应用停流动力学方法研究DNA修复蛋白作用机制

本文介绍了两种停流法，用于测定Msh2-Msh6 DNA错配修复蛋白的反应动力学。Msh2-Msh6可识别DNA中的碱基错配，并通过ATP驱动的反应启动修复过程。第一种方法通过检测DNA中GT错配位点旁邻近的2-氨基嘌呤碱基荧光强度的增加，来测定Msh2-Msh6与DNA的结合情况。将反应物在停流仪中混合后，随时间监测荧光变化，以确定反应速率常数。

第二种方法利用荧光磷酸盐结合蛋白报告系统来检测Msh2-Msh6的TPA活性。反应物在停流装置中混合，并随时间进行监测。通过测定TP水解和磷酸盐释放的速率常数，所得的动力学数据揭示了Msh2-Msh6在DNA错配修复中的作用机制。

大家好，我是诺亚·比罗（Noah Biro），来自卫斯理大学分子生物学与生物化学系的莫尼（MONI）实验室。嘿，我是DJ J，同样来自卫斯理大学的曼氏（Man's）实验室。我是克里斯·德赛特（Chris Dset），也来自JI'S实验室。

今天，我们将向您展示两种基于荧光的检测方法，用于监测毫秒时间尺度下的反应动力学。我们在实验室中使用这些方法来研究DA修复蛋白Match2（Meh6）如何识别DNA中的错配碱基对并启动修复过程。现在，让我们开始吧。

在开始此实验步骤之前，必须备齐所需的蛋白质和DNA试剂。获取已预先在大肠杆菌中过表达，并通过离子交换层析和亲和层析纯化的s visier mush two mush six蛋白。为制备DNA试剂，购买经荧光核苷酸类似物氨基嘌呤修饰的单链DNA，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化单链，再将其退火，以生成含有两个相邻氨基嘌呤并毗邻GT错配位点的错配双链DNA。

同样，使用未修饰的单链 DNA 制备未标记的 DNA。本实验所用的 DNA 序列可在本方案的书面部分找到。在整个实验过程中，应使用高纯度的化学试剂，以尽量减少荧光杂质，确保实验的高严谨性。

同时，将所有储备溶液通过0.2微米滤膜过滤，以去除可能堵塞停流仪的颗粒物。为DNA结合实验做准备时，每份样品配制400微升的终体积，此体积足以进行约10次动力学检测。样品应置于冰上保存。

为了保持蛋白质活性，需在DNA结合缓冲液中将DNA样品配制为0.12微摩尔，将mush two mush six样品配制为0.8微摩尔的浓度。在停流装置中等体积混合后，最终浓度将分别为0.06微摩尔DNA和0.4微摩尔mush two mush six。

停流装置利用驱动电机同时快速将反应溶液从驱动注射器推入混合装置中。混合后的溶液随后流入观察池，以进行数据采集并准备仪器。首先，确保计算机和控制器处于关闭状态。

然后打开循环水浴以冷却光源，点燃光源。将单色仪设定至所需的激发波长，即 315 纳米。对于 2-氨基嘌呤，将狭缝宽度（SL width）设定至所需值。

在光电倍增管（PMT）处插入一个截止波长为350纳米的滤光片，以收集两种氨基嘌呤的荧光信号。打开控制器和计算机。然后启动循环水浴。

这将填充驱动注射器周围的水夹套，以在实验过程中维持所需的温度恒定。最后，在P-M-T-H-V控制菜单下执行停止流动程序。设置光电倍增管（PMT）电压，该电压最初可调以调节PMT灵敏度，但之后必须保持恒定。

实验过程中，测量暗电流以校正背景电噪声。接着，清洗停流驱动注射器和观察池。将样品加载阀置于加载位置。

用去离子过滤水填充一支1毫升注射器。将该注射器连接到驱动注射器下方的加样口，推动水在两个注射器之间流动。每个注射器重复此操作两次。

驱动注射器以用于实验。然后用水填充驱动注射器，以清洗观察池。将样品加载阀切换至点火位置。

使用调节注射器推进装置命令，降低推进板，将水推过观察池并进入出口管路。注意不要将推进注射器的推杆推至末端。最后，升起推进板，并将阀门切换至加载位置。

用反应缓冲液洗涤一次，并排空注射器。开始DNA结合实验时，将每个样品从管中转移至新的1毫升注射器中。将每个注射器连接至加样口，并将溶液推入驱动注射器中。

通过在两个注射器之间手动推动溶液并间歇性暂停，以去除任何气泡。然后降低驱动板，直至其接触驱动注射器的顶部。进行数据采集时，打开设置时间通道窗口。

选择数据分析的数据采集通道模式以及要采集的迹线数量。输入数据采集时间，期间将采集1000个数据点。接着，将阀门设置为点火位置，然后点击采集数据按钮。

此操作将启动混合物二、混合物六与DNA的混合，随后反应进入观测阶段。持续监测来自两个氨基嘌呤的细胞荧光发射信号。至少收集五条动力学曲线以获得高质量的数据集，并在实验结束后保存文件。

打开每个数据文件，对多条动力学曲线进行平均。然后保存平均后的数据文件，并将其导出至绘图软件进行分析。最后，关闭光源，用大量水彻底清洗注射器和观察池。

然后关闭其余设备，仅保留循环水浴。循环水浴继续开启15分钟，以冷却光源。Msh2-Msh6与错配DNA结合的动力学数据最符合单指数函数，得到的结合速率较快，约为10⁷ M⁻¹s⁻¹；类似的停流实验获得了Msh2-Msh6错配DNA复合物的解离速率，其解离过程非常缓慢，为0.01至0.02 s⁻¹。

这些结果直接测量了Mush2-Mush6复合物在DNA修复反应中结合错配碱基对的速度和亲和力。接下来，将进行停流实验以测定Mush2-Mush6的ATP酶活性。

在此检测的预研究状态条件下，为尽量减少背景磷酸盐水平，在试剂制备的所有阶段（包括蛋白质和DNA纯化）都必须避免使用玻璃制品。实验中采用从大肠杆菌（E. coli）中纯化并用MDCC荧光团标记的磷酸盐结合蛋白（phosphate binding protein，PBP）作为报告分子，用于检测ATP水解后释放的磷酸盐。MDCC-PBP是检测预研究状态下ATP水解及磷酸盐释放动力学的可靠报告分子。该分子可快速、高亲和力地结合游离磷酸盐，从而引起MDCC荧光信号显著增强。

准备一个含有4 µM mush、2 µM 6蛋白并添加或不添加6 µM错配DNA的样品。另准备一个样品，其中含有1 mM新鲜溶解的HEP以及20 µM M-D-C-C-P-V-P，用于清除任何污染的磷酸盐。向样品中加入嘌呤、核苷、磷酸化酶和7-甲基鸟苷，冰上孵育至少20分钟。

按照前述方法准备停流装置。此外，使用嘌呤、核苷、磷酸基和七甲基鸟嘌呤清除驱动注射器中的磷酸盐污染物，孵育20分钟。将激发波长设为425纳米，并在光电倍增管检测M-D-C-C-P-B-P荧光时使用450纳米截止滤光片。

按照前述方法将样品加入驱动注射器中。设置数据采集参数，然后点击采集数据，以混合Mush2Mush6与TP，并使用MDCC-PBP监测Mush2Mush6介导的磷酸盐释放以及偶联的MDCC-PPi荧光随时间的变化。至少采集五条动力学曲线，以获得高质量的数据集，并对多条动力学曲线进行平均处理，按前述方法保存文件并导出数据用于分析。为确定磷酸盐浓度与MDCC-PPi荧光之间的线性关系，需先制备标准曲线：在停流条件下，于相同实验条件下将MDCC-PPi与不同浓度的磷酸盐混合。

然后，绘制最大 M-D-C-C-P-P-P 荧光强度与各磷酸盐浓度的关系曲线以生成标准曲线，并利用斜率确定 mush two mush six 反应中的磷酸盐浓度。绘制磷酸盐浓度随时间变化的曲线，并将数据拟合为指数函数和线性函数。该函数描述了预稳态 ATP 水解和磷酸盐释放的爆发相，随后进入反应的线性稳态阶段。动力学数据显示，mush two mush six 能够水解 ATP，并在首次催化循环中以每秒 1.4 个分子的速率快速释放磷酸盐。

随后，反应进入一个缓慢步骤，使后续的转化次数受限，稳态催化常数降低至每秒0.2，比之前慢七倍。然而，当MutS同源物6（msh6）与错配DNA结合时，ATP水解及磷酸根释放的爆发相被抑制。这些结果直接表明，在结合错配碱基对后，DNA错配识别蛋白MutS同源物6（msh6）会转变为ATP结合状态。

这一转换是DNA修复反应中的关键步骤。我们刚刚向您展示了如何使用停流仪实时测量反应的动力学。此类测量已加深了我们对MASH2、MASH6作用机制以及DNA错配修复过程的理解。

进行此类实验时，重要的是要记住使用高纯度的试剂，包括高纯度的 DNA 和蛋白质，并需特别注意避免 ATP 检测中的磷酸盐污染。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。