏蛋白（cadherin）、INE 或其他类型的细胞黏附分子捕获细胞，从而构建一个细胞黏附成像腔室。我将这块载玻片和硅橡胶绝缘垫圈取出，直接将硅橡胶绝缘垫圈放置在载玻片表面，并用力按压，确保其在整个圆形区域边缘完全贴合。然后从另一侧检查，确认已完全密封，以防止液体从上方泄漏。在此沙室中，加入含有细胞黏附蛋白（如钙黏蛋白或纤连蛋白）的200 µL细胞悬液滴。随后，用500 µL的4% BSA封闭该腔室。然后，将BSA替换为常规的1× PBS缓冲液或培养基。现在看起来，这里有一个准备好的腔室用于转运细胞。我再次取这个腔室，将一支P 200移液器装上剪断的、涂有sigma胶的黄色枪头，从无钙镁的培养基中吸取细胞至该腔室中，该腔室内的培养基含有钙和镁。现在，好的，我正在使用P 200将解离的胚胎组织X点进行转移。首先，安装这个 P200 枪头，缓慢吸取细胞，并可非常轻柔地反复吹打。尽管如此，我仍在尽量将细胞均匀分散开，以确保形成单细胞状态。然后，将成像小室置于视野中央，在成像小室内将细胞均匀铺开。现在，细胞已铺展在包被过的表面上。让我们来看一下，在较高的管道中，细胞呈现这种形态。好的，在将细胞接种到黏附腔室后两到三个小时，我使用这台显微镜对这个腔室中的细胞进行计数。通常情况下，当你试图研究来自组织者外植体的器官细胞的黏附特性时，需要将细胞置于包被好的载玻片表面孵育两到三个小时。然后，你可以在显微镜下对载玻片上的细胞进行计数以确定洗涤效果。为了洗去未贴壁或松散附着的细胞，只需将载玻片放入含有大量缓冲液的缓冲桶中的赫西装置内，以非常温和的速度（约50 RPM）开始振荡，该速度即为所需速度，并等待五分钟。五分钟后，小心取出该黏附室，避免暴露黏附室内的细胞。因此，应小心地以这种方式取出，然后擦去多余的缓冲液，再次在显微镜下观察，以计算有多少百分比的细胞仍附着在包被的表面上。洗涤后，将该黏附室放回原位，以确保观察的是黏附室中完全相同的区域。现在开始计数。在此屏幕上，我展示了两种不同类型的细胞，以及第三种相同类型的细胞黏附分子。这两种细胞在同一底物上表现出完全不同的黏附特性。在相同的黏附性细胞黏附蛋白的顶端。我们还可以利用这种从外胚层分离的细胞，通过时间推移成像来研究它们的聚集或迁移行为。

dissection-organizer-animal-pole-explants-from-xenopus-laevis-embryos

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

组织者和动物极植从非洲爪蟾胚胎和装配一个细胞粘附实验的剖析

该实验用于评估信号分子（此处为骨形态发生蛋白7，BMP7）对联合轴突重新定向的能力。将胚胎背侧脊髓组织外植体与分泌候选生长因子的COS细胞聚集体相邻培养，通过免疫组织化学方法观察外植体内重新定向生长的联合轴突。...

检测可扩散信号分子重定向胚胎脊髓联合轴突能力的实验方法

为了确定组织是否已决定分化命运，将过表达基因产物的动物极帽组织移植到正在发育的Xenopus laevis胚胎的侧 flank...

利用动物帽移植（ACT）实验进行组织决定研究 Xenopus laevis

活细胞成像与胚胎上皮细胞的定量分析 Xenopus laevis

非洲爪蟾胚胎外胚层已成为研究细胞极性的理想模型。本文描述了一种检测方法，用于评估外胚层细胞中荧光蛋白的亚细胞分布。该实验方案将有助于解答与信号通路空间调控相关的问题。...

响应 Wnt 信号通路在 Xenopus 外胚层中荧光蛋白的极性转位

培养表达荧光融合蛋白的分离非洲爪蟾（Xenopus...

Xenopus laevis 的神经外植体培养

Xenopus laevis 为研究视网膜细胞在原代细胞培养中的细胞命运决定及单个视网膜细胞的生理功能提供了一个理想的模型系统。本文介绍了一种分离视网膜组织并建立原代细胞培养的方法，该培养物可用于钙活性成像及后续分析 原位...

Xenopus laevis 胚胎视网膜组织的分离、培养与分析

本方案描述了如何从胚胎中分离出迁徙前的颅神经嵴（NC） Xenopus laevis 神经胚。这些外植体可接种于纤维连接蛋白上进行培养...

解剖 Xenopus laevis 神经嵴用于 体外 组织块培养或 体内 移植

本文提供了一套简单的方法，用于分析荧光标记配体在非洲爪蟾（Xenopus）中的分泌与扩散。该方法可用于检测其他蛋白质对配体分布的调控能力，并支持开展有助于揭示形态发生素梯度调控机制的实验。...

使用非洲爪蟾（Xenopus laesvis）的共聚焦分析研究Wnt与Shh形态发生素梯度的调控因子

在Xenopus胚胎中，囊胚腔顶壁的细胞具有多能性，可被诱导分化为多种组织。本文介绍了利用两栖类囊胚腔顶壁外植体作为实验体系，研究早期神经发育关键体内和体外特征的实验方案。...

干细胞样 非洲爪蟾 用于研究早期神经发育特征的胚胎外植体 体外 和 在体 内

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

我们描述了一种简单的方法，用于从非洲爪蟾（Xenopus...

利用非洲爪蟾胚胎细胞生成黏液纤毛上皮类器官：培养、传代与高分辨率活体成像

学习从非洲爪蟾胚胎中解剖动物极和背唇组织，并在钙镁条件下进行细胞粘附实验。该方法可用于研究细胞迁移、形态变化及粘附分子在发育生物学中的作用。

非洲爪蟾胚胎的组织者与动物极外植体解剖及细胞黏附实验的构建

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